全 文 ：微卫星多态性检测技术及其在保护遗传学中的应用 3
晏　鹏　吴孝兵 3 3 　史　燕　张　方
(安徽师范大学生命科学学院 ,芜湖 241000)
【摘要】　微卫星是一种新型的分子遗传标记 ,具有只需极少量样品即可进行 PCR 扩增等优点 ,使之极其
适合于保护遗传学研究. 阐释了微卫星的结构、微卫星多态检测技术的原理 ,简要论述了微卫星多态检测
技术的优点及其应用 ,并介绍了一种分离动物微卫星位点的富集方法.
关键词 　微卫星 DNA 　多态性 　保护遗传
文章编号 　1001 - 9332 (2003) 03 - 0461 - 04 　中图分类号 　Q953 　文献标识码 　A
Detection technique of microsatellites polymorphism and its application in conservation genetics. YAN Peng ,
WU Xiaobing , SHI Yan , ZHAN G fang ( College of L if e Science , A nhui Norm al U niversity , W uhu 241000 ,
China) . 2Chin. J . A ppl . Ecol . ,2003 ,14 (3) :461～464.
Microsatellites are a novel molecular genetic marker ,and offer unusual advantages ,e. g. , with the using of a very
few sample , they can be amplified by PCR ,which are particularly appropriate in the research of conservation ge2
netics. In this paper ,the structure of microsatellites and the principle of the detection technique of microsatellites
polymorphism were illustrated , and the advantages and the application of this detection technique were described
briefly. For the isolation of microsatellite loci in animals ,an enrichment method was introduced. And then ,some
practical problems of this technique were summarized.
Key words 　Microsatellites DNA , Polymorphism , Conservation genetics.
3 国家自然科学基金项目 (30270213) 、安徽省自然科学基金项目
(01043501)及安徽省学术与技术带头人基金资助项目.3 3 通讯联系人. E2mail :wuxb @mail. ahnu. edu. cn
2002 - 02 - 02 收稿 ,2002 - 12 - 23 接受.
1 　引 　　言
微卫星 DNA ( Microsatellites DNA) 又称短串联重复序
列 (short tandem repeats , STRs) 或简单重复序列 ( simple se2
quence repeats ,SSRs) ,是广泛分布于真核生物基因组中的一
种特殊序列 ,主要由串联重复单元组成 ,每单元长度在 1～
10 bp 之间. 常见的微卫星如 TGTG ⋯⋯TG = ( TG) n 或
AA TAA T ⋯⋯AA T = (AA T) n 等. 在 20 世纪 70 年代 ,人们
已经知道微卫星位点存在于真核基因组中 ,但直到 1982 年
Hamada 等[17 ]在研究中发现从酵母到脊椎动物中均普遍存
在着多拷贝的多聚 (dT2dG)微卫星 DNA ,这些序列的数目之
大、存在之广才被发现. Tautz 和 Rentz 证实了这一发现 [35 ] .
尽管从发现到现在只有二三十年的时间 ,但由于微卫星
具有种类多、多态性高、进化速度快及呈简单的孟德尔共显
性遗传等优点 ,使其在基因作图、种群遗传学、医学及亲缘关
系鉴定等研究领域得到极为广泛的应用 [7 ,29 ,36 ] . 微卫星迅速
成为了一种应用极广的新型分子遗传标记 ,尤其是在针对濒
危物种的保护遗传学研究中 ,微卫星具有的只需极少量样品
即可进行 PCR 扩增等优点使它有着极为广阔的应用前景.
2 　微卫星多态的检测技术
211 　微卫星 DNA 的结构及其多态性分析原理
微卫星 DNA 由核心序列和侧翼序列组成. 其核心序列
呈串联状重复状排列 ,中间无间隔 ,每个重复单元长度在 1
～10 bp 之间 ,重复序列长度在几十到几百个 bp 之间. 由于
重复单元的数目不同 (即片段长度存在差异) ,而使微卫星呈
现出多态性. 侧翼 DNA 序列位于核心序列的两侧 ,为保守的
特异单拷贝序列 ,能使微卫星特异地定位于染色体常染色质
区的特定部位 (图 1) .
