全 文 ：费氏中华根瘤菌( Sinorhizobium f redii )
的多样性研究*
陈明周 谢福莉 周俊初* * (华中农业大学农业部农业微生物重点实验室,武汉 430070)
摘要 用大豆品种Willimas 和黑龙 33 从多年种植大豆未接种根瘤菌的土壤中捕集大豆根瘤菌, 从分离株中
选出 50 株费氏中华根瘤菌,对供试菌株的培养特性、生长速度、耐酸、耐碱性、生长最终 pH 值、天然抗药性、CN
源利用、刚果红吸收强度、产黑色素能力和质粒图谱类型进行了系统的比较研究, 并通过聚类分析得到树状图
谱, 证实了不同土壤中费氏中华根瘤菌的多样性.
关键词 费氏中华根瘤菌 多样性 聚类分析
文章编号 1001- 9332( 2001) 04- 0597- 04 中图分类号 Q935, Q939. 11 文献标识码 A
Diversity of Sinorhizobium fredii strains. CHEN Ming zhou, XIE Fuli and ZHOU Junchu ( The K ey L aborator y of A
gr icultural M icrobiology , H uazhong Agr icultural Univer sity , Wuhan 430070) . Chin. J . A pp l . Ecol . , 2001, 12( 4) :
597~ 600.
Rhizobial str ains w ere isolated from soils g rowing with soybean cultivar Heilong 33 and Willimas. Fifty Sinorhiz obium
f redii strains were chosen, and their biolo gical char acteristics including g rowth velocity, acidalkali endurance, resis
tance of intrinsic antibiotics, utilization of carbon and nitr ogen sources, absorption of congo red, ability of melanin pro
duction, and plasmid profiles were comparatively researched. The dendrogram was descr ibed using the method of cluster
analysis, and t he biodiversit y of Sinorhiz obium f redii from different soils w as proved.
Key words Sinorhiz obium f r edii, Diversit y, Cluster ing analysis.
* 欧盟 INCODC资助项目( ERBIC970191) .
* * 通讯联系人.
2000- 02- 21收稿, 2000- 06- 12接受.
1 引 言
根瘤菌多样性的研究一直受到广泛重视. 20世纪
80年代,有人综合运用多种方法对根瘤菌自然群体的
多样性进行系统的研究, 比较性状主要包括培养特征、
生化特性、天然抗药性、共生有效性、细胞蛋白组成、同
工酶、质粒图谱和 G+ C mol%含量等. Beynon等[ 1]将
一个由 236株菜豆根瘤菌组成的群体分为 54个不同
的抗性类群. Young[ 9]首先将同功酶技术引入根瘤菌
多样性研究中. Broughton[ 2]用质粒标记考查了苜蓿根
瘤菌的遗传多样性. Scholla等[ 5] 1984年将快生型大豆
根瘤菌定为新种并命名为 R . f redii , 陈文新等[ 3] 1988
年根据对快生型大豆根瘤菌的数值分类与分子生物学
特性的比较研究结果, 建立了中华根瘤菌( Sinor hiz o
bium )新属并将其重新命名为费氏中华根瘤菌 ( S .
f redii ) .由于快生型大豆根瘤菌主要从我国分离, 其
多样性研究相对较少.本研究以从河南花园口、山东潍
坊分离的 50株快生型大豆根瘤菌为材料,检测了其生
物学特性、质粒图谱类型,并借助计算机进行聚类分群
以比较研究其多样性和复杂性.
2 材料与方法
21 供试菌与培养条件
选用经分离、纯化并回接原宿主大豆结瘤的 50 株费氏中
华根瘤菌与标准菌株 USDA205 进行比较分析, 各菌株编号、来
源与质粒类型参见表 1. 供试培养基采用 YMA[ 7] , 质粒检测时
用 PA, 培养温度为 28 ! .
22 研究方法
221 根瘤菌代时的测定 用 Somasegarm 与 Hoben 的方法[ 6] .
