全 文 ：食 品 科 技
FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY 提取物与应用
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2016年 第41卷 第03期
收稿日期：2015-10-26 *通讯作者
基金项目：国家自然科学基金项目(31272705)。
作者简介：李静(1990—)，女，河北石家庄人，硕士研究生，研究方向为海洋活性物质。
大叶藻(Zostera marina L.)地方名为海带草、海
马蔺、海苫房草，分布在山东青岛和荣成、辽宁
大连及河北沿海浅海水域中潮带，成大片的单种
群落[1]。大叶藻不仅在海洋生态系统中地位显著，
而且在保健、医药、水产养殖及化学工业等行业
中也具有开发的潜力[2]。目前，大叶藻的研究主要
李 静，张朝辉*，段筱杉，应 锐
(中国海洋大学食品科学与工程学院，青岛 266003)
摘要：采用聚酰胺-大孔树脂联用法纯化大叶藻黄酮，对其纯化工艺进行优化。样液以聚酰胺
吸附，水洗除杂后置于大孔树脂柱上部，以70%(v/v)的乙醇洗脱。通过单因素和正交试验优化
纯化的最佳工艺，确定最佳纯化工艺条件是样液与大孔树脂的比为4:1(v/m)，样液与聚酰胺的比
为16:1(v/m)，洗脱体积为6 BV，洗脱流速为2 BV/h，在此条件下黄酮纯度由(14.97±0.51)%增加
到(71.14±0.79)%。该方法纯化工艺简单，具有良好的应用前景。
关键词：大叶藻；黄酮；纯化；聚酰胺-大孔树脂联用
中图分类号：TS 254.58 文献标志码：A 文章编号：1005-9989(2016)03-0203-05
Purification of flavonoids from Zostera marina L. with
polyamide-macroporous resin
LI Jing, ZHANG Zhao-hui*, DUAN Xiao-shan, YING Rui
(College of Food Science and Engineering, Ocean University of China, Qingdao 266003)
Abstract: The process parameters of the purification of Zostera marina L. flavonoids by polyamide-
macroporous resin were studied. Polyamide which adsorbed with sample was washed with water first
to eliminate the impurities. Then, put polyamide in macroporous resin column above. The flavonoids
were enriched by eluting with 70% ethanol. The optimized process for the purification of Zostera marina
L. flavonoids was explored on the basis of single factor experiments and orthogonal experiments. The
optimized technology conditions to purify Zostera marina L. flavonoids were as follow: the ratio of sample
and macroporous resin was 4:1, the ratio of sample and polyamidewas 16:1, eluting the column with 6 BV
at a flow rate of 2 BV/h. After the purification, the purity of flavonoids was increased from (14.97±0.51)% to
(71.14±0.79)%. The method is more convenient, which has a good application foreground.
