全 文 ：第３３卷第８期
２０１４年８月
水 产 科 学
ＦＩＳＨＥＲＩＥＳ　ＳＣＩＥＮＣＥ
Ｖｏｌ．３３Ｎｏ．８
Ａｕｇ．２０１４
大叶藻原生质体的分离和培养
崔翠菊，刘延岭，王　娜，张立楠，田萍萍，李晓捷，罗世菊，李　言
（山东东方海洋科技股份有限公司，国家海藻工程技术研究中心，
山东省海藻遗传育种与栽培技术重点实验室，山东烟台　２６４００３）
摘　要：研究了水解酶的组合、酶液ｐＨ值和酶解时间等因素对大叶藻原生质体分离制备的影响，确定
了适合无菌大叶藻原生质体分离的最佳试验条件。试验结果显示，１．０ｇ生长状态良好的大叶藻无菌
幼苗叶片，在５ｍＬ含２．０％纤维素酶、０．５％果胶酶和０．５ｍｏｌ／Ｌ山梨醇混合酶液的灭菌海水中，ｐＨ
４．０，１７℃黑暗条件下轻摇酶解１６ｈ，可获得较多的大叶藻原生质体，产量达３．９０×１０６个／ｇ。用中性
红染色鉴定表明，原生质体存活率为８５．０％。
关键词：大叶藻；无菌苗；原生质体；分离和培养
中图分类号：Ｓ９６８．４ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００３－１１１１（２０１４）０８－０５０８－０４
收稿日期：２０１３－０９－２５；　修回日期：２０１４－０３－１０．
基金项目：山东省科技发展计划项目（２０１０ＧＳＦ１０６１２）；国家工程技术研究中心再建项目（２０１１ＦＵ１２５Ｚ１１）．
作者简介：崔翠菊（１９８４－），女，工程师；研究方向：藻类遗传育种．Ｅ－ｍａｉｌ：ｃｕｉｃｕｉｊｕ＠１６３．ｃｏｍ．
　　原生质体为除去细胞壁、由细胞膜包围的裸露
细胞。自Ｔａｋｅｂｅ等［１］首次利用烟草叶片分离原生
质体并获得再生植株以来，原生质体的分离和培养
迅速发展。原生质体在物理、化学或自发性作用
下，可进行细胞的融合而获得体细胞杂种。体细胞
杂交技术给不同种、属乃至科间植物的遗传物质交
流提供了可行的途径和方法，克服了杂交不亲和导
致的生殖屏障。这项技术可以获得传统育种方法
无法培育出的杂种新植株［２］。目前，原生质体的分
离培养研究已不再局限于陆生植物，一些海草和藻
类如大洋聚伞藻（Ｐｏｓｉｄｏｎｉａ　ｏｃｅａｎｉｃａ）、海神草（Ｃｙ－
ｍｏｄｏｃｅａ　ｎｏｄｏｓａ）、海带（Ｓａｃｃｈａｒｉｎａ　ｊａｐｏｎｉｃａ）、长
心卡帕藻（Ｋａｐｐａｐｈｙｃｕｓ　ａｌｖａｒｅｚｉ）和角叉菜（Ｃｈｏｎ－
ｄｒｕｓ　ｏｃｅｌｌａｔｕ）等的原生质体分离和培养取得了一定
的进展［３－７］。大叶藻（Ｚｏｓｔｅｒａ　ｍａｒｉｎａ）营沉水生活，
能在海洋中完成开花、结果和萌发等整个生活史，
广泛分布于近海生态系统中，在海洋生态环境保护
中起重要作用［８－９］。近年来对大叶藻的生物特性，
种子萌发等的研究也逐渐成为热点之一，但未见大
叶藻原生质体分离培养的报道。笔者分离得到了
大叶藻原生质体，探索了大叶藻原生质体的培养方
法，为研究大叶藻耐盐机制、生物技术育种、体细胞
遗传学等提供参考。
１　材料与方法
１．１　材料
大叶藻种子于２０１２年７—８月采自山东烟台雨
岱山海区，保存于本实验室，于１０℃海水中充气
保存。
１．２　方法
１．２．１　无菌苗培养体系的建立
先将大叶藻种子用７５％的乙醇溶液处理１０
ｍｉｎ，再用１．５％ ＫＩ溶液消毒１０ｍｉｎ［１０］。将消毒后
的种子分别接种于盐度为５的无菌抽滤海水中，放
入恒温光照培养箱内，促进种子的萌发，箱内温度
１５℃，湿度６０％，光照度３０００ｌｘ（Ｌ∶Ｄ＝１２∶１２）。
种子萌发后，转接到正常盐度的灭菌海水中，１５℃、
湿度６０％、光照度３０００ｌｘ（Ｌ∶Ｄ＝１２∶１２）条件下
培养至成苗。
１．２．２　原生质体的分离和纯化
待大叶藻无菌苗叶长至２～４ｃｍ时，取大叶藻
无菌新鲜嫩绿的幼叶，在培养皿中剪成０．２ｃｍ２的块。
