全 文 ：ARD RA 对植物根瘤内共生放线菌
Fra nkia 多样性的研究 3
吴少慧 3 3 　张惠文　熊　智　刘　忠　张忠泽　张成刚
(中国科学院沈阳应用生态研究所 ,沈阳 110016)
【摘要】　应用原核生物 16S rDNA 特异性引物 rD1 和 fD1 ,通过 ARDRA (amplified ribosomal DNA restriction
analysis)法直接扩增自中国云南、东北地区赤杨属 3 种植物和沙棘属 1 种植物根瘤内 Frankia DNA ,得到一长
约 1500bp 的扩增产物. 选用两种内切酶 Hae Ⅲ、Afa Ⅰ联合对扩增产物进行酶切 ,得到稳定的酶切图谱. 将所测
48 个感染赤杨的 Frankia 样本区分为 3 个不同的组 ,所测 43 个感染沙棘的 Frankia 样本区分为 3 个不同的组.
显示根瘤内 Frankia 存在丰富的遗传多样性.
关键词 　赤杨 　沙棘根瘤 　Frankia 　多样性 　ARDRA
文章编号 　1001 - 9332 (2001) 06 - 0883 - 04 　中图分类号 　Q939113 　文献标识码 　A
Biodiversity of Frankia strains in nodules from Alnus and Hippophae by ARDRA. WU Shaohui ,ZHAN G Huiwen ,
XION G Zhi ,L IU Zhong ,ZHAN G Zhongze ,and ZHAN G Chenggang( Institute of A pplied Ecology , Chinese Academy
of Sciences , S henyang 10016) 2Chin. J . A ppl . Ecol . ,2001 ,12 (6) :883～886.
16S ribosomal DNAs(rDNAs) of total 91 samples of Frankia strains in root nodules from A lnus and Hippophae were
ampilified by PCR with primer rD1 and fD1. A fragment about 1500bp long was obtained. The amplicons were digest2
ed by Hae Ⅲand Afa Ⅰ together and run in agarose gels. As a result ,48 A lnus2infected Frankia were distinguished
into three different groups and 43 Hippophae2infected Frankia into three different groups ,respectively. The results
showed that there is great genetic diversity among the Frankia strains directly from root nodules.
Key words 　A lnus , Hippophae nodule , Frankia , Diversity , ARDRA.
　　3 国家自然科学基金 (39870038) 和中国科学院 ( K29512131210) 资
助项目.
　　3 3 通讯联系人.
　　2000 - 12 - 27 收稿 ,2001 - 6 - 25 接受.
1 　引 　　言
放线菌 Frankia 属植物能够在干旱、沙丘 ,湿地 ,
沼泽 ,冻原等[3 ,4 ]多种环境中生长. 其生物多样性的研
究有助于人们更清楚其起源和进化 ,为生物物种的分
类、进化研究提供有益的资料 ,也有助于人们加强对环
境资源的认识、保护和利用.
自 1978 年 Callaham 首次获得 Frankia 纯培养以
来 ,曾用回接实验[11 ] 、血清学分析[12 ] 、全细胞可溶性
蛋白分析[1 ] 、G + C %分析及分子生物学技术 ,如 IGS2
RFL P 分析[2 ] , nod、nif 基因的 RFL P 分析[21 ] , rDNA
序列分析[9 ]等对其多样性进行了研究. 但由于分纯菌
株有限 ,加之分纯过程中特性改变 ,极大地限制了自然
态下 Frankia 的生物多样性的研究. ARDRA (ampli2
fied rDNA restriction analysis) 技术是美国最新发展起
来的一项现代生物鉴定技术 ,即扩增原核生物 16S rD2
NA 保守序列[15 ] ,并进行酶切 ,通过酶切图谱分析菌
间多样性. 最早用于细菌分类与分型、病源菌特性分析
等[14 ,17 ] . 根瘤内 Frankia 及纯培养 Frankia 16S rDNA
特异扩增已有报道[5 ,10 ,19 ] ,但仅限于 16SrDNA 中 300
～400bp 长的部分序列 ,或 16S rDNA 与 23S rDNA 间
的序列 ,完整的 ARDRA 用于根瘤内 Frankia 多样性
还需进一步的研究. 本文首次用 ARDRA 法研究了中
国主要的放线菌结瘤植物沙棘和赤杨根瘤内 Frankia
的生物多样性.