侧翼 DNA 　　　　　　　　　重复单元 　　　　　　　引物 2 　Primer 2
Flanking DNA 　　　　　　　Repeat Units 　　　 ←GCTTA GCCGACTA23′
5′2GATCCGTCGATGTAAGACACACACACACACACACACACTCCGAATCGGCTGATC23′　
3′2CTAGGCAGCTACATTCTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGAGGCTTAGCCGACTAG25′　
5′2TCCGTCGATGTAA →　　　　　　　　　　　　　　　　　　　侧翼 DNA
引物 1 　Primer 1 　　　　 　　　　　　　　　　　　　　Flanking DNA
图 1 　一个典型的含 AC 微卫星位点的序列
Fig. 1 Sequence of a typical AC microsatellite locus.
　　微卫星 DNA 突变率较高从而产生了很多的等位基因 ,
导致了其高度的多态性. 但对这种高突变率的遗传机制目前
尚不清楚 ,大多认为主要是由于 DNA 复制过程中出现错误
所致 ,即 DNA 聚合酶在复制重复区域时“滑动”( slips) 造成
重复单元数目的改变 [18 ,24 ] .
　　由于微卫星的 DNA 侧翼序列几乎都是呈单一性的 ,因
此任何特异的微卫星位点都可以用这种特异的单拷贝侧翼
DNA 序列来加以鉴定. 在进行微卫星位点分离时 ,一旦微卫
星位点被成功地克隆及测序之后 ,与侧翼序列相互补的引物
对就可以被设计出来 (图 1) . 利用设计好的引物 ,特异的微
应 用 生 态 学 报 　2003 年 3 月 　第 14 卷 　第 3 期 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
CHIN ESE JOURNAL OF APPL IED ECOLO GY ,Mar. 2003 ,14 (3)∶461～464
卫星位点通过 PCR 可被简便快速地扩增. 之后根据不同等
位基因之间的长度差异 ,利用高分辨率的非变性聚丙烯酰胺
凝胶电泳将它们区分开来. 由于微卫星 DNA 呈孟德尔共显
性遗传 ,故检测时扩增带为一条的是纯合子 ,扩增带为两条
的则是杂合子. 这正是利用微卫星多态检测技术来进行各项
研究的基础.
212 　动物 DNA 微卫星位点的分离方法
　　实现微卫星位点的有效扩增有赖于获得与其侧翼序列
互补的引物. 在对所研究物种已存在的微卫星引物寻找未果
的情况下 ,获得所需的微卫星位点有两种方法. 一是利用侧
翼序列的保守性 ,寻找与所研究物种亲缘关系较近的物种的
引物 ,即简并引物 (degenerate primers) ,加以利用. 二是针对
一些未知的特异微卫星位点 ,利用常规分子生物学方法对所
需的微卫星位点进行克隆及测序 ,自行设计出引物.
　　在第 2 种方法中 ,首先要利用含微卫星的基因组片断构
建一个基因组文库 ,然后利用设计好的探针进行杂交 ,筛选
出阳性克隆再进行测序. 在基因组文库中至少需要获得大约
5000 个重组子 ,这是由于含有微卫星的重组子比例仅有
0. 5 %～2 %. 传统的分离微卫星方法依赖于对大量重组子的
筛选检测 ,以此来确定含有微卫星的少量重组子 ,周期长且
工作量较大. 针对这种情况一系列的富集方法被提
出[19 ,26 ,30 ] . 这些方法可使含有微卫星的重组子克隆数目提
高 10～100 倍 ,极大地缩短检测时间 ,使在短时间内对潜在
的数百个微卫星位点进行鉴定成为可能. 下面简要介绍
Kandpal 等[19 ]的富集分离方法. 主要包括 PCR、用生物素标
记的微卫星探针杂交、对富集片段的收集 3 种技术.
21211 基因组片段的扩增 　如同传统的微卫星分离方法一
样 ,首先要用能进行四碱基剪切的限制性内切酶 (如 MboI
等)对基因组 DNA 进行充分的消化 ,以产生大量长度在 300
～500 bp 之间的基因组片段 ,进行长度筛选. 因为这样的大
小无论是对于微卫星 DNA 组分的保留 ,还是利用足够的微
卫星侧翼 DNA 区域来设计 PCR 引物都恰到好处. 而在第 2
步中 ,并不像传统的分离方法那样对经过长度选择后的基因
组片段进行直接克隆 ,而是利用连接反应为基因组片断添加
连接子序列. 这些连接子作为 PCR 的引导位点 ,可以保证基
因组 DNA 进行 PCR 扩增. 第 3 步 ,进行第 1 次 PCR 扩增. 应
注意的是由于连接子只有一条链和基因组共价相联 ,在
PCR 反应中应首先开始一个延伸的步骤 ,以便让 Taq 聚合
酶将基因组 DNA 和连接子序列之间的切口愈合.
