全 文 ：欧芹素乙拮抗 TNF促进牛脑微血管内皮细胞与单核细胞粘附作用
储智勇　龚纯贵　芮耀诚
摘要　目的:研究肿瘤坏死因子 ( TN F)对体外培养的牛脑微血管内皮细胞 ( BCM EC)与单核细胞 ( MNCs)粘附的影响及欧芹
素乙 ( IM P)的拮抗作用。 方法:通过测定 M NCs中髓过氧化物酶活性的方法 ,对粘附于 BCM EC单层上的 M NCs进行定量。
结果: TN F在 5～ 250 U /ml时呈剂量依赖性地诱导 BCM EC与 MNCs的粘附 , TN F浓度为 100 U /ml时促粘附达最大值
( 61. 0% )。 TN F与内皮细胞共育 1 h,即可明显促进粘附作用 ( 55. 7% ) , 2 h时达最大刺激效应 ( 62. 8% )。 IM P在浓度为 0. 1～
10. 0μmo l /L时 ,呈剂量依赖性地拮抗 TN F诱导的粘附作用 ,在 10. 0μmo l /L时抑制率达 90. 3%。结论: IM P具有抑制由
TN F诱导的 BCMEC与 MN Cs粘附的作用。
关键词　肿瘤坏死因子 ; 内皮细胞 ;单核细胞 ; 细胞粘连 ; 欧芹素乙
中国图书资料分类法分类号　 R 543. 5
Inhibitory ef fects of imperatorin on TNF induced adhesion reaction of
BCMEC with monocytes
Chu Zhiyo ng, Gong Chungui, Rui Yaocheng ( Department o f Pharmacolog y, Colleg e of Phar-
macy, Seco nd M ili tary Medical Univ ersity, Shanghai, 200433)
Abstract　 Objective: To study inhibi to ry ef fect of impera to rin( IM P) on tumor necro sis factor ( TN F) in-
duced adhesion reaction of cultured bovine cerebromicrovascula r endo thelia l cell ( BCMEC) wi th monocy tes
in vitro.Methods: The assay w as ba sed on the measurement o f the myeloperoxidase activ ity in monocy tes
that had adhered to BCM EC layers. Results: At concentrations f rom 5 to 250 U /ml , TN F w as shown to in-
duce adhesion reaction of cultured BCM EC w ith monocytes in a do se-dependent manner. The ef fect o f TN F
reached maximum ( 61. 0% ) at 100 U /ml. Af ter 1 h incuba tion of BCMEC, addi tion of TN F significantly
stimula ted the adhesion reaction o f BCMEC with monocy tes ( 55. 7% ) . Af ter 2 h incubation the ef fect
reached maximum ( 62. 8% ) , then the ef fect slight ly decreased. At concentrations f rom 0. 1 to 10. 0μmol /L,
IM P was found to antagonize induced adhesion reaction. It s maximal ra te o f inhibition w as 90. 3% a t 10. 0
μmo l /L. Conclusion: IM P may decrease the TN F induced adhesion reaction of BCMEC w ith monocy tes.
