全 文 ：欧芹素乙对人脐静脉内皮细胞的保护作用及对血管内皮生长因子表达
的影响
刘厚佳 1 ,李铁军 2 ,邱　彦 3 ,芮耀诚 2 ,卫立辛 4 ,吴孟超 4 ,张　黎 4(1第二军医大学第一附属医院 , 上海 200433;2第二
军医大学药学院 , 上海 200433;3中国人民解放军 454医院药剂科 ,江苏 南京 210002;4第二军医大学第三附属医院 , 上海
200433)
基金项目:国家自然科学基金资助项目 (No. 39870870;No.
30500615);军队 “十五 ”医学科研课题资助项目(No.04A-8);上海市
卫生局青年课题资助项目(No.2004-55-94);第二军医大学启动基金
(2003-SQ-11).
作者简介:刘厚佳(1976-),男 ,博士,主管药师.
通讯作者:张黎.E-mail:lizhang@smmu.edu.cn.
摘要　目的:研究欧芹素乙对内皮细胞的保护作用;溶血磷脂酰胆碱(LPC)对人脐静脉内皮细胞株 HUVEC
细胞中血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响以及欧芹素乙的影响 。方法:应用四唑盐(MTT)法检测溶血
磷脂酰胆碱对 HUVEC细胞的毒性作用及欧芹素乙的保护作用;应用基础酶联免疫吸附试验(ELISA)检测各
组条件培养基中 VEGF蛋白含量;采用 RT-PCR法及 RealtimePCR方法检测溶血磷脂酰胆碱对 VEGFmRNA
的表达及欧芹素乙的影响。结果:MTT检测结果显示 ,溶血磷脂酰胆碱对 HUVEC细胞具有较强的生长抑制
作用 ,而欧芹素乙对溶血磷脂酰胆碱所致的细胞增殖抑制具有较好的保护作用。 ELISA结果显示 , HUVEC
细胞暴露于溶血磷脂酰胆碱后 , VEGF蛋白含量明显升高;加入欧芹素乙后剂量依赖性地降低 VEGF蛋白的
表达。 RT-PCR结果显示 ,溶血磷脂酰胆碱可以增加 3种 VEGF异构体的转录水平 ,其中 VEGF165的表达显
著增加 ,欧芹素乙可剂量依赖性地抑制溶血磷脂酰胆碱引起的 VEGFmRNA的高表达。结论:欧芹素乙对溶
血磷脂酰胆碱引起的细胞损伤有明显的保护作用;欧芹素乙可抑制溶血磷脂酰胆碱所诱导的 HUVEC细胞
中 VEGF蛋白及 VEGFmRNA的高表达 ,对内皮细胞起到保护作用。
关键词　溶血磷脂酰胆碱;血管内皮生长因子;欧芹素乙
中图分类号:R965　　　文献标识码:A　　　文章编号:1006-0111(2009)02-0094-05
Inhibitoryefectsofvascularendothelialgrowthfactorexpressiononhumanum-
bilicalveinendothelialcelsbyimperatorin
LIUHou-jia1 , LITie-jun2 , QIUYan3 , RUIRao-cheng2 , WEILi-xin4 , WUMeng-chao4 , ZHANGLi4(1 ChanghaiHospital, Second-
aryMilitaryMedicalUniversity, Shanghai200433, China;2 CollegeofPharmacy, SecondaryMilitaryMedicalUniversity, Shanghai
200433, China;3DepartmentofPharmacy, the454thHospitalofPLA, Nanjing210002, China;4 EasternHepatobiliaryHospital,
SecondMilitaryMedicalUniversity, Shanghai200438, China)
ABSTRACT　Objective:Tostudytheprotectiveeffectsofimperatorin(IMP)againsthumanumbilicalveinendothelialcels(HU-
VEC)damageandexpressionofvascularendothelialgrowthfactor(VEGF)inducedbylysophosphatidvlcholine(LPC).Methods:Cell
iniuryweredeterminedbyMTTassay.VascularendothelialgrowthfactorproteinproductionfromHUVECwasdeterminedbyenzyme-
linkedimmunosorbentassay(ELISA).VEGFmRNAexpressionwasexaminedbyRT-PCRandrealtimePCR.Results:Imperatorinpre-
ventedLPC-inducedinjuryinculturedHUVECinaconcentration-dependentmanner.LPCinducedexpressionofVEGFproteinand
VEGFmRNAonHUVEC.ImperatorincouldinhibittheexpressionofVEGFproteinandVEGFmRNAinco-culturedwithLPC.Con-
clusions::LPCcouldinducecelldamageandastrongexpressionofVEGFonHUVEC.ImperatorincouldprotectHUVECagainstthe
LPC-induceddamageanddownregulateVEGFproteinandVEGFmRNAexpressioninculturedHUVEC.
