全 文 ：华北农学报·2011，26(增刊) :190 -192
收稿日期:2011 － 10 － 11
基金项目:云南省科技创新强省计划项目(2007C0004Z) ;云南省发改委产业重大关键技术研发专项(云发改高技［2009］1988 号)
作者简介:李淑斌(1979 －) ，男，云南临沧人，助理研究员，硕士，主要从事观赏植物资源与育种研究。
通讯作者:张 颢(1961 －) ，女，云南丽江人，研究员，硕士，主要从事花卉育种研究。
柏木枯萎病病原菌的形态特征及分子鉴定
李淑斌1，2，张 颢1，2
(1．云南省农业科学院 花卉研究所，云南 昆明 650205;2．云南省花卉育种重点实验室，云南 昆明 650205)
摘要:采用温室接种致病性测定、形态学观察和分子鉴定方法对柏木枯萎病病原进行了研究。从云南省昆明市、
石林县及玉溪市采集柏木枯萎病病样 13 份，分离获得来自柏木树根部、茎干及枝的 18 个真菌分离物。经过致病性
试验证实，分离物 CWC1-CWC10 均为柏木枯萎病病原菌。经形态学鉴定，CWC1-CWC10 均为 Neofusicoccum parvum。
利用 rDNA internal transcribed spacer region(ITSI-5． 8S-ITS2)进行 PCR 扩增，并将测序结果在 GenBank 中进行同源性
比对分析显示，其 rDNA ITS 序列分析结果表明该菌与 N． parvum 的同源性为 99%，分子鉴定与形态学鉴定结果一致。
Neofusicoccum parvum 作为柏木枯萎病的病原菌系首次报道。
关键词:枯萎病;形态学观察;分子鉴定
中图分类号:S432． 4 文献标识码:A 文章编号:1000 － 7091(2011)增刊 － 0190 － 03
Identification on Pathogen of Chinese Weeping Cypress Dieback Disease
LI Shu-bin1，2，ZHANG Hao1，2
(1． Flower Research Institute，Yunnan Academy of Agricultural Sciences，Kunming 650205，China;
2． Yunnan Flower Breeding Key Lab，Kunming 650205，China)
Abstract:The pathogens of Chinese weeping cypress(Cupressus funebris Endl)dieback disease were identified
on the basis of pathogenicity testing，as well as morphological characters and molecular identification． Thirteen dis-
eased Chinese weeping cypress samples were observed in Kunming，Shilin，and Yuxi in Yunnan Province(south-
western China)． Eighteen isolates of possible pathogenic fungi were isolated from roots，trunks and branches of in-
fected Chinese weeping cypress plants． Bases on the pathogenicity experiment，the results showed that CWC1-
CWC10 were the pathogens of Chinese weeping cypress wilt disease． The morphological identification showed that
CWC1-CWC10 was identified as Neofusicoccum parvum． By analysis of the rDNA internal transcribed spacer region
(ITSI-5． 8S-ITS2)． BLAST searches at GenBank showed a high identity with reference sequences(ITS:＞ 99%)．
Representative sequences of both regions were deposited to GenBank(ITS:Accession No． FJ842960)． Morphological