222 最终 pH 值测定 将在 YMA 平板活化好的根瘤菌接一
环于 20ml的 YMA 试管中 ( pH7. 0)于 28 ! 摇床培养 5~ 7d 后
用 Beckman 32 型 pH 计测定培养基的终 pH 值.
223 耐酸与耐碱性测定 用 HCl和 NaOH 分别将 YMA 液体
培养基的 pH 值调节到 pH4. 5、7. 0 和 9. 0, 分别接种 3 个试管
并经摇床培养 5~ 7d 后测定菌液的 OD值.
224 天然抗药性 ( IAR) 的测定 供试新霉素、链霉素、利福
平、氯霉素和四环素溶解后经过滤除菌制成贮存液. 测定时按
抗生素的终浓度计算应加入的贮存液量, 准确加入 YMA 培养
基中, 摇匀制成所需浓度的平板. 将培养至对数期的供试菌用
灭菌生理盐水制成菌悬液, 用多点接种器接种抗性平板, 每个
菌设 3 次重复和阳性对照, 28! 培养 5~ 7d 后观察结果.
225 产黑色素能力的测定 将活化的根瘤菌在TY+ Tyr ( 12mg∀
ml
- 1
) + CuSO4( 40ug∀ml- 1)的平板上划线培养 5~ 7d 后滴加 10%
的SDS( TBE Buffer配制 pH8. 2) ,24h后观察菌落颜色变化.
226 刚果红吸收强度的测定 将活化的根瘤菌在 YMA+ 刚
果红的平板上划线, 28! 培养 5~ 7d 后, 观察菌株颜色变化.
应 用 生 态 学 报 2001 年 8 月 第 12 卷 第 4 期
CHINESE JOURNAL OF APPLIED ECOLOGY, Aug . 2001, 12( 4)#597~ 600
表 1 供试根瘤菌
Table 1 Strains tested
菌株*
S train
宿主
Host
地理来源
Origin
质粒型
Type of plasmid
HH2 黑龙 33 H eilong 33 花园口 Huayuankou 3
HH3 黑龙 33 H eilong 33 花园口 Huayuankou 3
HH4 黑龙 33 H eilong 33 花园口 Huayuankou 6
HH9 黑龙 33 H eilong 33 花园口 Huayuankou 3
HH10 黑龙 33 H eilong 33 花园口 Huayuankou 5
HH11 黑龙 33 H eilong 33 花园口 Huayuankou 5
HH13 黑龙 33 H eilong 33 花园口 Huayuankou 3
HH17 黑龙 33 H eilong 33 花园口 Huayuankou 3
HH19 黑龙 33 H eilong 33 花园口 Huayuankou 5
HH30 黑龙 33 H eilong 33 花园口 Huayuankou 5
HH24 黑龙 33 H eilong 33 花园口 Huayuankou 5
HH26 黑龙 33 H eilong 33 花园口 Huayuankou 3
HH22 黑龙 33 H eilong 33 花园口 Huayuankou 1
HH27 黑龙 33 H eilong 33 花园口 Huayuankou 5
HH34 黑龙 33 H eilong 33 花园口 Huayuankou 7
HH29 黑龙 33 H eilong 33 花园口 Huayuankou 7
HHG31 黑龙 33 H eilong 33 花园口 Huayuankou 6
HHG35 黑龙 33 H eilong 33 花园口 Huayuankou 7
HW2 黑龙 33 H eilong 33 潍坊 Weifang 5
HW3 黑龙 33 H eilong 33 潍坊 Weifang 2
HW4 黑龙 33 H eilong 33 潍坊 Weifang 1
HW5 黑龙 33 H eilong 33 潍坊 Weifang 1
HW1 黑龙 33 H eilong 33 潍坊 Weifang 5
HW8 黑龙 33 H eilong 33 潍坊 Weifang 5
U SDA205 8