KEYWORDS　lysophosphatidylcholines;endothelialgrowthfactors;imperatorin
　　血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowth factor, VEGF)也称血管通透性因子(VPF),通过旁
分泌方式作用于内皮细胞 ,促进内皮细胞增殖 ,生理
性和病理性血管生成及血管通透性的增加[ 1, 2] 。由
于在动脉粥样硬化斑块组织中 , VEGFmRNA的表
达明显升高 [ 3, 4] ,故推测 VEGF可能在动脉粥样硬
化(AS)早期发展中起重要作用 。
溶血磷脂酰胆碱(LPC)是氧化低密度脂蛋白
94 JoumalofPharmaceuticalPracticeVol.27 2009 No.2
(ox-LDL)的主要成分 [ 5] 。近年来研究发现 ,溶血磷
脂酰胆碱具有细胞毒性 ,可激活血管内蛋白激酶 C
而进一步氧化修饰低密度脂蛋白 ,使其生成氧化低
密度脂蛋白 。溶血磷脂酰胆碱参与内皮功能紊乱及
动脉粥样硬化的形成 [ 6] 。在喂食致动脉粥样硬化
饲料的动物模型中 ,发现动脉损伤处测得溶血磷脂
酰胆碱的浓度明显升高 [ 7] ,因此进一步研究溶血磷
脂酰胆碱对内皮细胞的影响对阐明动脉粥样硬化的
形成机制提供新的思路。
欧芹素乙 (imperatorin, IMP)是中药欧前胡和
白芷根部的有效成分 [ 8, 9] ,具有抗炎作用 ,抑制花生
四烯酸诱导的血小板聚集 ,抑制肿瘤坏死因子 、白介
素 1诱导的牛脑微血管平滑肌细胞的增殖 、单核细
胞的迁移及单核细胞与内皮细胞的黏附作用 [ 10, 11] 。
研究证实 ,动脉粥样硬化进程中单核细胞向内膜迁
移并与内皮细胞黏附 ,是泡沫细胞形成的关键 ,更是
动脉粥样硬化发生的启动因素 。研究发现 , VEGF
可以促进内皮细胞的通透性 ,促进单核细胞的迁移 ,
但欧芹素乙对内皮细胞表达 VEGF的影响尚未见报
道 。基于前期工作中对欧芹素乙的作用研究 ,我们
推测欧芹素乙可能对动脉粥样硬化的形成具有一定
的保护作用 ,但是其作用机制尚未完全明确 。因此
本研究拟探讨欧芹素乙对人脐静脉内皮细胞的保护
作用 ,并进一步研究欧芹素乙对溶血磷脂酰胆碱诱
导人脐静脉内皮细胞表达 VEGF的影响。本研究对
于阐明动脉粥样硬化的形成机制及探寻防治策略具
有一定的意义。
1　材料与方法
1.1　试剂与材料　欧芹素乙 (IMP,结构式见图
1),用 DMEM配成浓度为 1×104g/L, 1×105 g/L和
1×106 g/L3种待测样品;溶血磷脂酰胆碱 、四唑盐
(MTT)及胰酶均为 Sigma公司提供;胎牛血清 FBS
和 DMEM培养基为 Gibco公司产品;人 VEGF
ELISA检测试剂盒购自 Invitrogen公司;TAKARA
OneStepRNAPCRKit(AMV)购自 TAKARABIO-
TECH;细胞 /组织总 RNA提取试剂盒购自上海华舜
生物工程有限公司;VEGF引物及 Taqman探针由上
海申友生物有限公司提供 。
图 1　欧芹素乙结构式
1.2　细胞培养　HUVEC细胞用含 15% FBS的
DMEM培养基培养 , 待细胞长成致密单层后 , 用
0.125%的胰酶消化 ,调整细胞数为 1 ×105个 /mL,
按每瓶 5×103L接种于培养瓶中 ,置 37 ℃, 5%CO2
孵箱中孵育 48 h后 ,可长成融合的单层细胞 ,换以
无血清培养基 ,静息 24h,以消除血清的影响 。将准