Key words　 tumo r necrosis facto r; endo thelial cells; monocy tes; cell adhesion; imperatorin
⒇
　 动脉内皮损伤、中膜平滑肌细胞移行至内膜并
大量增殖 ,以及血小板和单核细胞与血管内皮细胞
粘附及浸润在动脉粥样硬化形成早期起着关键性作
用 [1, 2 ]。 欧芹素乙 ( imperatorin, IM P)为中药欧前胡
和白芷根部的有效成分 ,具有抗炎作用 ,还可抑制花
生四烯酸诱导的血小板聚集 [3 ]及肿瘤坏死因子
( TN F)诱导的牛脑微血管平滑肌细胞增殖 [4 ] ,但
IM P 对 TN F 诱导 的 牛脑 微 血管 内 皮细 胞
( BCMEC)与单核细胞的粘附的影响尚未见报道。本
研究用体外培养的 BCMEC,观察 TN F对内皮细胞
与单核细胞粘附的影响及 IM P的拮抗作用。
1　材料和方法
1. 1　药品和试剂　 IM P由本院植物化学教研室提
供 ; TN F由日本 Dainippon制药公司 Sohmura博士
赠送 ; M EM培养基为美国 Gibco公司产品 ;胶原酶
Ⅱ型为美国 Sigma公司产品 ;溴化十六碳烷基三甲
铵 ( h exadecy l t rimethyl ammonium bromide,
HT AB)为上海化学试剂站分装厂进口分装 ;邻 -联
茴香胺盐酸盐 ( o-dianisidine dihydrochloride, DD)
为北京化工厂产品。
1. 2　 BCMEC　细胞培养按孙笃新等 [5 ]方法进行。
细胞长成致密单层后 ,倒置相差显微镜下可见细胞
呈卵石样外观 ,Ⅷ因子相关抗原免疫荧光染色阳性 ,
·156· 第 二 军 医 大 学 学 报Acad J Sec Mi l M ed Univ　 1998 Ap r; 19( 2)∶ 156～ 158
⒇ 国家自然科学基金资助项目 ,批准号 39670832
作者单位　第二军医大学药学院药理学教研室 ,上海 ,
200433
储智勇 ,男 , 1969年 4月生 , 96级博士生 ,助教
表明为脑血管内皮细胞。
1. 3　牛血单核细胞的分离　新鲜小牛全血参照
Bath等 [ 6]建立的方法分离 ,得到混有一定量淋巴细
胞的单核细胞 ,用 Hanks液调整细胞数为 5× 106
个 /ml ,备用。
1. 4　测定 TN F对内皮细胞与单核细胞粘附的影
响　生长致密的 3～ 5代 BCMEC经消化制成细胞
悬液 ,以 1. 5× 104个 /孔接种于 96孔培养板 ,置
37℃ , 5% CO2孵箱中孵育 48 h,长成致密单层。加
入不同剂量 TN F( 5, 50, 100及 250 U /ml) ,继续孵
育不同时间 ( 1, 2, 4及 6 h)后取出。加入单核细胞悬
液前 ,用预热的 Hanks液小心冲洗内皮细胞 4次 ,
然后每孔加入单核细胞悬液 100μl( 5× 105个 /孔 ) ,
置 37℃ , 5% CO2孵箱中孵育 30 min。小心吸出未
结合的单核细胞 ,并用预热的含 0. 1% BSA的磷酸
盐缓冲液轻轻荡洗 ,用 Ba th等 [6 ]建立的测定髓过氧
化物酶 ( M PO )活性的方法对结合的单核细胞进行
定量测定。
1. 5　 MPO活性的测定　改良 Bath等 [6 ]测定 M PO
活性的方法。 每孔加入 1% HTAB溶液 50μl,置
37℃ , 5% CO2孵箱中孵育 45 min。取出 ,每孔加入
预热至 37℃的 DD+ H2O2反应液 250μl,置孵箱中
孵育 20 min,酶联仪测定 450 nm处光密度。内皮细
胞、淋巴细胞不含 MPO,因此所测出的 MPO活性
将反映粘附的单核细胞。粘附细胞 MPO活性用实
测的 MPO活性与每孔加入单核细胞 M PO总活性
的百分比来表示。
1. 6　测定 IM P对粘附作用的影响　在加入 TN F
刺激之前 ,加入不同浓度的 IM P与内皮细胞单层共
育一段时间 ,其他操作同上 ,测定 MPO活性 ,计算
药物抑制率。
抑制率 (% )= TNF粘附率 -药物粘附率
TNF粘附率 -基础粘附率× 100%
2　结　果
2. 1　 TN F刺激内皮细胞与单核细胞粘附的时效曲
线　研究结果显示 , TN F 100 U /m l刺激 1 h即可
明显诱导内皮细胞与单核细胞粘附 ,粘附率为 ( 55. 7
± 2. 5)% , 2 h的粘附率达高峰 ( 62. 8± 1. 4)% 。 4,
6 h的粘附率则分别为 ( 61. 5± 3. 5)%以及 ( 61. 1±
4. 0)% ,与 2 h相比略有下降 ,但差别不明显。 为便
于实验 ,选择 4 h作为 TN F刺激时间 (表 1)。
2. 2　 TN F刺激粘附的量效曲线　 TNF刺激内皮
细胞单层 4 h后 ,加入单核细胞。结果表明 , TN F浓
度为 0, 5, 50, 100, 250 U /ml时 ,内皮细胞与单核
表 1　 TNF刺激粘附的时效曲线
