全 文 ：铜对大叶相思2根瘤菌共生固氮体系的影响 3
聂湘平1 　蓝崇钰1 3 3 　张志权1 　束文圣1 　黄铭洪2
(1 中山大学生命科学学院 ,广州 510275 ;2 香港浸会大学生物系 ,香港 九龙塘)
【摘要】　报道了两种根瘤菌 (大叶相思、美丽胡枝子) 对 Cu2 + 的耐受性以及植物2根瘤菌共生固氮体系在
Cu2 + 胁迫下结瘤、固氮和生长的变化 ,讨论了大叶相思在矿山尾矿废弃地作为先锋植物结瘤固氮的可能
性.结果表明 ,大叶相思根瘤菌对 Cu2 + 离子的耐受性较强 ,可以耐受 Cu2 + < 0180mmol 的离子浓度 ,Cu2 +
对它的半致死浓度为 01129mmol. 在无菌砂培无重金属影响条件下 ,其固氮酶活性为 217 C2 H4·μg·g - 1·
h - 1 ,当 Cu2 + > 01125mmol 会导致大叶相思固氮酶活性急剧下降 , 其有效半抑制浓度 ( EC50 ) 为
01151mmol ,Cu2 + 为 0150mmol 完色抑制大叶相思固氮酶活性 ,不阻碍结瘤 ,但严重抑制植物生长发育 ,引
起植物叶片白化、植株矮化. 在外加 N 源不接菌和不加 N 源接菌两种处理组间 ,Cu2 + < 01125mmol 时 ,以
不加 N 接菌处理对大叶相思生长有利. 大叶相思对 Cu2 + 吸收积累根部高于地上组织.
关键词 　铜 　根瘤菌 　大叶相思 　生长 　结瘤 　固氮酶活性
文章编号 　1001 - 9332 (2002) 02 - 0137 - 04 　中图分类号 　X5031235 　文献标识码 　A
Effects of copper on rhizobia2Acacia auriculaef ormis symbiotic association. N IE Xiangping1 ,LAN Chongyu1 ,
ZHAN G Zhiquan1 , SHU Wensheng1 , HUAN G Minghong2 ( 1 School of L if e Sciences , Zhongshan U niversity ,
Guangz hou 510275 ; 2 Biology Depart ment , Hong Kong B aptist U niversity , Kow loon Tong , Hong Kong ) .2Chin. J . A ppl . Ecol . ,2002 ,13 (2) :137～140.
The effects of different levels of Cu2 + were studied individually on the growth of two Rhizobium strains and host
plant growth ,nodulation ( %) and nitrogen fixation activity in A . auriculaef ormis under solution culture condi2
tions so as to explore a probability of utilization of the genus Acacia in revegetation of Cu2 + 2contaminated land.
The results shows that Rhizobium sp . ( Acacia auriculaef ormis) had more stronger tolerance to Cu2 + iron than
Rhizobium sp ( Lespedez a f ormosa) . The values of EC50 respectively achieved 01129mmol for Rhizobium sp . and
01151mmol for the N22fixation activity. When the concentration of Cu2 + was over 0150 mmol ,N22fixation activ2
ity had been inhabited thoroughly. Although the formation of nodules of Acacia auriculaef ormis could contin2
ued ,the growth of host plant had been inhibited with the appearance such as stunting ,chlorosis. Between the
noinodulating but adding nitrogen treat group and the inodulating without any nitrogen resource treat group ,
when Cu2 + < 0. 125mmol , the latter group showed better growth for A . auriculaef ormis . There were higher
contents of Cu in the underground tissues than in aboveground tissues.
Key words 　Cu , Rhizobium sp. , Acacia auriculaef ormis , Growth , Formation of nodules , N22fixation activity.3 国家自然科学基金资助项目 (39870145) .3 3 通讯联系人.
2001 - 05 - 10 收稿 ,2001 - 12 - 15 接受.