备好的细胞单层换以含 2.5mg/L溶血磷脂酰胆碱
的无血清 DMEM培养基刺激 24 h,取其上清液(条
件培养基 , CM),离心 5 min,用 ELISA方法检测
VEGF的表达 。药物组加入 5 mg/L溶血磷脂酰胆
碱 +欧芹素乙(1×104g/L, 1×105 g/L, 1×106 g/L)
共孵 ,对照组只加无血清 DMEM培养基 。
1.3　欧芹素乙对溶血磷脂酰胆碱所致 HUVEC损
伤的保护作用　应用 MTT比色实验检测溶血磷脂
酰胆碱对 HUVEC细胞存活和生长的影响 。 HUVEC
细胞以 1×104个 /孔接种于 96孔细胞培养板 ,将长
成致密单层的细胞换以含 2.5 mg/L溶血磷脂酰胆
碱的无血清 DMEM培养基 ,或者加入 2.5 mg/L溶
血磷脂酰胆碱 +欧芹素乙(1×104g/L, 1 ×105 g/L,
1×106 g/L)共孵 ,对照组只加无血清 DMEM培养
基 ,刺激 24 h后移去 DMEM培养基 , PBS洗后每孔
加入 0.1 mLDMEM培养基和 0.01 mLMTT(5 g/
L), 37 ℃, 5%CO2孵箱中孵育 4 h后 ,弃去上清液 ,
每孔加入 0.1 mL异丙醇(含 0.1 N盐酸),振荡数
分钟 ,使 MTT结晶完全溶解 ,在酶标仪 570 nm处测
定吸收值 。
1.4　欧芹素乙对溶血磷脂酰胆碱诱导 HUVEC表
达 VEGF的影响
1.4.1　ELISA法检测条件培养基中 VEGF蛋白的
含量　按照试剂盒操作要求 ,在已用包被液包被的
96孔酶标板相应位置加入 100 μLVEGF标准品或条
件培养基 ,与 4 mg/L鼠抗人 VEGF抗体室温孵育 3h
后 ,加入 25 μL兔抗鼠 IgG-HRP,室温孵育 30 min。
PBS洗板 5次 ,加入 100μL含 0.01%H2O2的邻苯二
胺盐酸盐 ,室温显色 25min, 50 μL2mol/L氢氧化钠
终止反应 。以酶标仪测定 492 nm处吸收值(A)。
1.4.2　RT-PCR法检测 VEGF不同异构体 mRNA
的表达　细胞经过溶血磷脂酰胆碱或溶血磷脂酰胆
碱 +欧芹素乙刺激 6 h后 ,应用细胞 /组织总 RNA
提取试剂盒提取细胞内总 RNA。各取 1 μg总 RNA
进行 RT-PCR反应。 PCR反应条件为 42 ℃ 30 min
逆转录 ,变性 94 ℃ 30s, 退火 55 ℃ 30 s, 延伸 72
℃ 1min, 35个循环后 , 72℃延伸 10 min.VEGF165
上游引物为 5 -CCATGAGATCGAGTACAT-3 ,
下游引物为 5 -AGCAAGGCCCACAGGGATTT-
3 ,扩增片段长度为 254 bp。 VEGF121上游引物为
95药学实践杂志　2009年第 27卷第 2期
5 -CCATGAGATCGAGTACAT-3 , 下游引物为
5 -GCCTCGGCTTGTCACATTTT-3,扩增片段长
度为 254 bp。 VEGF189上游引物为 5 -CCATGA
GATCGAGTACAT-3 ,下游引物为 5 -AACGCT
CCAGGACTTATACCG-3 ,扩增片段长度为 310
bp。管家基因 GADPH上游引物为 5 -GTGAAG
GTCGGAGTCAACG -3 , 下游引物为 5 -GGT
GAAGACGCCAGTGGACTC-3 ,扩增片段长度为
510bp。各取 5μLRT-PCR产物进行 2%琼脂糖凝
胶电泳 。其余部分纯化后进行 VEGF-pcDNA3真核
表达载体的构建 。