置于酶解液中，材料∶酶解液为１∶５（ｍ／Ｖ），酶解液
与材料混匀后置于１０ｍＬ的细胞培养瓶中，１７℃、
１２０ｒ／ｍｉｎ，黑暗下酶解。酶解液为不同质量浓度的
纤维素酶＋不同质量浓度的果胶酶＋０．５ｍｏｌ／Ｌ山
梨醇，用无菌海水配制。酶解后的混合液用３００目
DOI:10.16378/j.cnki.1003-1111.2014.08.002
的筛绢过滤，收集的滤液以８００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，
收集原生质体沉淀并用洗液（细胞—原生质体清洗
溶液＋０．５ｍｏｌ／Ｌ甘露醇）进行悬浮，再用纯化液
（细胞—原生质体清洗溶液＋２５％蔗糖）进行悬浮
离心，１０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ。将界面处的原生质体
层转移至新的离心管中，再用洗液洗涤一次，获得纯
化后的原生质体。每个处理设３个重复。
１．２．３　原生质体产量和活力测定
原生质体产量用血球计数板记数。原生质体
活力用１ｇ／Ｌ的中性红染色检测，活的原生质体被
染成粉红色，失去活性的原生质体不能染色。以染色
的原生质体占观察的原生质体总数的百分数表示。
１．２．４　原生质体的培养
将原生质体稀释到１．０×１０５个／ｍＬ，以改良的
ＭＳ培养基［ＭＳ＋２，４－Ｄ（２ｍｇ／Ｌ）］在９６孔板中浅
层培养，水温１５℃，８ｈ光照，１６ｈ黑暗，每３ｄ换液
一次，每日观察原生质体的分裂和生长状况。
１．２．５　数据处理
试验数据用ＳＰＳＳ软件进行统计分析，用Ｄｕｎ－
ｃａｎ’ｓ法作差异显著性分析。
２　结果与分析
２．１　大叶藻无菌苗培养
无菌处理的大叶藻种子经３～５ｄ培养即完全
萌发。种子萌发７ｄ后，转接到正常盐度的无菌抽
滤海水中培养，７～１４ｄ后子叶长度可长至２～
３ｃｍ。本试验能够快速打破大叶藻种子的休眠，快
速萌发，低盐促萌发耗时短，效率高。培养过程只需
用正常的灭菌海水即可，不需用额外的培养基和生长
调节剂，节约成本，操作简便。培养的大叶藻幼苗可
直接用于原生质体的分离，勿需再进行消毒处理，避
免了消毒对试验材料的伤害和后续试验的影响。
２．２　不同质量浓度的酶组合对原生质体分离的
影响
通过预试验，最终选择纤维素酶和果胶酶的组
合，并设置了几种酶组合，试验结果见表１。
表１　不同质量浓度的酶组合对大叶藻无菌苗原生质体分离的影响
试验
编号
纤维素酶质
量浓度／ｇ·Ｌ－１
果胶酶质量
浓度／ｇ·Ｌ－１
产量
×１０６个／ｇ
活力
％
Ａ１ １０　 ５　 ２．９３±０．０５ａ ７５．０３±０．２５ａ
Ａ２ １０　 １０　 ２．５５±０．０７ｂ ６５．５７±０．７１ｂ
Ａ３ ２０　 ５　 ３．９６±０．０４ｃ ８６．４３±０．７８ｃ
Ａ４ ２０　 １０　 ３．４１±０．０２ｄ ７９．６７±０．８５ｄ
Ａ５ ３０　 ５　 ３．５７±０．０７ｅ ８０．５０±０．７２ｄ
Ａ６ ３０　 １０　 ３．４５±０．０３ｄｅ　７５．５０±０．６１ａ
　　注：标有不同小写字母的平均值间差异显著（Ｐ＜０．０５）．表２、
表３同．
由表１可知，在果胶酶质量浓度不变的条件
下，随着纤维素酶质量浓度的增加，原生质体产量
和活力有较大变化，果胶酶质量浓度为５ｇ／Ｌ、纤维
素酶质量浓度为２０ｇ／Ｌ时，原生质体的产量和活力
最大，与其他组差异显著。当纤维素酶质量浓度不
变时，随着果胶酶质量浓度的升高，原生质体的产
量减少，活力降低，除纤维素酶质量浓度为３０ｇ／Ｌ
时，产量差异不显著（Ａ５，Ａ６），与其他试验组差异显
著。综合考虑酶的比例与原生质体的产量、活力关
系，最终选择纤维素酶质量浓度为２０ｇ／Ｌ、果胶酶
质量浓度为５ｇ／Ｌ为最佳酶组合。后续试验均以此
酶组合为基础进行试验条件的优化。