2 　材料与方法
211 　根瘤的采集
自中国东北和云南地区的 10 个采样位点 ,采集赤杨属 3
个树种 ,沙棘属的 1 个树种 (表 1) . 采集的样本用去离子水清洗
瘤瓣 ,用 70 %乙醇去除瘤瓣表面杂菌 , - 20 ℃保存备用.
212 　Frankia DNA 提取
取约 15 个瘤瓣尖 (约 15mg) ,按 Bousquet [8 ]等方法用 70 %
乙醇去除表面杂菌 ,用柳叶刀仔细去除外层 ,放于研钵中加
600μl 2 % CTAB 裂解剂 ( 2 % [ w/ vol ] 三甲基溴化乙烷 ,
100mmol·L - 1 Tris HCl [p H810 ] ,20mmol·L - 1 EDTA ,114mmol
·L - 1 NaCl) 研磨均匀 ,移入 115ml 离心管中 , 65 ℃水浴裂解
2h ,7000r·min - 1离心10min ,吸出上清 ,去除残渣 . 取100μl上
应 用 生 态 学 报 　2001 年 12 月 　第 12 卷 　第 6 期 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
CHIN ESE JOURNAL OF APPL IED ECOLO GY ,Oct . 2001 ,12 (6)∶883～886
表 1 　根瘤采集
Table 1 Collection of nodule samples
采样位
点编号
Site code
种名
Species
采样地
Location
海拔高度
Elevation
(m)
坡度
Slop
样本数
Number of
samples
采样位点描述
Site
description
1 沙 　棘 青峰建平 < 200 N 0° 5 河边 ,坡地
2 沙 　棘 建平、朝阳 < 200 N 10° 13 湿地
3 沙 　棘 建平沙海 < 200 S 20° 7 山脚
4 沙 　棘 沈阳新民 < 200 N 15° 8 沙丘地
5 沙 　棘 沈阳十里河 < 200 W 20° 3 沙化草场
6 沙 　棘 沈阳植物园 < 200 E 0° 3 板结土壤
色赤杨 沈阳植物园 N 0° 7 板结土壤
7 色赤杨 大连瓦房店 < 200 N 10° 9 河边 ,坡地
8 色赤杨 丹东草河口 < 200 N10° 7 湿地
9 沙 　棘 吉林长白山 700 E10° 1 林地
沙 　棘 吉林长白山 900 N10° 1 林地
沙 　棘 吉林长白山 1600 W10° 1 林地
沙 　棘 吉林长白山 2500 N 15° 1 林地
毛赤杨 吉林长白山 700 N10° 15 林地
10 冬赤杨 云南武定 2300 N 0° 1 红壤
冬赤杨 云南武定 2400 N 15° 1 黄红壤
冬赤杨 云南武定 2600 N 10° 1 红壤
冬赤杨 云南寻佃 2100 N 0° 1 暗红壤
冬赤杨 云南寻佃 1600 N 20° 1 纯林 ,红壤
冬赤杨 云南寻佃 1800 E 20° 1 两年生苗
冬赤杨 云南寻佃 1800 S 15° 1 6 年生苗
冬赤杨 云南金佃 1600 W10° 1 山脊
冬赤杨 云南金佃 1700 S 20° 1 山脊
冬赤杨 云南金佃 1823 S 15° 1 山脊 ,暗红壤
沙棘 Hippophae;色赤杨 A lnus tinctoria ;冬赤杨 A lnus nepalensis ;毛赤杨 A lnus hirsuta. 下同
The same below.
清液用植物根瘤内痕量 Frankia DNA 提取法提取 [20 ,6 ] .