1.4.3　RealtimeRT-PCR法检测 VEGF165 mRNA
的表达
1.4.3.1　VEGF标准品(VEGF165-pcDNA3质粒)
的构建 　VEGF165 RT-PCR产物纯化后构建于 T
vector, 经 EcoRI及 XbaI双酶切后 ,连接于 pcD-
NA3空质粒中 。构建好的 VEGF165-pcDNA3重组
质粒经扩增 ,酶切鉴定及测序无误后 ,测定 260 nm
及 280 nm的吸收值 ,对 VEGF165-pcDNA3重组质
粒 DNA定量。制备成 1×104 ～ 1×108拷贝 ,用于
制备 RealtimeRT-PCR反应中的标准曲线 。
1.4.3.2　RealtimeRT-PCR　检测 VEGF165 mRNA
的表达 细胞经过溶血磷脂酰胆碱或溶血磷脂酰胆
碱 +欧芹素乙刺激 6 h后 ,应用细胞 /组织总 RNA
提取试剂盒提取细胞内总 RNA。各取 0.5 μg总
RNA进行逆转录反应 。分别取 1 μLcDNA进行
RealtimeRT-PCR反应 。VEGF165上游引物为 5-
CCATGAGATCGAGTACAT-3, 下游引物为 5-
AGCAAGGCCCACAGGGATTT-3,扩增片段长度
为 254bp。探针序列为 5-FAMATCCTGTGTGCC
CCTGATGCGATGCGGTTAMRA-3, PCR反应条
件为 92 ℃ 3min, 60 ℃ 30s, 55 ℃ 30s, 40℃ 5s,
共计 30个循环。
1.5　数据处理　每组实验均重复 3次 ,所得数据均
采用 x±s的形式 ,并进行 ANOVA检验 。
2　结果
2.1　欧芹素乙对溶血磷脂酰胆碱致 HUVEC增殖
抑制的保护作用　MTT结果显示溶血磷脂酰胆碱
对 HUVEC细胞具有细胞毒性作用 ,可明显抑制
HUVEC的增殖 ,其吸收值为(0.362 ±0.012),与对
照组 (0.500 ±0.013)相比具有显著性差异 (P<
0.01),加入欧芹素乙后剂量依赖性的抑制溶血磷
脂酰胆碱对内皮细胞的损伤作用(图 2)。
2.2　欧芹素乙对 VEGF表达的影响　ELISA法得
到标准曲线方程为 Y=0.038 3X+ 0.124, R2 =
0.987 1(图 3)。根据标准曲线方程 , HUVEC细胞
条件培养基中 , 对照组的 VEGF蛋白含量为(1.11
±0.06)μg/L,当 HUVEC细胞暴露于溶血磷脂酰
胆碱后 , VEGF蛋白含量为(2.43±0.04)μg/L。加
入欧芹素乙后 , VEGF蛋白含量明显降低 ,当欧芹素
乙为 1 ×104 g/L时 , VEGF蛋白含量为 (0.54 ±
0.04)μg/L,与溶血磷脂酰胆碱组相比降低 4.5倍 ,
差异非常显著(P<0.01, n=3)(图 4)。
96 JoumalofPharmaceuticalPracticeVol.27 2009 No.2
2.3　欧芹素乙对 VEGFmRNA表达的影响 　HU-
VEC经溶血磷脂酰胆碱诱导后 , RT-PCR产物电泳
结果显示 , VEGF不同异构体中 , VEGF165的表达量
最高 , VEGF121次之 , VEGF189表达量最少(图 5),
故检测溶血磷脂酰胆碱及欧芹素乙对 VEGF165
mRNA表达的影响可能更有意义。正常培养的 HU-
VEC细胞中 ,仅有极少量 VEGF165 mRNA的表达;
溶血磷脂酰胆碱刺激后可使 VEGF165 mRNA高表
达;加入欧芹素乙后 , 可剂量依赖性地降低 VEGF
165mRNA的表达(图 6)。
2.4　欧芹素乙对 VEGF165 mRNA表达的影响　抽
