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了哥王细胞毒性和细胞毒性成分研究



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了哥王细胞毒性和细胞毒性成分研究
吴 鹏 1, 2 ,黄伟欢 3 ,王 辉 4 ,李药兰1, 2*
(1.暨南大学药学院 /中药及天然药物研究所 ,广东 广州 510632;2.暨南大学中药药效物质基础及创新药
物研究广东省重点实验室 ,广东 广州 510632;3.香港中文大学生物系 ,香港 新界;4.暨南大学医学院 ,广
东 广州 510632)
  摘要 目的:研究有毒中药了哥王对肿瘤细胞的细胞毒性及其细胞毒性成分。方法:采用四甲基偶氮唑盐吸
收减少实验 (MTT法)测定了哥王乙醇提取物及其各溶剂萃取部位对肿瘤细胞 HeLa和 HEp-2的细胞毒性;采用气
相色谱-质谱 (GC-MS)联用技术对石油醚萃取部位(毒性部位)的挥发性成分进行分析;并采用 MTT法测定毒性
部位中主要挥发性成分的细胞毒性。结果:了哥王乙醇提取物 、乙酸乙酯萃取部位和正丁醇萃取部位对 HeLa和
HEp-2细胞均未表现出明显的细胞毒性 , CC50大于 200 μg/mL,但石油醚萃取部位对这 2种肿瘤细胞均表现出一定
的细胞毒性 , CC50分别为(64.3 ±6.5)、(37.8 ±8.4)μg/mL。石油醚萃取部位的主要挥发性成分为脂肪酸及其
甲酯 (棕榈酸 ,油酸 , 硬脂酸 ,棕榈酸甲酯 , 油酸甲酯和硬脂酸甲酯), 其中的不饱和脂肪酸油酸对 HeLa和 HEp-2细
胞均表现出一定的细胞毒性 , CC50分别为(74.3 ±4.0)、(36.9 ±1.9)μg/mL。结论:了哥王的低极性部位对肿瘤
细胞有一定的细胞毒性 ,不饱和脂肪酸为了哥王的细胞毒性成分之一。
关键词 了哥王;细胞毒性;细胞毒性成分;不饱和脂肪酸;
中图分类号:R285.5  文献标识码:A  文章编号:1001-4454(2010)04-0590-03
收稿日期:2009-07-07基金项目:教育部重点项目(106155);广东省自然科学基金(06025165);广东省自然科学基金团队项目 (8351063201000003)作者简介:吴鹏(1986-),男 ,在读研究生 ,主要从事天然药物化学研究。*通讯作者:李药兰 , Tel:020-85221728, Email:tliyl@jnu.edu.cn。
  了哥王 [ Wikstroemiaindica(L.)C.A.Mey.]为
瑞香科荛花属植物 ,广泛分布于我国长江以南及东
南亚一带 ,主产于两广地区 〔1〕。据 《中药辞海 》记
载 ,了哥王根 、茎 、叶 、果实均可入药 ,其性寒 ,味苦 、
辛 ,微温 ,有毒 ,具有清热解毒 、化痰散结 、消肿止痛
等功效 ,主治风湿性关节炎 、淋巴结炎 、瘰疬 、痈肿 、
跌打损伤等 〔2〕。目前 ,对了哥王的研究主要集中在
化学成分 、药理和临床应用方面 〔3, 4〕 ,但对其毒性的
研究报道较少。本实验研究了了哥王对肿瘤细胞的
细胞毒性及其细胞毒性成分 ,结果表明了哥王低极
性部位对肿瘤细胞有一定的细胞毒性 ,不饱和脂肪
酸为了哥王的细胞毒性成分之一。
1 材料与仪器
1.1 药物 了哥王(Wikstroemiaindica)根及根皮
购自广州通济堂药店 , 由麦振球高级工程师鉴定 。
将 1.0kg了哥王切碎 ,用 95%乙醇室温浸提 3次 ,
每次 15d。提取液合并后减压浓缩 、干燥 ,得到乙醇
提取物 98.0 g。将 98.0 g乙醇提取物分散于蒸馏
水中 ,依次用石油醚 、乙酸乙酯和正丁醇萃取 ,减压
浓缩 ,分别得到石油醚萃取部位 0.5 g,乙酸乙酯萃
取部位 56.0 g和正丁醇萃取部位 38.0 g。
1.2 试剂 96孔细胞培养板 , 丹麦 Nunc公司;
DMEM培养液 ,美国 HycLone公司;小牛血清 ,杭州
四季青生物工程材料有限公司;四甲基偶氮唑盐
(MTT),美国 Sigma公司;N-2-羟乙基哌嗪 -N-2-乙烷
磺酸 (HEPES),上海华舜生物工程有限公司;棕榈
酸甲酯 、油酸甲酯和硬脂酸甲酯为色谱纯 ,北京百灵
威公司;棕榈酸 、硬脂酸为分析纯 ,上海国药集团化
学试剂有限公司;油酸为分析纯 ,广东汕头市西陇化