213 　Frankia 16S rDNA PCR
用一对原核生物特异引物 fD1 和 rD1[18 ] 扩增根瘤内
Frankia 16S rDNA 全序列[5 ,10 ] . 引物序列分别为 :fD1 5′2A GA
GTT TGA TCC TGG CTC A G23’,rD1 5′2AA G GA G GTG A TC
CA G CC23′. 反应总体积为 40μl : 含 115μl DNA 模板 ,4μl 10 ×
PCR buffer ,2μl 115mmol·L - 1 MgCl2 , 2μl 012mmol·L - 1 Dntp ,
012μmol·L - 1 引物 rD1 , 012μmol·L - 1 引物 ,fD12 个单位 Taq
DNA 聚合酶 ( Takara. Biotech. Co. ) . PCR : 首先 95 ℃变性
2min ,然后 94 ℃ 45s ,55 ℃1 min ,72 ℃2min. 35 个循环后最后
72 ℃延伸 6min. PCR 产物在 115 %琼脂糖凝胶上电泳 ,溴化乙
锭染色. 可获得 1 条 1500 bp 长的扩增带.
有的样本有非扩增的小分子杂质 ,需进一步切下胶条用
NaI法纯化回收. 即把胶条加到含 600μl 6mol·L - 1 NaI (900μl
6mol·L - 1NaI [ Promega. Co. ] ,100μl 10 ×TBE) 和 10μl 石英粉
( d = 5～ 10μmol·L - 1 ) [ Promega. Co ] 的小管中 , 56 ℃. 水浴
10min ,离心 12000 ×g 15s ,吸弃上悬液 ,沉淀物用 70 %乙醇洗 2
次 ,晾干沉淀物 ,加入 20μl 超纯水 ,56 ℃水浴 10min ,离心 ,取上
清液备用.
214 　酶切
取含有 1500bp 特异扩增产物的上清液 ,用 6 种内切酶
Hae Ⅲ、Hha Ⅰ、Hinf Ⅰ、Msp Ⅰ、A f a Ⅰ和 Xho Ⅰ,酶切 20h. 酶
切后产物在 8 % PA GE上电泳 ,银染.
3 　结果与讨论
311 　Frankia 16S rDNA 特异带的扩增
引物 fD1 和 rD1 扩增 Frankia 16S rDNA ,获约
1500bp 长的扩增带 (图 1) .
图 1 　Frankia 16S rDNA 扩增
Fig. 1 Amplified Frankia 16S Ribosomal DNA.
原核生物特异的引物 fD1 和 rD1 扩增 Frankia 16S rDNA ,获约 1500bp
片段 1 1 为φX1742 Hae ⅢMarker , 1353 , 1078 , 872 , 603 bp ,2～7 为位
点 6～10 的赤杨 Frankia 样本 ,8～11 为位点 1～6 及 9 的沙棘 Frankia
样本. PCR with a pair of universal prokaryotic2specific primer rD1 and fD1
amplified a 1500 bp length sequence of Frankia 16S rDNA from nodule mi2
crosymbionts of A lnus spp . and Hippophae spp . Lane 1 ,φX1742 Hae Ⅲ
Marker , 1353 , 1078 , 872 , 603 bp . Lanes 2 to 7 is the pattern generated
from A lnus2infected Frankia in Site 6～101 The pattern in lanes 8 to 11 is
the pattern generated from Hippophae2infected Frankia samples in Site 1
～6 and 9.
312 　酶切赤杨 Frankia 特异 1500bp 片段
选用了 6 种内切酶 ,其中 Hae Ⅲ和 A f a Ⅰ联合使
用时可把所测 48 个赤杨 Frankia 样本分成 3 个
ARDRA 图谱组 (图 2、表 2) . Hae Ⅲ、Hha Ⅰ、Hi nf Ⅰ、
Msp Ⅰ、A f a Ⅰ和 Xho Ⅰ分别单切时所获酶切片段较
少 ,稀有酶切位点 ,无法涵盖所有样本. Hae Ⅲ和 A f a
Ⅰ联合使用结果较好.
表 2 　赤杨根瘤 Frankia ARDRA组
Table 2 Distribution of Alnus2infective Frankia ARDRA groups
组
Group
共生植物种
Host species
采样位点
Location
样本数
Number of
samples
1 色赤杨 A . ti nctoria 采样位点 6～8 23
毛赤杨 A . hi rsuta 采样位点 9 15
2 冬赤杨 A . nepalensis 采样位点 10 8
3 冬赤杨 A . nepalensis 采样位点 10 2
总计 Total 5 48
　　采样位点 6～9 所测的 38 个赤杨 Frankia 样本有
相同的 ARDRA 图谱 ,与采样位点 10 内的 10 个样本
图谱差异较大. 采样位点 10 内的 10 个样本图谱间差
异较小 ,其中 8 号与 10 号样本在 281 + 271 bp 处有一
条带 ,而其它 8 份样本在此处无带.