Key words: Zostera marina L.; flavonoids; purification; polyamide-macroporous resin
聚酰胺-大孔树脂联用纯化
大叶藻黄酮
DOI:10.13684/j.cnki.spkj.2016.03.041
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集中于生态繁殖[3]、海草床恢复[4]等方面，对于其
活性物质的研究较少。大叶藻在外在的形态和内
在的代谢途径上与陆地生物有着较大差异，产生
并积累了大量具有特殊化学结构和生理活性的物
质，这些都将成为人类开发新药物、新材料的重
要来源[5]。文献[6]首次从大叶藻中发现黄酮类化合
物，为后续对大叶藻黄酮的研究奠定了基础。
黄酮类化合物，又称类黄酮、黄酮体和黄
碱素，是一类植物多酚类次级代谢产物，广泛
分布于中草药、水果和茶叶等植物中[7]。研究表
明，黄酮具有抗氧化[8]、降血脂[9]、抗炎[10]等生理
活性。当利用各种提取方法将黄酮提取出来后，
粗提物中含有很多杂质，黄酮含量偏低，不能满
足生产和生活的标准与要求，需要对其进行纯
化。在各种纯化方法中，大孔树脂吸附法[11]、硅
胶柱层析法[12]、聚酰胺柱层析法[13]、葡聚糖凝胶
柱层析法[14]等比较常用。有文献[15]采用大孔树脂
对大叶藻黄酮进行纯化，纯化后黄酮含量上升至
(51.25±1.26)%，纯化效果不太理想。因此，对大
叶藻黄酮的纯化方法有待进一步研究，以期得到
更好的纯化效果。
本研究以海洋高等植物——大叶藻为原料，
采用聚酰胺-大孔树脂联用法纯化大叶藻黄酮，
对其纯化工艺进行探讨，以期得到纯度更高的大
叶藻黄酮，为后续研究以及提高其利用价值提供
参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
大叶藻采自山东青岛栈桥附近海域，烘干、
粉碎备用。
芦丁：南京替斯艾么中药研究所；聚酰胺
树脂：上海摩速科技有限公司；大孔吸附树脂
AB-8：安徽三星树脂科技有限公司；亚硝酸钠、
硝酸铝、氢氧化钠、无水乙醇、盐酸等：国产分
析纯。
1.2 仪器与设备
WB-200小型高速粉碎机：北京维博创机械
设备有限公司；722s可见光分光光度计、pH计：
上海精密科学仪器有限公司；AL204电子天平：
梅特勒托利多(上海)有限责任公司；旋转蒸发仪：
德国Heidolph公司；恒流泵：保定兰格恒流泵有限
公司；BSZ-100自动部分收集器：上海青浦沪西
仪器制造厂。
1.3 方法
1.3.1 芦丁标准曲线的绘制 选取芦丁为标准品，
采用亚硝酸钠-硝酸铝显色法[16]，绘制芦丁标准曲
线并测定黄酮的质量浓度。将芦丁标准品在120
℃干燥至恒重，并准确称取20.00 mg，以70%(v/v)
的乙醇溶液定容至100 mL，样液摇匀即得浓度为
0.20 mg/mL的芦丁标准溶液。分别准确移取标准
溶液0、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00、7.00
mL于8个25 mL具塞试管中，加浓度为5%的NaNO2
溶液0.3 mL后摇匀并静置6 min，加浓度为10%的
Al(NO3)3溶液0.3 mL后摇匀并静置6 min，加浓度为
4%的NaOH溶液4 mL，定容至刻度线，摇匀并静
置15 min，以相应的试剂为空白对比。于510 nm
处测定芦丁标准溶液的吸光度。以芦丁的浓度为
横坐标，吸光度值为纵坐标，得出芦丁浓度(c)与
吸光度(A)之间的标准曲线。用最小二乘法进行回
归，得标准曲线方程为：A=11.8735c+0.0055，线
性相关系数R2=0.9994。
1.3.2 供试样品的提取及含量的测定 采用纤维素
酶-超声波辅助复合浸提法[17]提取大叶藻黄酮。提