1 　引 　　言
矿业尾矿废弃地一般环境条件比较恶劣 ,土壤
的理化性质极差 ,N、P 营养元素贫乏 ,重金属浓度
很高. 植物定居面临着多个方面的障碍 ,其中尤以 N
素的缺乏和高浓度的重金属毒害为其主要限制因
子. 因此 ,利用具有固氮能力的豆科植物作为先锋植
物以克服植物定居时 N 素缺乏是矿业废弃地生态
恢复的热点问题之一[12 ,15 ] . 广东凡口铅锌矿尾矿中
重金属 Pb、Zn、Cu、Cd 含量较高 ,N 营养元素极度缺
乏 ,几近为零[13 ] . 尾矿废弃地中重金属对豆科植物2
根瘤菌共生体生长限制 ,一方面表现为对根瘤菌种
群生长存活的影响 ;另一方面表现为对寄主植物生
长、结瘤、固氮能力不同方面的影响. 本项目研究了
华南地区主要造林树种豆科植物种 —大叶相思 ( A 2 cacia auriculaef orm is) 在 Cu2 + 不同浓度、不同处理条件下的生长、结瘤、固氮能力等方面的变化 ,以期为铅锌矿尾矿废弃地的生态恢复提供理论依据.2 　材料与方法211 　供试材料大叶相思根瘤菌 ( Rhizobia2Acacia auriculaef ormis) 、美丽胡枝子根瘤菌 ( Rhizobia2Lespedez a f ormosa)材料由中国科学院华南植物研究所丁明懋研究小组提供 ;大叶相思种子由广东省热带林业研究所提供.212 　实验条件根瘤 菌 培 养 基 采 用 酵 母 膏2甘 露 醇 琼 脂 培 养 基( YMA) [6 ] ,平板培养测定其对重金属耐性 ; 植物营养液配
应 用 生 态 学 报 　2002 年 2 月 　第 13 卷 　第 2 期 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
CHIN ESE JOURNAL OF APPL IED ECOLO GY ,Feb. 2002 ,13 (2)∶137～140
制用 Pipers 营养液[11 ] . 培养基与金属母液分别灭菌后再混
合 ,以避免重金属在高温高压下与培养基中成分络合形成难
溶鏊合物而影响金属浓度的准确性. 实验用砂培方法 ,为无
菌半封闭半开放培养 (Leonard“瓶2罐”改良法) . 实验装置见
图 1 ,装置上半部由耐高温灭菌的聚氟乙烯育苗杯 ,内容多
孔性珍珠岩 ,其底部有孔有棉蕊穿过. 装置下半部由一开口
500ml 玻璃容器 ,内装植物营养液 ,其开口要求于容器边缘
密合 ,使聚氟乙烯育苗杯 ,伸入容器离底 4～6cm 左右 ,此为
贮存器. 棉纱蕊下半浸在营养液中 ,上半穿过生长器底孔进
入珍珠岩介质中 ,使营养液可通过毛细管作用进入上半部容
器. 容器开口盖以 2～3cm 厚经干热灭菌石蜡石英砂 ,与贮
存器接口处以胶膜封口. 整个装置在 121 ℃灭菌 2～4h.
图 1 　改良 Lenoard 瓶2罐装置
Fig. 1 Improved Lenoard bottle2iar instrument .
213 　实验处理
重金属对植物结瘤及固氮酶活性影响试验处理为 A0 :
培养液中加 N ,不加重金属 ;An :培养液中加 N ,加一系列重
金属浓度 ;B0 :培养液中不加 N ,不加重金属 ,接种根瘤菌 ;
Bn :培养液中不加 N ,加一系列重金属浓度 ,接种根瘤菌. 根
据预备实验 ,设计以下重金属浓度系列 Cu ( mmol) : 0100、
01001、0101、0110、0140、0180. Cu 为 AR 级纯度.
214 　实验方法
21411 种子处理 　挑选大小均匀、饱满健康的种子 ,用 95 %
酒精淋洗 ,尔后浸入浓硫酸中软化 2～3min ,取出用蒸馏水
冲洗 10 次 ,在无菌工作台上再浸入 012 %HgC12 溶液中 2～
3min ,最后用无菌水冲洗 10 次 ,将种子取出置入灭过菌的培
养皿中于恒温培养箱中 28 ℃条件下萌发.
21412 根瘤菌菌液制备 　用 YEM 液体培养接种 ,28 ℃摇床
培养 3d ,求出其生长曲线 ,取其对数生长期菌液稀释成
106cfu·ml - 1后用于接种.
21413 接种 　选取萌发良好的种子 (刚露白 ,胚根伸出 2～
3mm)在无菌操作台上浸入根瘤菌菌悬液 1～2min[1 ] . 取出
为菌液浸润后的种子植入容器珍珠岩基质中 2～3cm 深 ,上
面加封灭过菌的石蜡石英砂 ,置于室温自然光照培养 90d
后 ,取样分析. 植物生长期间需添加植物营养液均需灭菌后
加入 ,以确保无杂菌污染. 不接种根瘤菌处理组种子浸入无
菌培养基中 ,种植同上 ,培养 90d 后 ,取样分析.