and molecular results confirmed this species as N． parvum，N． parvum was first reported as the pathogen of Chinese
weeping cypress dieback disease．
Key words:Dieback disease;Morphological observation;Molecular identification
柏木(Cupressus funebris Endl)为石灰岩土壤上
的适生树种，耐干旱瘠薄。广布于中国秦岭及长江
以南地区，我国西部、南部各省区有分布，其他各省
多为引种栽培;国外也有栽培种分布。是著名的用
材及重要的园林绿化植物［1］。2008 － 2009 年在云
南省昆明市、石林县及玉溪市进行园林绿化植物调
查时，发现此柏木全株枯死普遍发生，危害严重。柏
木作为用材及植物学角度以往研究较多，而对其病
害却研究甚少［2］。本研究通过对病原菌的培养性
状观察，rDNA internal transcribed spacer region(ITSI-
5． 8S-ITS2)序列分析研究，确定其分类地位及致病
性，以期明确该病的病原菌，为病害防治提供理论
依据。
增刊 李淑斌等:柏木枯萎病病原菌的形态特征及分子鉴定 191
1 材料和方法
1． 1 病原菌的分离和培养
从云南昆明、玉溪、石林县等地采集表现枯萎病
症状的柏木病害标本(图 1-A，B) ，采用常规组织分
离法，分别从发病植株的根、茎干及枝的病健交界处
进行分离。分离到的菌株经纯化后在 PDA 上进行
培养和形态观察。选取编号为 CWC8 的菌株为标
准菌株，将其斜面培养物置于 0 ～ 4℃ 冰箱中保存
备用。
图 1 垂丝柏枯萎症状(A)和茎秆横切面变色(B)
Fig． 1 Shoot blight of Chinese Weeping Cy-press caused
by B． parva (A)and Cross sections on trunks and
branches revealed darkened(B)
1． 2 致病性测定
温室内苗木接种:供试的柏木植物均生长在塑
料盆中(上下直径分别为 20 cm × 15 cm，高 20 cm，
基质为土)。从昆明市园林局苗木基地获得，柏木
实生苗 24 个月左右(每盆 1 棵苗)。每个接种植物
有 9 个重复，对照 6 个重复。柏木苗接种，方法同
参考文献［3］，使用灭菌解剖刀在距离植物基部 5
cm 处，造成一个 3 mm 深由树皮至木质部的向下倾
斜的伤口作为接种点。使用具有旺盛生长菌丝的
PDA 培养基菌块接种在伤口处，接种点用塑料膜包
裹少许灭菌脱脂棉保湿，在 3 d 后将包裹物取下，以
防止包裹处因湿度过大而自然腐烂，影响测量结果。
1． 3 病原菌形态学观察
将菌株 CWC8 接种到 PDA 平板上，于 25℃ 培
养箱中黑暗培养 7 ～ 15 d 后，肉眼观察菌落形态特
征，在光学显微镜下观察培养病菌的分生孢子形态，
并测量其大小。根据病原菌的产孢特征及其在
PDA 培养基上的形态特征，参照文献［4，5］进行病
菌鉴定。
1． 4 rDNA ITS 的 PCR扩增与序列分析
1． 4． 1 病原茵 DNA 的提取 将 CWC8 菌株接种
到 PDA 平板上进行活化，于 25℃ 培养箱中黑暗培
养 5 d 后，用灭菌的解剖针挑取菌丝体接种到盛有
PD 培养液的锥形瓶中，于 25℃ 振荡(160 r /min)培
养 5 ～ 7 d。采用四层灭菌纱布过滤菌丝体，无菌水
冲洗 4 ～ 5 次，于 60℃ 烘干，收集菌丝体，采用改良
的 CTAB 法提取 DNA［6］。
1． 4． 2 核糖体 rDNA-ITS区段扩增 PCR反应体系
(25 μL) :10 ×缓冲液(含 15 mmol /L Mg2 +)2． 5 μL，
dNTP(各 2． 5 mmol /L)1 μL，引物 ITS1、ITS4(5
μmol)各 2 μL(引物:ITS1 5-TCCGTAGGTGAACCT-
GCGG-3， ITS45-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3) ，
Taq DNA polymerase(5 U /μL)0． 25 μL，模板 1 μL，
双蒸水 18． 25 μL。②PCR 反应条件:95℃变性 5
min;95℃变性 30 s，56℃退火 30 s，72℃延伸 1 min，
共 35 个循环;72℃延伸 10 min。③检测 PCR 产物:
取 5 μL PCR扩增产物于 1． 2%的琼脂糖凝胶上电
泳检测，电泳缓冲液为 0． 5 × TBE。在 100 V 电压下