取条件：提取溶剂为70%(v/v)乙醇，料液比3:50(m/
v)，纤维素酶量0.025 g/g原料，酶解pH5，酶解温
度为25 ℃，酶解处理时间为30 min；再进行超声
处理，超声时间15 min，超声功率250 W；之后在
55 ℃条件下浸提3 h，浸提结束后过滤取滤液。提
取3次，将得到的提取液合并，浓缩、干燥备用。
取适量样品代替芦丁，按照1.3.1的方法进行试
验，测定黄酮浓度，并按式(1)和(2)分别计算黄酮
纯度和黄酮回收率。
…………………(1)
…………………(2)
式中：c为黄酮的质量浓度，mg/mL；
V为液体的体积，mL；
m为称取的样品质量，mg；
m1为上柱前样品中黄酮的质量，mg；
m2为经纯化后样品中黄酮质量，mg。
1.3.3 大孔吸附树脂预处理 按照文献[18]中的方
法对大孔吸附树脂进行预处理，备用。
1.3.4 聚酰胺树脂预处理 按照说明书方法处理，
即取适量聚酰胺树脂，先用95%(v/v)的乙醇浸泡
24 h，再用蒸馏水洗脱直至无醇味，之后用4%的
NaOH溶液浸泡12 h，再滤掉上层碱液，用蒸馏水
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洗脱至中性，然后用4%的盐酸浸泡12 h，再用蒸
馏水洗脱至中性，放入烘箱50 ℃烘干，备用。
1.3.5 聚酰胺-大孔树脂联用纯化大叶藻黄酮 精
密量取适宜浓度的样品溶液加入已经处理好的聚
酰胺树脂粉末中搅拌均匀，挥去溶剂后置于玻璃
层析柱中并用水洗至流出液近无色后，再将其置
于以蒸馏水为填装溶剂的AB-8大孔吸附树脂柱
上部，用体积分数为70%的乙醇洗脱并收集洗脱
液，测定洗脱液中黄酮纯度及黄酮回收率。
1.3.6 统计学分析 数据以x±s表示，采用SPSS软
件进行单因素方差分析，P<0.05结果具有统计学
显著性。
2 结果与分析
2.1 大叶藻黄酮纯度的测定
未经纯化的大叶藻黄酮，经测定黄酮纯度为
(14.97±0.51)%。
2.2 聚酰胺-大孔树脂纯化大叶藻黄酮工艺条件
优化结果
2.2.1 样液与聚酰胺用量的比对纯化效果的影响
试验分别考察了浓度为1.25 mg/mL的样液
体积(mL)与聚酰胺用量(g)的比分别为4:1，8:1，
12:1，16:1，20:1时，将样液与聚酰胺搅拌均匀并
挥去溶剂，分别置于等量的AB-8大孔树脂柱上
部，以70%乙醇按2 BV/h的流速进行洗脱，收集6
BV洗脱液并计算洗脱液中黄酮的纯度和回收率。
结果如图1所示。
3:1，4:1，5:1，6:1时，以70%乙醇按2 BV/h的流速
进行洗脱，分别收集6BV洗脱液，测定洗脱液中
黄酮纯度和回收率。结果如图2所示。
注：与V:m=16:1相比，黄酮纯度*P＜0.05，**P＜0.01。
图1 样液与聚酰胺用量的比考察结果
注：与v:m=5:1相比，黄酮纯度*P＜0.05，**P＜0.01。
图2 样液与AB-8大孔树脂用量的比考察结果
图3 洗脱曲线 台䚚ఊᩢ⢳台䚚㏛Ꮢ ᵣ⋞̺㖆䚜㘦⮰℀ WN
台䚚㏛Ꮢ台䚚ఊᩢ⢳
台䚚ఊᩢ⢳台䚚㏛Ꮢ ᵣ⋞̺#๓ႀᴽ㘮⮰℀ WN
台䚚㏛Ꮢ台䚚ఊᩢ⢳
≃㙝⋞͙台䚚≿Ꮢ NHN- 喌 ≃㙝ѿ⼛#7
由图1可知，随着样液-聚酰胺用量比(v/m)的
增大，洗脱液中黄酮纯度先增加后减小，而黄酮
回收率明显降低，综合考虑黄酮纯度和回收率，
确定样液和聚酰胺的最佳比为16:1(v/m)。
2.2.2 样液与AB-8大孔树脂用量的比对纯化效果
的影响 将浓度为1.25 mg/mL的样液与等量的聚酰
胺树脂搅拌，之后置于AB-8大孔树脂柱上部，使
样液体积(mL)与大孔树脂用量(g)的比分别为2:1，
由图2可知，样液与AB-8的比为5:1(v/m)时，
黄酮纯度最高，黄酮回收率在80%以上，综合考
虑黄酮纯度和回收率，确定样液与AB-8的最佳比
为5:1(v/m)。
2.2.3 最佳洗脱体积测定结果 将浓度为1.25 mg/