215 　生物量、叶面积及叶绿素含量测定
取样测定株高、根长、叶面积后 ,分成地上与地下两部分
于干燥箱中 60 ℃烘干 24h 称重 ,玛瑙研钵研碎 ,于干燥皿中
保存待测生物量 ;叶面积测定采用叶样剪纸称量法 ;叶绿素
含量测定采用丙酮提取法.
216 　根瘤固氮酶活性测定
每个处理中取出植物 ,洗净根部 ,吸干水分 ,小心快速地
摘取根瘤称重记录后 ,装入血清反应瓶 ,抽取 4ml 体积注入
瓶积 的 5 % 的 乙 炔 , 记 录 反 应 温 度 ( 32 ℃) , 大 气 压
(750mmHg) ,反应时间 1h ,然后注入 3ml 生理盐水终止反
应 ,抽取反应后反应瓶 0. 5ml 上柱于 Sp22305 气相色谱分析
仪上测定乙烯 ,重复 3 次记录色谱图. 计算如下 [10 ] :
乙烯体积 (ml) = 乙炔 (ml) ×乙烯峰高乙炔峰高 ×
1
衰减倍数
E = K · 12214 ×VC2H4 × 273273 + T0 C × P760 × 1W ×103
式中 , E 为固氮酶活性 (C2 H4μmol·g - 1 FW·h - 1) ; K 为反应
常数 (0. 42) ; VC2H2为乙烯体积 (m1) ; T
0 C 为反应温度 ; P 为
反应大气压 (mmHg) ; W 为进样根瘤重 (g) .
217 　全 N 及重金属含量测定
全 N 采用半微量凯氏 ( kjeldabl) 自动定氮仪[2 ] ;重金属
采用硝酸消化原子吸收分光光度法测定 [2 ] ,标准曲线工作
法.
3 　结果与讨论
311 　重金属对两种根瘤菌生长的影响
图 2 示两种根瘤菌在含不同 Cu2 + 浓度的 YMA
培养基中生长状况. 随离子浓度加大 ,根瘤菌菌落数
逐步下降 ,其有效半抑制浓度 ( EC50)分别为 :大叶相
思 01129mmol ;美丽胡枝子 01063mmol. 由此可看
出 ,大叶相思根瘤菌比美丽胡枝子根瘤菌表现出对
Cu2 + 离子更高的耐受性.
图 2 　Cu 对两种根瘤菌影响
Fig. 2 Effect of Cu on relative colony numbers of two rhizobium strains
in YMA.
312 　Cu2 + 对豆科植物大叶相思生长的影响
由表 1 可看出 ,随 Cu2 + 浓度加大 ,大叶相思茎
高、根长、叶面积、全生物量以及叶绿素、含 N 量均
呈现出不同程度的下降. Cu2 + 对大叶相思生长的影
响首 先 表 现 为 整 个 植 株 明 显 矮 化 , Cu2 + >
01125mmol 时 ,株高只有对照组的 50 % ;一般认为
植物矮化及生物量下降是植物对重金属毒害作用的
831 应 　用 　生 　态 　学 　报 　　　　　　　　　　　　　　　　　　13 卷
综合反应 ,过多摄入重金属离子与其他养分相拮抗 ,
影响植物营养元素的平衡吸收 ,同时干扰了植物光
合作用过程 ,从而阻碍植物生长[4 ,8 ,11 ,14 ] . 对根系生
长作用表现为主根伸长受抑制 ,其次表现为侧根及
须根生长受抑制 , Cu2 + > 0125mmol 时侧根数明显
减少 ,并且根毛极短 ,颜色发黑. Devos[3 ]研究表明
Cu2 +过高会导致根毛细胞膜透性改变 ,引起离子等
物质失漏 ,影响根系发育 ,表现为主根生长受阻 ,侧
根变短 ,尤其是根毛的发育. Cu2 + 对大叶相思生长
作用的特征是植株叶片明显失绿白化 ,在外加 N 源
处理组 ,当 Cu2 + > 0105mmol 叶绿素只有对照组的
50 %. Rerboredo [9 ]提出过高 Cu2 + 会破坏叶绿体结
构 ,并导致 Fe3 +～Fe2 + 变化 ,引起植物对 Fe 的吸收
和转运 ,从而导致缺 Fe 性失绿. Foy[4 ]也发现过高
Cu2 + 会促进大豆 Mn2 +的吸收和向上转移而引起毒
害 ,干扰大豆对 Fe 的吸收导致缺 Fe 失绿. 叶面积也
下降 50 % ;当 Cu2 + > 110mmol ,幼苗已无假叶柄分
化 ,仍保持出土发芽时的羽状复叶状态. 由表 1 可看
出 ,生物量及含 N 量随 Cu2 + 浓度的增加逐步下降 ,
其中生物量变化相对株高、根长及含 N 量较敏感.