提纯化的 VEGF165-pcDNA3质粒 DNA定量后 ,用
TE配制成 1×104 ～ 1×108拷贝数的标准品 。分别
取 1 μL不同拷贝数的 DNA进行 VEGF165 mRNA
的 RealtimeRT-PCR反应。标准曲线如图 7。斜率
Slope=-3.115 ,说明扩增效率很高;r=-1.00,说明
线性良好 。 RealtimeRT-PCR结果与 RT-PCR结果
相似。当溶血磷脂酰胆碱与 HUVEC共孵后 ,
VEGF165 mRNA表达显著增加 ,是空白对照组的
4.1倍 , 加入欧芹素乙后可剂量依赖性地降低
VEGF165 mRNA的表达(图 8)。
3　讨论
目前普遍认为内皮细胞损伤 ,动脉壁通透性增
加 ,使脂蛋白易通过内皮 ,沉积在内皮下 ,与 AS的
早期发展有密切关系 [ 12 ～ 14] 。在诸多引起内皮损伤
的有害刺激中 , ox-LDL是引起内皮功能紊乱的重要
物质 ,其可以通过调节多种细胞分泌多种细胞因子 ,
生长因子发挥致 AS效应 [ 14] 。溶血磷脂酰胆碱是
ox-LDL的主要成分 ,在 LDL氧化过程中 40%磷脂
酰胆碱可转变成溶血磷脂酰胆碱 。溶血磷脂酰胆碱
具有细胞毒性 , 可引起内皮细胞变性 、坏死 、脱
落[ 6] 。溶血磷脂酰胆碱可以通过 L氨基酸转运蛋
白 1(LAT1)和细胞表面抗原 4 F2(4 F2 hc)促进
97药学实践杂志　2009年第 27卷第 2期
HUVEC细胞因子 IL-6和 IL-8的表达[ 15] 。本实验
表明 ,溶血磷脂酰胆碱不仅增加 HUVEC细胞 VEGF
蛋白的表达 ,而且能促使 VEGFmRNA高表达 ,提示
在动脉粥样硬化的发生发展过程中 , VEGF表达的
增加可能与溶血磷脂酰胆碱有密切关系。
近年来研究证明 ,溶血磷脂酰胆碱可以促进牛
主动脉平滑肌细胞(BASMC)增殖 ,而欧芹素乙可以
抑制溶血磷脂酰胆碱产生的细胞增殖作用 [ 16] 。研
究发现 ,在人单核细胞株 U937建立的泡沫细胞模
型中 ,当加入氧化低密度脂蛋白作用时 ,细胞间黏附
分子 -1(ICAM-1)的表达水平显著增加 ,而欧芹素
乙可以剂量依赖性地抑制 ICAM-1蛋白和 ICAM-1
mRNA的表达 ,提示欧芹素乙可以通过降低黏附分
子的表达 ,从而对泡沫细胞的形成具有一定的抑制
作用[ 17] 。欧芹素乙还可以可抑制小鼠腹腔巨噬细
胞释放 TNF[ 18] 。由于 TNF可引起血管内皮损伤 ,促
进血管平滑肌细胞分化与增殖 ,激活凝血机制介导
心血管系统病理性改变而造成某些心脑血管疾病 ,
因此欧芹素乙有望在某些心脑血管系统疾病的防治
中产生积极的作用 。本研究发现 ,欧芹素乙对于溶
血磷脂酰胆碱诱导的内皮细胞损伤 ,具有较强的保
护作用 ,可显著提高细胞的存活率;对溶血磷脂酰胆
碱引起的 VEGF蛋白及 VEGFmRNA表达的增加亦
有明显的抑制作用 ,结合以往的研究结果 ,提示欧芹
素乙可能通过抑制 VEGF的表达保护内皮细胞 ,维
持正常的内皮功能 ,从而发挥动脉粥样硬化的保护
作用。欧芹素乙在动脉粥样硬化的预防及治疗中具
有潜在的药物开发前景。
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收稿日期:2008-08-28
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98 JoumalofPharmaceuticalPracticeVol.27 2009 No.2