mL的样液与聚酰胺树脂搅拌，使样液和聚酰胺的
比为16:1(v/m)，处理好后置于AB-8大孔树脂柱上
部，并使样液与AB-8的比为5:1(v/m)，再用70%的
乙醇，按2 BV/h的流速进行洗脱，以0.5 BV为一个
收集段进行收集，测定每段洗脱液中的黄酮质量
浓度，并绘制洗脱曲线。结果如图3所示。
由图3可知，当洗脱体积为6 BV时，洗脱液中
黄酮浓度接近零，说明6 BV基本洗脱完全，因此
确定最佳洗脱体积为6 BV。
2.2.4 最佳洗脱流速测定结果 将浓度为1.25 mg/
mL的样液与聚酰胺树脂搅拌，使样液和聚酰胺的
比为16:1(v/m)，处理好后置于AB-8大孔树脂柱上
部，并使样液与AB-8的比为5:1(v/m)，再用70%的
乙醇溶液分别按1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 BV/h的速
率进行洗脱，洗脱液用量为6 BV。测定各洗脱液
中黄酮纯度和回收率。结果如图4所示。
由图4可知，随着洗脱流速的提高，黄酮的纯
度和回收率提升，洗脱流速达到2 BV/h时，黄酮
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纯度和回收率反而下降，综合考虑，确定最佳洗
脱流速为2 BV/h。
2.2.5 最佳洗脱流速测定结果 选取样液-大孔树
脂比(v/m)、洗脱流速以及样液-聚酰胺比(v/m)3个
因素，设置3个水平，设计3因素3水平L9(3
4)正交试
验。考察因素及水平表见表1，正交试验结果见表
2，极差分析结果见表3，方差分析结果见表4。
表1 正交试验因素水平表
水
平
因素
样液-大孔树脂比/
(mL/g) A
洗脱流速/
(BV/h) B
样液-聚酰胺比/
(mL/g) C
1 4:1 1 20:1
2 5:1 2 16:1
3 6:1 3 12:1
表2 正交试验结果
试验号
因素
黄酮纯度/% 黄酮回收率/%
A B C
1 1 1 1 56.89±0.81 71.09±0.99
2 1 2 2 71.73±0.78 82.12±0.97
3 1 3 3 70.56±0.72 79.42±0.93
4 2 1 2 70.17±0.62 79.75±1.09
5 2 2 3 68.23±0.85 79.58±1.20
6 2 3 1 54.41±0.69 68.93±0.94
7 3 1 3 60.01±0.64 83.20±0.66
8 3 2 1 47.04±0.84 75.91±1.01
9 3 3 2 69.23±0.67 86.66±0.74
由正交试验的极差和方差分析结果(表3、表
4)可知，对黄酮纯度而言，样液-聚酰胺的比(v/
m)对其具有显著性影响，样液-大孔树脂的比(v/
m)和洗脱流速对其无显著性影响，各因素影响大
小顺序是C>A>B，最佳纯化工艺条件为A1B3C2；
对黄酮回收率而言，样液-大孔树脂的比(v/m)和
样液-聚酰胺的比(v/m)对其均有显著性影响，洗
脱流速对其无显著性影响，各因素影响大小顺
序是C>A>B，最佳纯化工艺条件为A3B2C2。表2
显示，对于黄酮纯度而言最佳纯化工艺条件为
A1B2C2，对于黄酮回收率而言最佳纯化工艺条件
为A3B3C2。为进一步确定最佳纯化工艺条件，对
A1B3C2，A3B2C2，A1B2C2，A3B3C2 4个组合的纯化
效果进一步进行比较。
2.3 验证试验
A1B3C2，A3B2C2，A1B2C2，A3B3C2 4个组合的
纯化效果见表5。
表5 验证试验结果
组合 黄酮含量/% 黄酮回收率/%
A1B3C2 70.19±0.90 77.89±1.09
##
A3B2C2 68.19±1.17
** 82.16±1.13
A1B2C2 71.14±0.79 82.63±0.93
A3B3C2 68.60±0.91