表 1 　不同 Cu2 +浓度处理大叶相思幼苗的生长
Table 1 Seedling growth of Acacia auriculaef ormis in different Cu2 + concentration treatments
Cu2 +浓度
Cu2 + concentration
(mmol)
茎 　高
Shooting height
(cm)
根 　长
Root length
(cm)
叶面积
Leaf area
(cm2)
全生物量
Biomass
(g)
叶绿素含
Chlorophyl content
( FW %)
全 N 含量
Total N
(DW %)
处理组 Treatment group Cu + N Cu - N + Rh Cu + N Cu - N + Rh Cu + N Cu - N + Rh Cu + N Cu - N + Rh Cu + N Cu - N + Rh Cu + N Cu - N + Rh
01000 1918 1819 714 811 14164 13161 01485 01464 01343 01364 21617 21577
01005 1416 1513 318 611 11136 11187 01363 01365 01209 01341 21548 21561
01050 1013 1219 317 416 8126 7127 01218 01326 01117 01311 21211 21341
01125 914 816 411 415 6173 6169 01203 01197 01075 01185 11741 11813
01250 814 716 319 319 4131 4107 01153 01112 01043 01121 11429 11037
01500 714 618 317 318 3101 1198 01117 01069 0102 01037 11017 01782
11000 614 416 314 313 2138 nd 01099 01036 nd nd 01823 01431
21000 418 317 314 315 0197 nd 01057 01034 nd nd 01731 01419
　　在接种根瘤菌与不接种根瘤菌不同处理间 ,叶
绿素含量有显著差异 (α< 0105)外 ,接种根瘤菌处理
组叶绿素含量远高于不接种根瘤菌处理组 ,在不接
种根瘤菌处理组中 ,老叶、幼叶叶片均出现失绿 ,而
在接种根瘤菌处理组叶绿素失绿多为幼叶 ,这可能
与 N 利用方式有关 ,当 Cu2 + 影响到根系对营养元
素的吸收时 ,未接种根瘤菌处理组不仅表现缺 Fe 性
失绿 ,还表现缺 N 性失绿 ;而接种根瘤菌处理组仍
可利用固氮来源而表现对 N 缺乏的相对不敏感. 其
它生物量及含 N 量等指标均无显著差异. 试验表
明 ,在无外源 N 源供应条件下 ,接种根瘤菌完全能
够满足大叶相思植物生长需要.
313 　重金属在植物体内含量变化
由图 3 可看出 ,地上部分 Cu 含量随 Cu2 + 浓度
增加变化较小 ,而地下部分含量则增加很多 ,当为
210mmol 时 ,变化较大 ,地下部分含量为对照的 30
～40 倍 ;而地上部分仅为对照的 10 倍左右 ;同时
Cu2 + 含量随浓度增加 ,其地下/ 地上含量比也不断
加大 ,说明地下组织重金属积累速度大于地上组织 ,
并且 Cu2 + 迁移速度较慢. 有研究者认为 ,Cu2 + 往往
被根系分泌的有机物或络合物所结合 ,因此减少了
Cu2 + 的吸收和转运[5 ,7 ] .