21212 靶 DNA 的收集 　首先 ,将第 1 次扩增产物与生物素
化的靶分子 (即探针 ,如 CA、CA G 和 A GA T 等简单重复序
列)进行杂交 ;然后将杂交产物加入生物素结合基质中 ,包含
探针的靶 DNA 就会与生物素结合基质相结合 ;紧接着进行
两次强严格性的洗脱 ,其中第 1 次洗脱是将没杂交的基因组
DNA 去除 ,第 2 次洗脱是将靶 DNA 分子由生物素结合基质
中分离 ,要注意的是这时得到的还只是单链 DNA 分子 ;随后
进行第 2 次 PCR 反应 ,以获得双链的 DNA 分子 ,这时已不
再需要第 1 次 PCR 中的延伸步骤 ;最后 ,利用 MboI 消化第
2 次扩增产物以清除连接子序列. 这样就获得了较为丰富的
含微卫星的 DNA 片段. 在靶 DNA 的收集和 PCR 过程中 ,通
过额外重复几次有助于提高含微卫星基因组的 DNA 产量.
21213 连接及转化 　进行标准的连接反应及转化反应 ,克隆
的载体可以是噬菌体型也可以是普通的质粒.
21214 测序及引物的设计 　对重组子进行检测后进行 DNA
测序 ,即可得到包含微卫星位点的序列及其侧翼序列 ,由此
微卫星的 PCR 引物可被设计出来.
213 　微卫星 DNA 多态检测技术的优点
21311 样品使用量降低 　与利用传统的 DNA 指纹技术不
同 ,微卫星位点可进行 PCR 扩增 ,从而使样品的使用量减
少 ,因此可被用于非损伤性取样所获得的样品分析 [23 ] . 例
如 ,同样用于一次 DNA 指纹分析的 DNA 量可被用来扩增至
少 100 个微卫星位点[36 ] . 这对于濒危物种的研究和保护工
作尤其适合 ,因为损伤性取样和过多的人为影响对野外物种
的保护都是不利的. 由于无需与动物进行直接的接触 ,使从
更深入的角度来进行种群统计、种群动态及社会结构等研究
成为可能. 同时 ,传统上一些不适合进行分析的微量组织样
品 (如毛发[33 ] 、羽毛[20 ] 、粪便[13 ]等)也被用于基于 PCR 扩增
技术上的微卫星多态分析.
21312 扩大了样品来源 　由于微卫星序列短小 ,即使在已发
生降解的 DNA 样品中 ,仍有可能扩增出一些微卫星位点. 这
使得一些保存较差的样品成为具有重要利用价值的研究材
料 ,如动物干标本、浸制标本以及石蜡切片等. 在博物馆鸟标
本的分析利用[11 ]及人类遗体的鉴定方面[10 ] ,微卫星 DNA
的这种特性已得到应用.
21313 新型的遗传标记 　微卫星已成为大规模遗传作图研
究领域中最重要的一类遗传标记. 微卫星数量及种类丰富、
分布广泛 ,具有高度多态性 ;而且突变率较高 ,每个位点可能
都有很多的等位基因存在 ,即使在一些等位酶多样性较低的
生物中也是如此 [36 ] . 它已被广泛地应用在从人类到蚊子等
众多物种的基因连锁作图研究当中 [2 ] . 同时 ,微卫星作为遗
传标记还能对很多物种的数量遗传位点进行鉴定 ,这些遗传
标记在法医学案例的研究中已被证明极具价值.
21314 引物的通用性 　微卫星位点可以在很多的物种中较
容易地获得. 可通过直接对种的特异性位点的分离来获得 ;
或者利用已分离出的相近物种的引物来获得 [5 ,21 ] . 这是微卫
星所具有的一个极具潜在价值的特征 ———从一个物种所产
生的引物可被用于近缘物种定向同源位点的扩增 [10 ] ,而这
一特征一般来讲是小卫星 ( Minisatellite DNA) 所不具有的.