由表 2 可见 ,采样位点 6～9 (东北地区) 38 个赤
杨 Frankia 样本有相同的图谱 ,定义为 ARDRA 组 1 ,
采样位点 10 有 10 个不同海拔高度和另一种赤杨
Frankia 样本 ,属于 2 个不同的 ARDRA 组. 实际上 ,
采样位点10云南地区赤杨 (除8和10号样本外 ) 的8
488 应 　用 　生 　态 　学 　报 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　12 卷
图 2 　Hae Ⅲ and A f a Ⅰ联合酶切赤杨 Frankia 1500bp 特异片段
ARDRA 图谱
Fig. 2 ARDRA fingerprints generated after Hae Ⅲand A f a Ⅰtogether di2
gestion of amplified Frankia 1500 bp length sequence from nodule mi2
crosymbionts of A lnus spp .
5 为φX1742 Hae Ⅲ Marker , 1353 , 1078 , 872 , 603 , 310 , 281 + 271 ,
234 , 194 bp , 1 到 4 为采样位点 6～9 赤杨 Frankia ARDRA 组 1 ;6 到
13 为采样位点 10 赤杨 Frankia (除 8 号和 10 号样本) ARDRA 组 2 ;14
和 15 为采样位点 10 中 8 号和 10 号赤杨样本 ARDRA 组 3. Lane 5 ,
φX1742Hae Ⅲ Marker , 1353 , 1078 , 872 , 603 , 310 , 281 + 271 , 234 ,
194 bp1The pattern in lanes 1 to 4 is the ARDRA group 1 pattern that was
generated from A lnus2infected Frankia in Site 6～91 The pattern in lanes
6 to 13 is the ARDRA group 2 pattern generated from A lnus2infected
Frankia samples in Site 10 except for the eight and tenth samples. The pat2
tern in lanes 14 and 15 ( the eight and tenth samples. in Site 10) is the
ARDRA group 3 pattern.
个 Frankia 样本 , 具有相同的 ARDRA 图谱 , 为
ARDRA 组 2 ,8 号为 ARDRA 组 3.
　　赤杨属的同一种植物冬赤杨 ( A l nus nepalensis)
(采样位点 10 ,云南昆明) 能与不同 Frankia 株或型结
合 ,不同种植物色赤杨 ( A l nus ti nctoria) (采样位点 6
～8 ,辽宁) 和毛赤杨 ( A l nus hi rsuta) (采样位点 9 ,吉
林长白山)可与有相同图谱的 Frankia 株结合共生 ,并
且这些有相同或相似图谱的 Frankia 株或型有较广的
地理分布范围.
313 　酶切沙棘 Frankia 特异 1500bp 片段
选用了 6 种内切酶 ,其中 Hae Ⅲ和 A f a Ⅰ联合使
用时可把所测 43 个沙棘 Frankia 样本分成 3 个
ARDRA 组 (图 3、表 3) . Hae Ⅲ、Hha Ⅰ、Hi nf Ⅰ、Msp
Ⅰ、A f a Ⅰ和 Xho Ⅰ分别单切时所获酶切片段较少 ,稀
有酶切位点 ,无法涵盖所有样本. Hae Ⅲ和 A f a Ⅰ联合
使用结果较好.
　　ARDRA 用于细菌、病源菌等的分类鉴定已有报
道 ,纯培养及根瘤内 Frankia 的分类研究也有报
道[14 ,17 ] ,但在 16S rDNA 序列中所选区间各有不同 ,
所扩片段不同. 如只在 16S rDNA 序列中扩增一段 300
～400bp 大小的片段 ,然后测序分析其碱基差异. 本文
应用原核生物 16S rDNA 特异性引物 rD1 和 fD1 ,通过
ARDRA 法首次直接扩增自中国云南、东北地区赤杨
属3种植物和沙棘属1种植物根瘤内 FrankiaDNA ,
图 3 　沙棘 Frankia ARDRA 图谱
Fig. 3 ARDRA fingerprints generated after Hae Ⅲand A f a Ⅰtogether di2
gestion of amplified Frankia 1500bp length sequence from nodule mi2
crosymbionts of Hippophae spp .