工厂;石油醚 、乙酸乙酯和正丁醇等有机溶剂均为分
析纯 ,购自天津化学试剂一厂 。
1.3 主要仪器 CO2培养箱 ,德国 Heraeus公司;
超净工作台 ,杭州净化设备公司;倒置显微镜 ,德国
Laica公司;TMQ-300E型台式蒸气灭菌器 ,连云港
干樱医疗设备有限公司;精密移液枪 ,法国 Gilson公
司;RE-52CS旋转蒸发器 ,上海亚荣生化仪器厂;
·590· JournalofChineseMedicinalMaterials  第 33卷第 4期 2010年 4月
DOI :10.13863/j.issn1001-4454.2010.04.040
DHG-9053A型电热恒温鼓风干燥箱 ,上海精宏实验
设备有限公司;HHS型电热恒温水浴锅 ,上海博迅
实业有限公司医疗设备厂;气相色谱 -质谱仪
(TRACEGC-MS),美国 ThemoFinnigan公司。
1.4 细胞株 人宫颈癌细胞 (HeLa),由暨南大学
医学院病理解剖研究室提供;喉癌细胞 (HEp-2),
由香港中文大学生物系黄荣春教授馈赠。
2 方法
2.1 细胞毒性实验 采用四甲基偶氮唑盐吸收减
少实验(MTT法)进行检测 〔5〕 , MTT溶于磷酸缓冲液
(PBS),浓度为 5mg/mL。用 1%DMEM维持液将各
实验样品稀释成浓度为 250 μg/mL的溶液 ,再对倍
稀释成系列浓度溶液 ,然后分别加入到长满 HeLa
或 HEp-2单层细胞的 96孔板中(100μL/孔),每个
样品浓度重复 3孔 。同时设正常细胞对照组 (每孔
加入 100 μL1%DMEM维持液 )。 37 ℃培养 3 d
后 ,每孔加入 20μLMTT溶液 ,继续培养 4h后吸出
多余的 MTT和培养液 ,加入 DMSO(150μL/孔)使
蓝色甲基唑晶体溶解 。 15min后混匀并用酶标仪测
定光密度 D(λ)值 (测量波长为 570 nm)并计算细
胞毒性 。样品对细胞的半数致死浓度(CC50)根据
系列稀释样品的 D(λ)值推算而得 。
  细胞致死率 (%)=[ 1-D(λ)实验组D(λ)对照组 ] ×100%
2.2 统计学处理 实验所得数据均用 One-tailas-
say计算标准偏差 (standarddeviation, SD), 用
Student′sT试验进行方差分析检验差异的显著
性 。
2.3 GC-MS分析实验 色谱柱:DB-5石英毛细管
色谱柱(30 m ×0.25 mm, 0.25μm);载气:He, 1.2
mL/min;程序升温:起始温度为 75 ℃,保持 3 min,
以 3 ℃/min的速度升温至 280 ℃。 GC-MS电离方
式:采用电子轰击方式进行离子化 , EI电离能量为
70 eV,离子源温度为 200 ℃。质谱数据库:NIST′98
Libraries。
3 结果
3.1 了哥王乙醇提取物及其各溶剂萃取部位细胞
毒性实验 结果如表 1所示 ,了哥王乙醇提取物 、乙
酸乙酯萃取部位和正丁醇萃取部位对 HeLa和 HEp-
2均未表现出明显的细胞毒性 , CC50大于 200 μg/
mL,但石油醚萃取部位对这 2种癌细胞均表现出一
定的细胞毒性 , CC50分别为(64.3±6.5)μg/mL和
(37.8±8.4)μg/mL。
3.2 了哥王乙醇提取物石油醚萃取部位挥发性成
分的 GC-MS分析实验 由于了哥王乙醇提取物石
油醚萃取部位对 HeLa和 HEp-2表现出一定的细胞
毒性 ,故采用 GC-MS对其挥发性成分进行分析。对
石油醚萃取部位的 GC-MS分析总离子流图 (图 1)
采用计算机检索 ,从中鉴定了 9个化合物 (表 2)。
结果表明 ,了哥王石油醚萃取部位的主要挥发性成
分是脂肪酸和脂肪酸甲酯 。其中棕榈酸 ,棕榈酸甲
酯 ,油酸甲酯 ,硬脂酸甲酯是该部位的主要成分 ,另
外还有油酸和硬脂酸等饱和与不饱和脂肪酸 。
 表 1  了哥王乙醇提取物及其各萃取部位对 HeLa
和 HEp-2细胞的 CC50(μg/mL, x±s, n=3)
乙醇
提取物
石油醚
萃取部位
乙酸乙酯
萃取部位
正丁醇
萃取部位
HeLa >250 64.3±6.5 >250 >250
HEp-2 >250 37.8±8.4 210.1±2.8 >250
图 1 了哥王乙醇提取物石油醚萃取
部位的 GC-MS总离子流图