Tab 1　 Time-dependent eff ect of TNF induced mono-
cytes adhesion to endothelial cells in vitro
(n= 3, x-±s )
Time
( t /h )
TN F
(λB /U· ml- 1 )
Adh erence rate
(% )
0 0 46. 2± 1. 8
1 100 55. 7± 2. 5* *
2 100 62. 8± 1. 4* *
4 100 61. 5± 3. 5* *
6 100 61. 1± 4. 0* *
　　* * P < 0. 01 vs 0 h
细胞的粘附率分别为 ( 43. 2± 2. 1)% , ( 52± 3. 7)%
( P < 0. 05) , ( 58. 2± 2. 5)% ( P < 0. 01) , ( 61. 0±
2. 1)% (P < 0. 001) , ( 59. 0± 2. 0)% (P < 0. 01)。
2. 3　 IM P对 TN F诱导内皮细胞与单核细胞粘附
的影响　内皮细胞单层先与不同浓度的 IM P共育
4 h后 ,再用浓度为 100 U /ml的 TN F刺激 4 h ,加
入单核细胞悬液 ,测定 M PO活性。 结果显示 , IM P
浓度为 0. 1～ 10. 0μmo l /L时呈剂量依赖性地显著
抑制 TN F诱导的内皮细胞与单核细胞粘附 ,当
IM P浓度为 0. 1, 1. 0及 10. 0μmol /L时 ,抑制率分
别为 30. 9% , 57. 8%及 90. 3% (表 2)。
表 2　 IMP对 TNF诱导内皮细胞与单核细胞粘附的影响
Tab 2　 Dose-dependent eff ect of IMP on TNF induced
monocytes adhesion to endothelial cells in vitro
(n= 3, x-± s )
IM P
(CB /μmol· L- 1)
TN F
(λB /U· ml- 1 )
Adh erence
rate(% )
Inhibi tion
rate(% )
0 0 41. 2± 5. 2
0 100 54. 5± 1. 3* *
0. 1 100 50. 4± 2. 2△ 30. 9
1. 0 100 46. 8± 3. 1△ 57. 8
10. 0 100 42. 5± 4. 6△△ 90. 3
　　* * P < 0. 01 vs 0 U /ml TN F; △ P < 0. 05,△△ P < 0. 01 vs
　　 100 U /ml TN F
3　讨　论
　　单核细胞与内皮细胞的粘附在动脉粥样硬化、
脑卒中等形成过程中起重要作用。 在喂养高胆固醇
的动物模型上 ,几周内可观察到单核细胞粘附到血
管内皮上 ,接着单核细胞浸润到血管内膜并摄取胆
固醇 ,转化为富含脂质的巨噬细胞 ,形成脂质条纹 ,
·157·第二军医大学学报　 1998 Apr; 19( 2)
这是最早形成的动脉粥样硬化斑块 [ 7]。 Mori等 [8 ]研
究表明 ,白细胞粘附于血管内皮可导致脑缺血再灌
流后无再流 ,造成脑组织坏死 ,用 CD18单克隆抗体
阻断白细胞粘附于管壁内皮 ,使微血管流通 ,可防止
脑组织坏死 ,因此研究单核细胞与内皮细胞的粘附
具有重要意义。测定单核细胞的方法有几种 ,如人工
计数选择性染色的细胞、测定细胞的 DNA含量等 ,
但这些方法不能对粘附到内皮细胞上的单核细胞进
行定量测定。 Bath等 [6 ]建立的测定单核细胞 M PO
活性的方法 ,能够测定粘附在内皮细胞单层上的单
核细胞 ,而不受混杂淋巴细胞及内皮细胞单层的影
响 ,重现性较好。
TN F是一类具有广泛生物活性的炎性介质 ,在
免疫、肿瘤等疾病的病理过程中具有重要作用。近年
来发现 TN F可促进平滑肌细胞增殖 [4 ] ;同时也可直
接损伤内皮细胞 [9 ] ,提示 TN F在动脉粥样硬化及其
他心血管疾病中起一定作用。本研究表明 , TN F对
培养的 BCMEC与单核细胞的粘附具有明显促粘附
作用 ,提示 TNF在脑动脉粥样硬化、脑卒中等心脑
血管疾病中可能有重要作用。因而 ,寻找拮抗 TN F
作用的药物 ,在心脑血管疾病的防治中有应用前景。
IM P是从植物中提取的有效成分 ,以往的研究
表明 , IM P能抑制 TN F诱导的血管平滑肌细胞增
殖 ,本研究又证实 IM P可抑制 TN F诱导的血管内
皮细胞与单核细胞的粘附 ,进一步表明 IM P可通过
不同途径影响心脑血管疾病的致病因素 ,提示 IM P
在心脑血管疾病的防治中可能有重要意义。
参 考 文 献
1　 Johan F , Ruih ua W , And ers H, et al . Mononuclear leukocytes
ex posed to oxidized low densi ty lipoprotein s ecrete a facto r that
s tim ulates endoth elial cell s to express adhesion molecules.