1 为φX1742 Hae Ⅲ Marker , 1353 , 1078 , 872 , 603 , 310 , 281 + 271 ,
234 , 194 bp ,2～6 为采样位点 1～6 沙棘 Frankia ARDRA 组 6. 7、8 和
10 为采样位点 9 沙棘 Frankia 组 4. 9 为采样位点 9 沙棘 Frankia
ARDRA 组 5. Lane 1 ,φX1742 Hae Ⅲ Marker , 1353 , 1078 , 872 , 603 ,
310 , 281 + 271 , 234 , 194 bp . The pattern in lanes 2 to 6 from Hip2
pophae2infected Frankia in Site 1～6 is the ARDRA group 6 pattern1 The
pattern in lanes 7 , 8 and 10 is the ARDRA group 4 pattern generated from
Hippophae2infected Frankia samples in site 9. The pattern in lane 9 is the
ARDRA group 5 pattern generated from Hippophae2infected Frankia sam2
ples in site 9.
表 3 　沙棘根瘤 Frankia ARDRA组
Table 3 Distribution of Hippophae2infective Frankia ARDRA groups
组
Group
共生植物种
Host species
采样位点
Location
样本数
Number of
Samples
4 沙棘 Hippophae 采样位点 9Site9 1
5 沙棘 Hippophae 采样位点 9Site 9 1
4 沙棘 Hippophae 采样位点 9Site 9 1
4 沙棘 Hippophae 采样位点 9Siete 9 1
6 沙棘 Hippophae 采样位点 1～6Site1～6 39
总计 Total 7 43
得到一长约 1500bp 的扩增产物. 选用两种内切酶 Hae
Ⅲ和 A f a Ⅰ联合对扩增产物进行酶切 ,得到稳定的酶
切图谱. 将所测 48 个感染赤杨的 Frankia 样本区分为
3 个不同的组 ,所测 43 个感染沙棘的 Frankia 样本区
分为 3 个不同的组.
尽管组间图谱不同 ,但彼此享有大多数的共同带 ,
显示较近的亲缘关系. 所有 48 个赤杨根瘤样本采自三
个不同赤杨树种. 东北地区的色赤杨和毛赤杨根瘤
Frankia 享有相同图谱 ,而云南冬赤杨根瘤 Frankia
有两种不同的图谱.
所有 43 个沙棘根瘤样本为同一种沙棘植物 ,采样
位点 9 内的 4 个样本采自长白山 700～2500m 不同的
海拔高度 ,显示了 2 种不同的 ARDRA 图谱 ,而其它采
自相同海拔高度的 39 个沙棘样本有相同的图谱.
感染同一种沙棘或赤杨的 Frankia 株可有不同的
多态图谱 ,而感染不同种赤杨的 Frankia 样本可有相
同的多态图谱. 由此可得出 ,与植物共生的 Frankia 有
5886 期 　　　　　　　　　　　　吴少慧等 :ARDRA 对植物根瘤内共生放线菌 Frankia 多样性的研究 　　　　　　　　　
丰富的生物遗传多样性. Clawson[10 ]和 Benson[5 ]也观
察到与 Eleagnus 属共生的 Frankia 同时也能与 Ca2
suarinaceae、Betulaceae 和 Myricaeae 共 生 固 氮 结
瘤[7 ,16 ] . 有相同图谱的 Frankia 能结瘤相距较远采样
位点 (半径 300km 范围内 ,辽宁地区) 的同种植物显
示 ,自然状态下某些 Frankia 株的宿主植物分布范围
较广. 结果也显示根瘤内 Frankia 的多样性可能与样
本采集地点、地势高度、坡度、土壤质地等环境因素 (如
表 1 所列位点描述)有关. 已有两篇文献也观察到了不
同的图谱确与宿主所在的地势、海拔高度有相关
性[10 ,13 ] . 推测不同海拔高度上温度和降雨量等的不同
导致了更多的 Frankia 多样性.
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作者简介 　吴少慧 ,女 ,1963 年生 ,博士. 主要从事微生物资源
及固氮工作 ,发表论文 20 余篇. E2mail : wushaohui @hotmail.
com
688 应 　用 　生 　态 　学 　报 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　12 卷