  表 2  了哥王乙醇提取物石油醚萃取部位的挥发性成分分析结果( x±s, n=3)
序号 保留时间 /min 化学成分 分子式 相对分子质量 百分含量 /% 匹配度 /%
1 36.98 棕榈酸甲酯 palmitiacid, methylester C17H34O2 270 29.50 76.15
2 40.56 棕榈酸 palmitiacid C16H32O2 256 22.05 71.54
3 42.82 珍珠酸甲酯 Heptadecanoicacid, methylester C18H36O2 284 1.72 66.92
4 46.51 亚油酸甲酯 9, 12-octadecadienoicacid, methylester C19H34O2 294 4.20 14.88
5 47.01 油酸甲酯 oleicacid, methylester C19H36O2 296 13.31 16.49
6 48.71 硬脂酸甲酯 octadecanoicacid, methylester C19H38O2 298 9.59 80.98
7 50.10 油酸 oleicacid C18H34O2 282 3.61 24.35
8 51.63 硬脂酸 octadecanoicacid C18H36O2 284 2.02 57.17
9 59.87 花生酸甲酯 eicosanoicacid, methylester C21H42O2 326 1.82 68.39
·591·JournalofChineseMedicinalMaterials  第 33卷第 4期 2010年 4月
3.3 了哥王乙醇提取物石油醚萃取部位主要挥发
性成分的细胞毒性实验 采用 MTT法测试了哥王
乙醇提取物石油醚萃取部位的 6个主要挥发性成分
(棕榈酸 ,油酸 ,硬脂酸 ,棕榈酸甲酯 ,油酸甲酯和硬
脂酸甲酯)的细胞毒性。实验结果表明 ,棕榈酸 、硬
脂酸 、棕榈酸甲酯 、油酸甲酯和硬脂酸甲酯对 Hela
细胞和 HEp-2细胞均不显示细胞毒性 , CC50均大于
200μg/mL;但油酸对这 2种癌细胞均表现出一定
的细胞毒性 , CC50分别为 (74.3 ±4.0)、(36.9 ±
1.9)μg/mL(图 2、3,表 3)。
图 2 6个标准样品对 HeLa细胞的毒性结果
图 3 6个标准样品对 HEp-2细胞的毒性结果
 表 3    6个标准样品对 HeLa和 HEp-2细胞
的 CC50(μg/mL)( x±s, n=3)
棕榈酸 油酸 硬脂酸 棕榈酸甲酯 油酸甲酯 硬脂酸甲酯
HeLa 214.5±2.3 74.3±4.0 >250 >250 >250 >250
HEp-2 >250 36.9±1.9 >250 >250 >250 >250
4 讨论
本实验采用 MTT法 ,测定了哥王乙醇提取物及
其各溶剂萃取部位对人癌细胞 HeLa和 HEp-2的细
胞毒性 ,结果表明 ,只有石油醚萃取部位表现出一定
的细胞毒性 。采用 GC-MS石油醚萃取部位的挥发
性成分进行分析 ,发现该部位的主要挥发性成分是
脂肪酸和脂肪酸甲酯 ,进一步的细胞毒性实验结果
表明 ,只有不饱和脂肪酸表现出一定的细胞毒性 。
结果表明了哥王的细胞毒性部位为其低级性部位 ,
细胞毒性成分之一为不饱和脂肪酸。
  早在 20世纪 20年代 ,人们就发现一些二元的
脂肪羧酸具有溶解肿瘤细胞的作用 〔6〕 ,十八碳不饱
和脂肪酸油酸 、亚油酸和亚麻酸有明显的抑制肿瘤
细胞的作用〔7〕。饱和脂肪酸棕榈酸 、硬脂酸和花生
酸 ,以及不饱和脂肪酸棕榈油酸 、油酸 、亚油酸和亚
麻酸和花生四烯酸在体外能有效杀伤 Mat1376b腹
水癌细胞 ,不饱和脂肪酸的抑瘤活性显著强于相应
的饱和脂肪酸 〔8〕。此外 ,不饱和脂肪酸还具有动物
毒性 ,对鱼 96h后的半数致死浓度 (LD50)为 2 ~ 8
mg/mL,且毒性随双键数的增加而增加 〔9, 10〕。了哥
王为有毒中药 ,文献报道了哥王散发的气味可令人
晕到 〔11〕 ,另外 ,中医指出 ,服用了哥王时应注意剂量
不宜过大 ,煎煮时间宜长 ,宜煎 4h以上 ,常煎 6 ~ 10
小时 ,以消除毒素。本实验结果表明 ,不饱和脂肪酸
是了哥王细胞毒性成分之一 。
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