HW13 黑龙 33 H eilong 33 潍坊 Weifang 2
HW14 黑龙 33 H eilong 33 潍坊 Weifang 5
HW15 黑龙 33 H eilong 33 潍坊 Weifang 5
HW18 黑龙 33 H eilong 33 潍坊 Weifang 2
HWG18 黑龙 33 H eilong 33 潍坊 Weifang 5
HW19 黑龙 33 H eilong 33 潍坊 Weifang 1
HW20 黑龙 33 H eilong 33 潍坊 Weifang 2
WH 1 Willimas 花园口 Huayuankou 2
WH 2 Willimas 花园口 Huayuankou 2
WH 3 Willimas 花园口 Huayuankou 2
WH 5 Willimas 花园口 Huayuankou 3
WH 6 Willimas 花园口 Huayuankou 2
WH 11 Willimas 花园口 Huayuankou 2
WH 16 Willimas 花园口 Huayuankou 2
WHG20 Willimas 花园口 Huayuankou 3
WHG21 Willimas 花园口 Huayuankou 5
WW7 Willimas 潍坊 Weifang 2
WW1 Willimas 潍坊 Weifang 5
WW5 Willimas 潍坊 Weifang 5
WW12 Willimas 潍坊 Weifang 5
WW13 Willimas 潍坊 Weifang 4
WW14 Willimas 潍坊 Weifang 2
WW4 Willimas 潍坊 Weifang 4
WW2 Willimas 潍坊 Weifang 4
WW3 Willimas 潍坊 Weifang 4
WW6 Willimas 潍坊 Weifang 5
* 第一个字母代表宿主植物,第二个字母代表来源, 第三个字母代表从
10倍高稀释度下的土壤悬液中分离的菌株,数字为菌株编号. The first
letter represents host , the second represents source, the third represents
st rains isolated from h igh dilut ion soil solution.
227 C 源和 N 源利用测定 参照White[ 8]法,将 10ml经过滤
除菌或 110! 15min 灭菌的 1%浓度的供试 C 源和 0. 75ml无 C
基础培养基B 组分加入融化并冷至 50~ 60 ! 的 90ml的无 C 基
础培养基 A组分中, 使 C 源终浓度为 0. 1% , 供试菌浓度为 108
∀ml- 1 ,用无菌水洗 3 次后用多点接种器接种平板, 各菌 3 个重
复同时设 YMA 和不加 C 源的对照, 28 ! 培养 5d 和 7d 后各记
录 1 次结果. N 源试验方法同 C 源测定, 但需要用甘露醇取代
NaNO 3制成无 N 基础培养基,供试 N 源的终浓度为 0. 1% .
228 根瘤菌质粒的检测 根瘤菌质粒的快速检测采用修改
过的 Eckhardt方法[ 4] .
229 聚类分析 进行数值分类前将供试性状转换为数字性
状.如根据供试菌株的生长情况, 可将能生长或在供试平板上
形成典型菌落者记为∃ 1% , 否则记为∃ 0% . 然后采用∃ NTSYSpc
1992 Applied Biostatics, Inc%软件,以平均连锁法( UPGMA)聚类
系统自动生成树状图谱.
3 结果与分析
31 代时和最终 pH
以标准菌株 U SDA205为代表测定其培养过程中
菌数与光密度值( OD)的对应关系并绘制出相关性曲
线.结果表明, 50个菌株的代时均在 2. 0~ 5. 0h之间,
大部分集中在 2h左右.菌株培养 7d后用酸度计测定
最终 pH 范围为 5. 03~ 6. 78,与已报道的费氏中华根
瘤菌相同.
32 pH 值对生长的影响
供试菌株在 pH7. 0和 9. 0时生长良好,在 pH4. 5
时不能生长.