２．３酶解时间对原生质体分离的影响
在纤维素酶质量浓度为２０ｇ／Ｌ和果胶酶质量
浓度为５ｇ／Ｌ的酶解液中，大叶藻叶片经８、１２、１６、
２４、３０、４８ｈ的酶解处理，观察原生质体，计数并测
定原生质体的活力，结果见表２。
表２　不同酶解时间对大叶藻无菌苗原生质体分离的影响
试验组
酶解时间
ｈ
产量
×１０６个／ｇ
活力
％
Ｂ１ ８　 ２．９１±０．０３ａ ８５．９１±０．４６ａ
Ｂ２ １２　 ３．３０±０．０８ｂ ８３．３１±０．７２ｂ
Ｂ３ １６　 ３．８４±０．０７ｃ ８５．６５±０．５３ａ
Ｂ４ ２４　 ３．７２±０．０４ｃ ８４．７６±０．３３ａｂ
Ｂ５ ３０　 ３．３２±０．０４ｂ ８０．１６±０．８７ｃ
Ｂ６ ４８　 ３．０８±０．０３ｄ ７６．５９±０．６３ｄ
由表２可知，随着酶解时间的延长，大叶藻原
生质体的产量逐渐增加，当酶解时间超过１６ｈ后，
产量又缓慢下降。虽然１６ｈ的产量最高，但１６ｈ
和２４ｈ的产量差异不显著（Ｂ３ 和Ｂ４），其他各组间
差异显著。８、１６、２４ｈ检测原生质体的活力，均差
异不显著，随着酶解时间的延长，活力率也逐渐下
降。结合原生质体产量和活力，确定１６ｈ为最适酶
解时间。
２．４　酶解液ｐＨ值对原生质体分离的影响
在纤维素酶质量浓度为２０ｇ／Ｌ、果胶酶质量浓
度为５ｇ／Ｌ的酶解液中，酶解液的ｐＨ 为３、４、５、６
时，酶解大叶藻叶片１６ｈ，观察原生质体，计数和测
定其活力，结果见表３。
９０５第８期 崔翠菊等：大叶藻原生质体的分离和培养
表３　不同的酶解液ｐＨ值对大叶藻无菌苗原生质体分离的影响
试验组 ｐＨ
产量
×１０６个／ｇ
活力
％
Ｃ１ ３　 ２．９１±０．０３ａ ８２．５０±０．７０ａ
Ｃ２ ４　 ３．９０±０．０２ｂ ８５．０４±０．３７ｂ
Ｃ３ ５　 ３．６０±０．０２ｃ ８３．３０±０．５３ａ
Ｃ４ ６　 ３．２８±０．０７ｄ ８１．０７±０．８９ｃ
表３显示，不同ｐＨ值的酶解液对大叶藻原生
质体的产量影响较大，在４种条件下，原生质体产
量均有显著差异。ｐＨ　４～５时，原生质体的产量和
活力均较高，其中ｐＨ为４时，原生质体产量最高，
当ｐＨ＞４时，原生质体产量下降。
２．５　原生质体的培养
添加了２，４－Ｄ 的 ＭＳ液体培养基可有效地诱
导大叶藻原生质体分裂。培养３ｄ后，部分原生质
体体积变大；培养５～６ｄ原生质体中间出现凹陷
（图１ａ）；８～１０ｄ时可见２～３次分裂（图１ｂ）；１１～
１５ｄ时出现多细胞团（图１ｃ）。但继续培养时，细胞
团越来越松散，部分细胞破裂，未观察到愈伤组织
的出现（图１ｄ）。
图１　大叶藻原生质体的培养
Ａ：培养５ｄ的原生质体（×４００）；ｂ：培养８ｄ的原生质体（×
４００）；Ｃ：培养１２ｄ的原生质体细胞团（×４００）；ｄ：培养２５ｄ变松
散的原生质体细胞团 （×４００）．
３　讨论
影响原生质体分离和培养的因素很多，如试验
材料的状态、裂解酶的种类及质量浓度组合、酶解
时间与ｐＨ、酶解温度与渗透压、培养基类型等［１１］。
在制备原生质体前，对试验材料的无菌预处理非常
重要。大洋聚伞藻原生质体制备前先用７０％酒精
浸洗，再用１．５％的次氯酸钠表面消毒１５ｍｉｎ，最后
用含抗生素的无菌海水浸洗才能得到无菌的材料，
在其他材料的消毒处理中也通常使用７０％酒精、抗
生素和次氯酸钠等进行预处理［３－５］。本试验建立了
一种简便快速培养大叶藻无菌苗的体系，对种子进
行表面消毒后，在低盐海水中进行促萌发，之后转
至正常盐度海水进行培养，比低温打破种子休眠的
方法更快速，效率高，勿需用ＭＳ等液体培养基或添
加植物生长素等，节约了成本，简化了操作步骤，能
在短时间内可培养大量的无菌苗［１２－１３］。利用无菌
苗制备原生质体在烟草［１４］、棉花［１５］、草木樨状黄