Atherosclerosi s, 1993, 103( 2): 213
2　 Uichi I, M ichiyo I, Yoshi tan e S, et al . Ex pres sion of intercellu-
lar adh esion molecule-1 on rat vascu lar smooth m uscle cel ls by
pro-inf lammatory cytokine. Ath erosclerosis, 1993, 104( 1): 61
3　曾国钱 ,林　峰 ,王雪松 ,等 .欧芹素乙和异欧芹素乙对兔血小板
聚集及兔血小板内血栓素 B2、环腺苷酸水平的影响 .第二军医大
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4　嵇　扬 ,曾国钱 ,孙笃新 .药物对 TNF诱导的牛脑微血管平滑肌
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5　孙笃新 ,曾国钱 ,沈有安 ,等 .牛脑微血管内皮细胞的体外培养及
形态学观察 .第二军医大学学报 , 1992, 13( 2): 178
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Meth ods, 1989, 118( 1): 59
7　 Ros s R. Th e path og enesis of ath eros clerosis—— an update. N
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9　余祥彬 ,刘锡均 ,钱定华 ,等 .肿瘤坏死因子对牛肺动脉内皮细胞
的损伤及蛋白激酶 C抑制剂的抑制作用 .药学学报 , 1996, 31
( 3): 176
( 1997-07-03收稿 , 1997-11-14修回 )
(本文编辑　刘　跃 )
长海医院骨科一次性切除颈椎巨细胞瘤获成功
　　最近 ,长海医院成功开展 1例高难度颈椎手术 ,成功切除一罕见的生长在第 3颈椎的巨细胞瘤 ,原来瘫痪卧床的患者已下
地正常活动。
患者是安徽省 16岁的中学生小郭 ,因脖子肿痛、活动受限 ,逐渐发展到截瘫。 来到长海医院后 ,经 M RI检查显示 ,患者的
颈部脊椎长有一鸡蛋大小的肿瘤 ,并已严重压迫脊髓 ,导致四肢瘫痪 ,大小便失禁。 经著名脊柱外科专家、长海医院骨科主任
侯铁胜教授诊断为巨细胞瘤 ,必须立即切除 。 由于颈部神经分布复杂 ,血管多 ,手术难度大 ,国内开展此手术的医院一般都分
两次手术 (间隔 3个月 )进行 ,时间较长 ,肿瘤细胞有转移可能。手术能否一次完成? 已在国内开展多项骨科新技术的侯铁胜教
授决定勇闯“禁区”。 他制订了严密的手术方案 ,亲自主刀 ,与孙庆斌副教授、陈舰主治医生一起 ,在麻醉科医生的密切配合下 ,
经过 5个多小时的手术 ,终于完整切下患者的巨细胞瘤 ,并进行颈椎内固定及植骨融合术。 患者术后第 2天就开始肢体活动 ,
2周后出院。
据检索有关文献 ,一次性切除颈部脊椎巨细胞瘤在国内尚未见报道。
·158· 第二军医大学学报　 1998 Apr; 19( 2)