进行 1 h，电泳后的凝胶浸在 0． 5 μg /mL 溴化乙锭
染色液中染色 15 ～ 20 min，用清水冲洗后，置于
UPV 紫外成像系统上观察成像，并拍照。在每次试
验中都要设阴性对照(不含模板 DNA)。
1． 4． 3 PCR扩增产物测序 将 PCR扩增产物纯化
后与 pPCR-Script AMP SK(+)为克隆载体连接后
转化至大肠杆菌感受态细胞中，用含有 X-Gal、
IPTG、Amp LB 平板筛选，挑取白色菌落培养，并做
PCR 检测，剔除假阳性菌株，对克隆成功的 菌株样
品送上海生工做正反双向测序，利用 BioEdit软件拼
接得完整序列。将测序结果在 http:/ /www． ncbi．
nlm． nih． gov 网站上利用 BLAST 下的 nucleotide-nu-
cleotide blastn 与 GenBank 上已经发表的基因进行
对比，前后引物测序结果的两两对比也在此进行;测
序结果之间的多重比较在 DNAMAN 软件上进行
比较。
2 结果与分析
2． 1 病原菌的分离结果与形态特征观察
从各地采回的 13 个枯萎柏木共分离获得 18
株菌株，根据菌落特征发现各菌株没有明显差异，为
同一种类型的真菌。菌株 CWC8 在 PDA 上 25℃
培养 5 d的菌落直径为 70． 5 ～ 74． 5 mm，病原菌菌
丝生长迅速，气生菌丝发达，长全至皿盖。初期基质
菌丝和气生菌丝均为白色，4 ～ 6 d 气生菌丝变为灰
黑色，基质菌丝变为黑色，25 d 产生黑色的子实体
(分生孢子器)。分 生 孢 子 器 直 径 为 320． 5 ～
510． 5 μm，平均为 272． 4 μm，成熟的分生孢子为无
隔，椭圆形至纺锤形，薄壁半透明，大小为 12． 5 ～
18． 5 μm ×(4． 0 ～ 6． 5)μm(图 2)。
192 华 北 农 学 报 26 卷
A．菌落形态;B．分生孢子形态。
A． Colony on PDA;B． Conidia．
图 2 Neofusicoccum parvum形态特征
Fig． 2 Morphology of the pathogen Neofusicoccum parvum
2． 2 致病性测定
致病菌接种后 7 d 即可看到有病斑扩展，4 ～ 5
周后接种苗木出现枯萎及木质部变色症状。对接种
发病后的枯萎植株再次进行病菌的分离，均能获得
与原分离菌株一致的病原菌。对照接种未表现出任
何发病症状也未分离出任何真菌。根据柯赫氏法
则，证明接种菌 CWC8 为柏木的致病菌。
2． 3 rDNA ITS序列分析
经 18S rDNA ITS1 和 ITS4 引物对 CWC8 菌株
进行 PCR 扩增，获得了 1 条介于 500 ～ 600 bp 的清
晰条带，经测序得到了 551 bp 的 rDNA-ITS 序列
(图 3)。将该序列提交至 GenBank(Accession No:
FJ842960) ，并与其中的序列进行同源性比较。分析
结果表明，供试菌株 18S rDNA 及两侧的 ITS 区与
N． parvum 的同源性为 99． 5%。
M． Marker DL2000;1 ～ 6． N． parvum分离菌株。
M． Marker DL2000;1 － 6． The isolates are six isolates of N． parvum．
图 3 ITS扩增电泳图
Fig． 3 The electroph-oresis of ITS-PCR
3 结论与讨论
本研究于 2008 ～ 2009 年分离的 13 个病树组织
样品，病菌分离率高达 100%，获得了菌落形态特征
较为一致的菌株。将分离菌进行室内苗期接种可使
供试柏树苗发病，产生枯萎症状，回分仍得到原分离
菌，经柯赫氏法则证明该分离菌即为该病害的致病
菌。通过病菌培养形态特征观察和鉴定、18S rDNA
ITS 序列分析，将柏木枯萎病的病原菌确定为
N． parvum。
真菌的 rDNA由于存在高度保守区和可变区被
认为是目前真菌分子研究方法的理想部位。尤其是
核糖体内转录间隔区(ITS) ，它是介于 18 S rDNA、
5. 8 S rDNA 和 28 S rDNA 之间的区域，在种内不同
菌株间高度保守，而在真菌的种间存在着极大的变
化，这些变化反应在系统发育上非常直观。这些可
以为研究真菌的系统发育、分类鉴定和分子检测提
供丰富的遗传信息［7］。病原物的准确鉴定对于病
害的防治和流行预测具有十分重要的意义。柏木枯
萎病目前在云南部分地区的危害存在加重趋势，应
引起林业和园林绿化部门的重视。
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