芪［１６］等陆生植物已取得较好的效果，但在海草和海
洋藻类中还未见用无菌苗进行原生质体分离的相
关报道。本试验利用培养得到的大叶藻无菌苗成功
分离到原生质体，避免了试验材料前期的消毒处理过
程，不伤害组织，保证叶片内细胞处于最佳状态。
由预试验得知，在制备大叶藻原生质体过程
中，裂解酶的种类和质量浓度组合、酶解时间和ｐＨ
对原生质体的产量和活力影响较大，所以本研究着
重对这三个因素进行了梯度试验并得到了最优分
离条件。其中裂解酶质量浓度对原生质体的产量
影响较大，酶解液质量浓度增大时，产量和活力均
增加，但当酶质量浓度过高时，原生质体产量和活
力反而降低（表１）；酶解时间越长，产量虽然也先升
后降，但活力一直呈下降趋势，说明酶解时间长使
游离出来的原生质体细胞破裂而死亡；酶解液ｐＨ
值过高或过低原生质体的产量都下降，但对活力的
影响差异不显著（表３）。本试验的结果与海带、海
神草和小麦等原生质体分离条件优化试验中的结
论一致［４－５，１７］。
Ｍａｓａｙｏｓｈｉ等［１８］研究表 明，红 纤 维 虾 海 藻
（Ｐｈｙｌｌｏｓｐａｄｉｘ　ｉｗａｔｅｎｓｉｓ）与大叶藻同属于眼子菜
科，但从其叶片中分离得到的原生质体并非全是球
形，从成熟叶片中分离到的原生质体非球形且细胞
膜凹陷，而由幼嫩的材料中分离到的原生质体具有
圆滑细胞膜的球形体。Ｋｕｏ等［１９］认为，这种细胞膜
的凹陷是一些海草和盐土植物细胞适应高盐环境
的一种复杂结构，随着植株的发育，这种细胞膜结
构越来越明显，这也释明了在幼嫩的材料中分离的
原生质体呈球形的结果。本试验制备得到的原生
质体均为球形，未见非球形的细胞，可能与本试验
选用的无菌苗为幼嫩的材料有关。大叶藻成熟叶
片制备的原生质体是否也会出现非球形有待进一
步试验。
大叶藻原生质体在后期培养过程中分裂率极
０１５ 水　产　科　学 第３３卷
低，只有极少数原生质体出现凹陷并分裂出少量细
胞团，这可能与海草的特殊细胞结构有关［３－４］。目
前尚未有海草原生质体培养成功的相关报道。试
验得到的无菌大叶藻幼苗原生质体，为大叶藻的原
生质体融合、植株再生、遗传转化和新品种培育等
奠定了基础，有关大叶藻原生质体培养条件还需更
深入的研究。
参考文献：
［１］ Ｔａｋｅｂｅ　Ｉ，Ｏｔｓｕｋｉ　Ｙ，Ａｏｋｉ　Ｓ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｏｂａｃｃｏ　ｍｅ－
ｓｏｐｈｙｌ　ｃｅｌｓ　ｉｎ　ｉｎｔａｃｔ　ａｎｄ　ａｃｔｉｖｅ　ｓｔａｔｅ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌ
Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，１９６８，９（１）：１１５－１２４．
［２］ Ｋａｏ　Ｋ　Ｎ，Ｃｏｎｓｔａｂｅｌ　Ｆ，Ｍｉｃｈａｙｌｕｋ　Ｍ　Ｒ，ｅｔ　ａｌ．Ｐｌａｎｔ
ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ　ｆｕｓｉｏｎ　ａｎｄ　ｇｒｏｗｔｈ　ｏｆ　ｉｎｔｅｒｇｅｎｅｒｉｃ　ｈｙｂｒｉｄ
ｃｅｌｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔａ，１９７４，１２０（３）：２１５－２２７．
［３］ Ｂａｌｅｓｔｒｉ　Ｅ，Ｃｉｎｅｌｉ　Ｆ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ
ｓｅａｇｒａｓｓ　Ｐｏｓｉｄｏｎｉａ　ｏｃｅａｎｉｃａ （Ｌ．）Ｄｅｌｉｌｅ［Ｊ］．Ａｑｕａｔｉｃ
Ｂｏｔａｎｙ，１９９２，４３（３）：３０１－３０４．