研究表明 ,微卫星位点中的一小部分即使在亲源关系非常远
的分类群间也是保守的. 这在生态学和濒危物种的保护研究
方面显得尤为重要 ,因为在微卫星的鉴定和特性记述上研究
人员无需再花费更多的时间和精力 ,可以充分利用来自其它
近缘物种的引物.
21315 操作的简便性 　作为遗传体系 ,微卫星 DNA 相对更
适宜进行自动化操作. 在一个单独的 PCR 反应中可能会有
多达 5 个位点的多重扩增 ,而在一些较为乐观的体系中 ,每
264 应 　用 　生 　态 　学 　报 　　　　　　　　　　　　　　　　　　14 卷
个个体甚至能达到多至 15 个位点的多重加样. 绝大多数在
市场上能见到的 DNA 自动测序系统 ,在提供较强测序能力
的同时 ,还附有针对特异片段的分析软件 ,这也使得对微卫
星的分析变得更为简便.
3 　微卫星在保护遗传学中的应用
311 　种群杂合度检测
　　利用等位基因在大小或频率上的差异可用来检测濒危
物种在种间或亚种间杂交所造成的影响. 埃塞俄比亚狼
( Canis simensis)是世界上最濒危的犬类动物 ,与当地的野狗
种群存在着广泛的杂交现象. Gottelli 等 [15 ]利用 9 个犬类的
微卫星位点对两个不同地点的杂交种群进行了微卫星分析 ,
结果表明 ,埃塞俄比亚狼仅占了远交犬类杂合度及等位基因
多态性的大约 30 %～40 % ,且平均每个位点只有 2～3 个等
位基因 ,远低于在狗中检测到的数目. 同时发现在雌埃塞俄
比亚狼和雄狗之间存在着较高程度的杂交现象 ,然而很多埃
塞俄比亚狼的等位基因在当地狗中并未检测到 ,反映出这两
个物种存在着种间特异的等位基因的差异.
312 　对历史种群的推测
　　保护遗传学不仅涉及对种群内部遗传多样性的测定 ,同
时也包括对那些由于近亲自交而呈现低多态性的种群在理
论上所面临的灭绝危机研究 [4 ] . 因此 ,目前针对濒危物种的
保护遗传学研究 ,已经把相当多的研究重点转移到了对在一
个明确的历史前后联系 (historical context) 背景下所获遗传
多样性的阐释上. 在一项针对圣克莱门特岛一种伯劳 ( L a2
nius ludovicianus mearnsi) ,这一加利福尼亚海湾岛屿特有的
濒危亚种的研究中 ,Mundy 等[25 ]对现有种群和 1915 年的一
些标本进行了微卫星多态的检测. 通过对现有种群和历史种
群微卫星多态的分析 ,发现目前存在于圣克莱门特岛上的种
群所具有的多态性只有大陆种群的 60 % ,与大陆种群之间
的基因流动水平极低 ;该亚种绝大多数的多态性在近年来种
群数量锐减之前已经丧失 ,只有 20 %的多态性降低在现存
样本中可被检测出.
313 　种群间的异质性分析
　　对于一些在进化史上已分离了较长时间的种群 ,通过对
其中微卫星位点分布的检测可以对基因流动 ( gene flow) 进
行相关的分析. Paetkau 等[27 ,28 ]利用 8 个微卫星位点以生活
在加拿大的 4 个北极熊种群为对象 ,对在一些大型食肉动物
种群中表现出的较低多态性水平进行了研究. 通过对 8 个微
卫星位点的检测发现 ,这 4 个种群中具有相当丰富的遗传多
样性 ,且所有种群均是显著分化的 ,分化水平大体反映出了
地理分布. 据此认为来自地理学上的基因流动模式并不明
显 ,所反映的可能是独特的扩散路径 (dispersal routes) .
314 　繁殖成功率、社会结构和近亲自交程度
　　微卫星具有高度的遗传多样性 ,因此在一些濒危的自然
种群中 ,利用微卫星多态检测技术可以很好地对社会结构和
遗传结构之间的联系进行分析. 较高的突变率使得微卫星的
等位基因在个体间几乎不可能完全相同 ,十分适合于鉴定种
群内的亲缘关系及近亲自交程度. 微卫星多态检测技术在一
些社会性结构的膜翅类昆虫研究中已应用得较为普遍 [3 ,31 ] .