314 　重金属对大叶相思结瘤及共生固氮活性的影响
不同浓度培养处理中大叶相思接瘤情况如表 2
所示 ,低浓度处理中 (01005) ,离子还表现出轻微刺 图 3 　Cu2 +在植物体地上地下不同部位含量Fig. 3 Cu2 + contents of in above and below ground portion of seedlingunder different treatments.激作用 ,有利于根瘤生长发育 ; Cu2 + 缺乏会导致根瘤内末端氧化酶活性下降 ,细胞内氧分压增高 ,影响固氮酶活性 ,抑制根瘤发育[10 ] .　　随浓度增加其结瘤百分率、结瘤个数以及根瘤重量均不断下降 ,根瘤形态也由圆、粉红色且大变为小粒状、褐色、簇生于主根 ;当 Cu2 + > 0125mmol 时 ,结瘤率虽然还有 90 %左右 ,但根瘤重只有对照的30 %左右 ,此时根瘤很小且呈黑褐色 ,已基本无固氮能力. 根瘤的发生发育与根系生长密切相关 ,根瘤菌通过分泌生长素 ,引起根毛弯曲 ,产生侵入线进而使根毛感染而结瘤[16 ] ,因此 ,如果大叶相思根系发育已严重受抑制 ,尽管根瘤菌能忍受较高 Cu2 + 浓度 ,但在这个浓度下植物已不能结瘤 ,或虽可结瘤但也
9312 期 　　　　　　　　　　　　　聂湘平等 :铜对大叶相思2根瘤菌共生固氮体系的影响 　　　　　　　　
已无固氮作用. 此外 ,Cu2 + 过高影响根系发育 ,也影
响 N、P、K、Fe 等营养元素的吸收 ,矿质元素的缺乏
也是影响大叶相思结瘤的因素之一[6 ] . 固氮酶活性
对环境因子干扰比根瘤生长发育更为敏感 ;当 Cu2 +
> 110mmol 时 ,已完全不能结瘤. 各处理组固氮酶活
性如图 4 ,固氮酶活性随浓度增加逐步下降 ,当
Cu2 + > 01125mmol 时固氮酶活性急剧下降 ,其有效
半抑制浓度 ( EC50)为 01151mmol.
表 2 　不同 Cu2 +浓度处理大叶相思幼苗接种根瘤菌结瘤生长情况
Table 2 Nodule formation of Acacia auriculif ormis inoculated with rhizobia grown in different Cu2 + concentration with N2free nutrient solution
重金属浓度
Metal
concentration
(mmol)
结瘤
Nodulati on
percent
( %)
根瘤数
Nodule
number
根瘤重
Nodule
weight
(g)
固氮酶活性
N2fixation
enzyme activity
(C2 H4μmol·g - 1·h - 1)
根瘤形态
Nodule form
根系生长状况
Root growth status
01000 100 22 01122 21721 圆柱状棒状 ;粉红色或白 ;主须根均有 主侧根茂盛
01005 100 21 01123 21713 球或柱状 ;粉红色 ;主须根均有 ,较大且多 主根发达 ,须根良好
01050 100 19 01103 21183 圆珠状 ;红色 ;主须根均有 ,中等大 主根粗短 ,须根发育不良
01125 100 15 01075 11664 圆珠状 ;红褐色 ;多长于主根 ,中等大 主根须根生长均受抑制
01250 89 7 01033 01732 小粒状 ;褐色 ;簇生于主根 ,较小 须根严重受抑制变黑
01500 55 4 01024 0153 小粒状 ;黑褐色 ;簇生于主根 ,很小 须根短小 ,很少 ,黑色
11000 0 0 0 0
图 4 　Cu2 +对大叶相思固氮酶活性影响
Fig. 4 Effect of Cu2 + on N22fixation activity of seedling nodules.
4 　结 　　论
411 　美丽胡枝子根瘤菌和大叶相思根瘤菌在含
Cu2 +的 YAM 培养基上生长 ,以大叶相思根瘤菌耐
重金属性为强 ,可以忍受 Cu2 + < 0180mmol 的浓度 ,
Cu2 + 对它的半致死浓度为 01129mmol.
412 　砂培条件下 ,Cu2 + > 0150mmol ,会严重阻碍大
叶相思的生长发育 ,引起植物矮化、白化、抑制主根
伸长和根毛发育.
413 　Cu2 + > 01125mmol ,会导致大叶相思固氮酶活
性急剧下降 ,Cu2 + > 0150mmol ,完全抑制大叶相思
固氮 酶 活 性 , 其 有 效 半 抑 制 浓 度 ( EC50 ) 为
01151mmol.
414 　大叶相思对 Cu2 + 的吸收累积地下组织高于地
上组织 ,Cu2 + 在植物体内从地下组织向地上组织的
移动性较小.
致谢 　感谢丁明懋研究小组、蚁伟民博士给予的大力支持和
帮助.
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作者简介 　聂湘平 ,男 ,1966 年生 ,博士 ,助研 ,主要从事环
境生态及环境毒理学应用基础研究. 发表论文 5 篇.
041 应 　用 　生 　态 　学 　报 　　　　　　　　　　　　　　　　　　13 卷