［４］ Ｂａｌｅｓｔｒｉ　Ｅ，Ｃｉｎｅｌｉ　Ｆ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｅｌ　ｗａｌ　ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ
ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ　ｆｒｏｍ　Ｐｏｓｉｄｏｎｉａ　ｏｃｅａｎｉｃａ　ａｎｄ　Ｃｙｍｏｄｏｃｅａ　ｎｏ－
ｄｏｓａ［Ｊ］．Ａｑｕａｔｉｃ　Ｂｏｔａｎｙ，２００１，７０（３）：２３７－２４２．
［５］ Ｉｎｏｕｅ　Ａ，Ｋａｇａｙａ　Ｍ，Ｏｊｉｍａ　Ｔ．Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｒｏｔｏ－
ｐｌａｓｔｓ　ｆｒｏｍ　Ｌａｍｉｎａｒｉａ　ｊａｐｏｎｉｃａ　ｕｓｉｎｇ　ｎａｔｉｖｅ　ａｎｄ　ｒｅ－
ｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ａｂａｌｏｎｅ　ａｌｇｉｎａｔｅ　ｌｙａｓｅｓ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｐ－
ｐｌｉｅｄ　Ｐｈｙｃｏｌｏｇｙ，２００８，２０（５）：６３３－６４０．
［６］ Ｒｏｎｅｌｉｅ　Ｃ，Ａｕｇｕｓｔｏ　Ｅ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ　ｆｒｏｍ
ｔｉｓｓｕｅ　ｆｒａｇｍｅｎｔｓ　ｏｆ　Ｐｈｉｌｉｐｐｉｎｅ　ｃｕｌｔｉｖａｒｓ　ｏｆ　Ｋａｐｐａｐｈｙ－
ｃｕｓ　ａｌｖａｒｅｚｉｉ（Ｓｏｌｉｅｒｉａｃｅａｅ，Ｒｈｏｄｏｐｈｙｔａ）［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｐｈｙｃｏｌｏｇｙ，２００５，１７（１）：１５－２２．
［７］ 张全启．角叉菜（Ｃｈｏｎｄｒｕｓ　ｏｃｅｌｌａｔｕｓ　Ｈｏｌｍ）原生质体
分离、培养与再生的研究［Ｊ］．青岛海洋大学学报，
１９９２，２１（１）：５２－６２．
［８］ 张壮志，潘金华，江鑫，等．大叶藻的特征、特性和利用
［Ｊ］．特种经济动植物，２０１０，１３（７）：３３－３４．
［９］ Ｓｈｉｎ　Ｈ，Ｃｈｏｉ　Ｈ　Ｋ．Ｔａｘｏｎｏｍｙ　ａｎｄ　ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｚｏｓｔｅｒａ
（Ｚｏｓｔｅｒａｃｅａｅ）ｉｎ　ｅａｓｔｅｒｎ　Ａｓｉａ，ｗｉｔｈ　ｓｐｅｃｉａｌ　ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　ｔｏ
Ｋｏｒｅａ［Ｊ］．Ａｑｕａｔｉｃ　Ｂｏｔａｎｙ，１９９８，６０（１）：４９－６６．
［１０］刘延岭，李晓捷，崔翠菊，等．大叶藻组织培养中外植
体消毒方法的研究［Ｊ］．农学学报，２０１３，３（３）：５４－５６．
［１１］马晖玲，李玉珠．植物原生质体培养的影响因素分析
［Ｊ］．甘肃农业大学学报，２００７，４２（４）：３８－４３．
［１２］蒋刚强，王瑜，兰海燕，等．水浮莲无菌苗的获得及其
培养体系的优化［Ｊ］．水生生物学报，２００８，３２（５）：
６１５－６２１．
［１３］吴志刚，宋明，王志敏，等．番茄组织培养中无菌苗培
养条件的优化［Ｊ］．中国农学通报，２００６，２２（４）：
３３５－３３８．
［１４］陈名红，陈学军，陈毅坚，等．黄花烟草叶肉原生质体
培养研究［Ｊ］．种子，２００８，２７（４）：２４－２７．
［１５］汪静儿，孙玉强，燕树锋，等．陆地棉原生质体培养与
植株再生技术研究［Ｊ］．棉花学报，２００８，２０（６）：
４０３－４０７．
［１６］张改娜，贾敬芬．草木樨状黄芪 Ａ４转化系原生质体培