在濒危灵长类动物的研究中 ,Morin 等 [22 ]通过利用 20 个人
源微卫星位点的非损伤性基因型检测 ,对关于黑猩猩社会行
为的假说进行了验证 ,并且利用 8 个位点微卫星对同一种群
中个体间的亲缘关系进行了鉴定. Altman 等 [1 ]用 10 个微卫
星位点和 2 个等位酶位点对草原狒狒进行了模式分析 ,深入
研究了其独特的社会结构及亲缘关系.
4 　微卫星 DNA多态检测技术存在的问题
　　尽管微卫星广泛存在于真核生物中 ,但从某些生物中获
得微卫星的过程极其困难. 这在许多植物以及几个无脊椎动
物种群 ,例如鳞翅目动物 [32 ] ,某些双翅目及腹足类动物的研
究中已得到证实.
　　在对由非损伤取样法获得的一些样品进行微卫星位点
基因型检测时 ,仍存在着一定的困难 ,如毛发、粪便样品. 由
于每个位点一般仅存在于每个细胞的一个拷贝之中 (与线粒
体 DNA 检测时的多拷贝恰好相反) ,会带来随机扩增的问
题 ,尤其是在要求严格的实验条件被改变的情况下. 在这种
情况下会有一些异常现象出现 ,如等位基因的“中途退出”
(allelic“dropout”,指一个或两个等位基因的随机不扩增现
象) [12 ] ;非特异性的扩增片段对所研究位点的分析造成影
响[33 ,34 ] ;由于在扩增过程中滑动发生得较早造成假象片段
在终产物中占多数 [13 ] .
　　Taq 聚合酶在扩增过程中的滑动 (slippage) 会造成与预
期结果相差大约 1～5 个重复单元的不同长度产物出现 ,这
在单核苷酸和双核苷酸微卫星位点表现得更为明显 ,从而给
等位基因的分析带来困难 [14 ] . 一般来讲 ,这样的扩增产物与
正常的相比并不那么紧凑 ,故在实际检测时一般会被发现.
但如果一个杂合个体的扩增产物发生重叠 ,则会造成很难将
真实产物和滑动产物 (slippage products)区分开[9 ] .
　　最近的研究表明 ,微卫星在自动测序凝胶上进行电泳并
被自动确定长度时 ,电脑得出的结果与真正长度存在差异 ,
造成单个碱基变化以及额外的大小估计问题 [8 ,16 ] . 这种不精
确的等位基因鉴定可能是由于 Taq 聚合酶向扩增产物的 3’
末端添加一个额外 dA TP 的倾向所导致 [9 ] .
　　在种群研究中 ,某些等位基因由于在引导位点上的替
换、插入、删减 ,或其它等原因所造成的无法扩增可导致无效
等位基因 (null allele) 的出现[6 ,27 ] . 例如 ,一个含有两个不同
微卫星等位基因的杂合子 ,如果等位基因中的一个由于引物
退火困难而造成无法扩增 ,那么该杂合子的表现型在凝胶上
就会显现出是单链的纯合子. 因此 ,无效等位基因会给种群
研究及亲子鉴定等带来困难.
　　在对所获微卫星数据的分析上还缺乏一个能得到广泛
认可的进化模型. 目前已有逐步突变模型 ( stepwise mutation
model , SMM ) 和双相突变模型 ( two phase mutation model ,
TPM)等模型提出 ,但它们均不能适用于所有微卫星数
据[37 ] .缺少这样一个内容充实的模型 ,在利用等位基因的频
3643 期 　　　　　　　　　　　晏 　鹏等 :微卫星多态性的检测技术及在保护遗传学中的应用 　　　　　　　　
率分布进行推断时就很困难 ,且无法准确地对遗传分化进行
数量分析 ,也就很难解释所观察到的物种间等位基因在长度
和多态性方面存在的差异. 在很多的保护遗传学研究中 ,遗
传分歧与最近的遗传漂变、瓶颈现象及近亲交配所造成的影
响相关的 ,这也是与突变相对应的. 因此对突变机制的研究
还需要给予更多的关注.
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(in Chinese)
作者简介 　晏 　鹏 ,男 ,1976 年生 ,硕士 ,主要从事动物分子
生态及保护生物学研究 ,发表论文 1 篇. Tel :055323878727 ,
E2mail : toyanpeng @yahoo. com. cn
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