* 85.71±1.26##
注：与A1B2C2组合相比，黄酮纯度*P＜0.05，**P＜0.01；黄酮回收
率#P＜0.05，##P＜0.01。
注：与洗脱流速为2 BV/h相比，黄酮纯度*P＜0.05，**P＜0.01；黄酮
回收率#P＜0.05，##P＜0.01。
图4 洗脱流速对纯化效果的影响
台䚚ఊᩢ⢳台䚚㏛Ꮢ ≃㙝≭䕋 #7I喌 台䚚㏛Ꮢ台䚚ఊᩢ⢳ 表3 正交试验极差分析 因变量 A B CK1 黄酮纯度 199.18 187.07 158.34黄酮回收率 232.63 234.04 215.93K2 黄酮纯度 192.81 187.00 211.13黄酮回收率 228.26 237.61 248.53K3 黄酮纯度 176.28 194.20 198.80黄酮回收率 245.77 235.01 242.20
k1
黄酮纯度 66.39 62.36 52.78
黄酮回收率 77.54 78.01 71.98
k2
黄酮纯度 64.27 62.33 70.38
黄酮回收率 76.98 81.77 81.28
k3
黄酮纯度 58.76 64.73 66.27
黄酮回收率 81.92 78.34 80.73
R
黄酮纯度 7.63 2.40 17.60
黄酮回收率 5.84 1.19 10.87
最优水平
黄酮纯度 A1B3C2
黄酮回收率 A3B2C2
表4 正交试验方差分析
源 因变量 Ⅲ型平方和 df 均方 F Sig.
A
黄酮纯度 93.136 2 46.568 7.407 0.119
黄酮回收率 55.373 2 27.686 32.705 0.030
B
黄酮纯度 11.409 2 5.705 0.907 0.524
黄酮回收率 2.272 2 1.136 1.342 0.427
C
黄酮纯度 508.425 2 254.212 40.436 0.024
黄酮回收率 199.216 2 99.608 117.664 0.008
误差
黄酮纯度 12.573 2 6.287
黄酮回收率 1.693 2 0.847
总计
黄酮纯度 36506.743 9
黄酮回收率 55743.926 9
校正的
总计
黄酮纯度 625.544 8
黄酮回收率 258.554 8
注：a.黄酮纯度R2=0.980(调整R2=0.920)；b.黄酮回收率R2=0.993(调
整R2=0.974)。
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由表5可知，A1B2C2和A1B3C2组合的黄酮纯度
比较高，均在70%以上，并且A1B2C2组合的黄酮回
收率显著高于A1B3C2组合，综合考虑黄酮纯度和黄
酮回收率确定最佳纯化工艺为A1B2C2，即样液与大
孔树脂的比为4:1，洗脱流速为2 BV/h，样液与聚
酰胺的比为16:1，且该纯化工艺稳定性良好。
3 结论
聚酰胺和大孔树脂是分离纯化黄酮经常使用
的材料，因其吸附机制不同，在分离纯化两者呈
现出了各自的优缺点，试验过程中发现，将聚酰
胺和大孔树脂联用则可以使两者的优势充分发挥
出来。本研究采用聚酰胺-大孔树脂联用法对大叶
藻黄酮进行纯化，并对其纯化工艺进行研究，确
定了纯化的最佳工艺条件为样液与大孔树脂的比
为4:1(v/m)，洗脱流速为2 BV/h，样液与聚酰胺的
比为16:1(v/m)，洗脱体积为6 BV，在此纯化条件下
黄酮纯度由(14.97±0.51)%增加到(71.14±0.79)%。
这种纯化方法操作简单，柱再生比较方便且纯化
后黄酮含量高，具有广阔的应用前景，为大叶藻
黄酮的开发利用提供了理论参考。
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《食品科技》
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