养研究［Ｊ］．河南农业科学，２００９（８）：４６－５０．
［１７］张小红，闵东红，邵景侠．小麦愈伤组织诱导及原生质
体的分离与纯化［Ｊ］．中国农学通报，２０１０，２６（２１）：
４９－５３．
［１８］Ａｒａｉ　Ｍ，Ｐａｒｋ　Ｊ　Ｙ，Ｎｏｍｕｒａ　Ｋ，ｅｔ　ａｌ．Ｓｅａｗａｔｅｒ－ｒｅｓｉｓｔ－
ａｎｔ，ｎｏｎ－ｓｐｈｅｒｉｃａｌ　ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ　ｆｒｏｍ　ｓｅａｇｒａｓｓ　ｌｅａｖｅｓ
［Ｊ］．Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉａ　Ｐｌａｎｔａｒｕｍ，１９９１，８３（４）：５５１－５５９．
［１９］Ｋｕｏ　Ｊ，Ａｉｏｉ　Ｋ，Ｉｉｚｕｍｉ　Ｈ．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ　ｌｅａｆ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄ
ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ　ｉｎ　Ｐｈｙｌｌｏｓｐａｄｉｘ　ｉｗａｔｅｎｓｉｓ　Ｍａｋｉｎｏ
ａｎｄ　Ｐｈｙｌｌｏｓｐａｄｉｘ　ｊａｐｏｎｉｃｕｓ　Ｍａｋｉｎｏ（Ｚｏｓｔｅｒａｃｅａｅ）［Ｊ］．
Ａｑｕａｔｉｃ　Ｂｏｔａｎｙ，１９８８，３０（３）：１６９－１８７．
Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ　ｉｎ　Ｅｅｌｇｒａｓｓ　Ｚｏｓｔｅｒａ　ｍａｒｉｎａ
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ｅｎｚｙｍｅ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ　ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　２％ｃｅｌｕｌａｓｅ，０．５％ｐｅｃｔｉｎａｓｅ　ａｎｄ　０．５ｍｏｌ／Ｌ　ｓｏｒｂｉｔｏｌ　ｕｎｄｅｒ　ｄａｒｋ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｏｆ
ｐＨ　４．０ｆｏｒ　１６ｈｏｕｒｓ　ａｔ　１７℃．Ｎｅｕｔｒａｌ　ｒｅｄ　ｓｔａｉｎｉｎｇ　ｒｅｖｅａｌｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅｓｅ　ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ　ｈａｄ　ｖｉａｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　８５．０％，
ａｎｄ　ｔｈｅ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｗｅｒｅ　ａｌｓｏ　ｄｉｓｃｕｓｓｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｅｅｌｇｒａｓｓ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｅｅｌｇｒａｓｓ　Ｚｏｓｔｅｒａ　ｍａｒｉｎａ；ａｓｅｐｔｉｃ　ｓｅｅｄｌｉｎｇ；ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ；ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｕｌｔｕｒｅ
１１５第８期 崔翠菊等：大叶藻原生质体的分离和培养