33 天然抗药性( IAR)
供试菌对 5种抗生素的天然抗性测定结果表明,
所有菌株对新霉素 ( 10g ∀ml- 1 )、利福平 ( 10g ∀
ml- 1)、氯霉素( 10g∀ml- 1)和四环素( 0. 1g∀ml- 1 )表
现抗性.大多数菌株对链霉素( 10g∀ml- 1)也表现抗
性,除菌株 HH4和HW5对四环素( 1. 0g∀ml- 1)表现
抗性外,所有菌株均对四环素( 1. 0g∀ml- 1)敏感.
34 产黑色素和刚果红的吸收能力
测定结果表明, 用大豆品种黑龙 33捕获的菌株绝
大多数产生黑色素,而自大豆品种Willimas 分离的菌
株大多数不产生黑色素. 大多数菌株能在不同程度上
吸收刚果红,只有菌株WW3例外,不吸收刚果红.
35 C源和 N 源利用
对13种供试 C 源利用的测定结果表明, 所有菌
株均能利用甘露醇和甘油作为唯一 C 源生长, 绝大多
数菌也能利用丁二酸钠、葡萄糖、乳糖、山梨醇. 卫茅
醇、丙酮酸钠和糊精却不能为供试菌株利用. 在 10种
供试 N 源中, 只有精氨酸、谷氨酸和色氨酸几乎不被
利用. 丙氨酸、酪氨酸、( NH4) 2SO4 和 KNO3 是最好的
N 源,半胱氨酸和甲硫氨酸也是较好的 N 源,其利用
率均大于 75%.
598 应 用 生 态 学 报 12卷
36 质粒图谱
供试菌株的质粒快速检测结果表明, 供试菌株均
含有 1~ 5 个质粒, 而且绝大多数菌株含有 400 ~
500M d的大质粒.以 USDA205的 4 个质粒作分子量
(70, 120, 230和 250Md) [ 14]为对照, 估算出每个菌株
质粒的分子量, 然后根据质粒的数目和大小将它们归
入7个不同的质粒类型(表 2) .部分菌株的质粒图谱
见图 1.
由表 2可见, 50株供试菌的质粒组成十分丰富,
其中含 3个质粒的菌株最多,占 60%并分属于 3个质
粒型,含 2 个质粒的占 26% ,含 4和 5个质粒的仅为
4%、含 1个质粒的只占 6% .
37 聚类分析
从图 2可看出, 全部供试菌株在 76%的相似水平
上聚在一起, 在87%的相似水平上所有菌株聚为8个
表 2 供试菌株的质粒类型
Table 2 Plasmid types of strains tested
质粒型编号
Number of
plasm id type
代表菌株
Representative
st rain
每型菌株数
Number of
st rains
质粒分子量
Molecular w eight
of plasmid( Md)
1 HW19 3 270
2 HW18 13 460, 230
3 WH 5 10 450, 250, 150
4 WW13 4 480, 230, 200
5 HH30 16 450, 270, 170
6 HH4 2 450, 230, 110, 70, 40
7 HH29 2 400, 230, 120, 80
图 1 部分菌株的质粒图谱
Fig. 1 Plasmid prof iles of S . f redi i st rains.
A) HH 29, B) WHG20, C ) HW5, D) WH 5, E ) HW18, F ) HH30, G) US
DA205, H)HW19, I) HH 4, J)HW13, K) HH2, L) WW13.
类群, 其中群 &包含 37 个菌株, 相似性达 90% . 在
92%的相似性水平上, 将群 &可再分为 A、B 两个亚
群,其它群包括菌株数较少, 分布也较为分散,三两成
群或单个成群. 从地理来源分布看,来自河南花园口的
菌株分别处于群 & ( A)、& ( B)、∋、(、)、∗、+ 和 ,
中,且在& ( A)和 & ( B)中占大多数;自山东潍坊分离
的菌株分别处于群 & ( A)、& ( B)、∋和 − 中, 也在 &
(A)和 &( B)中占大多数, 说明来自河南花园口的菌株
表现了更大的多样性. 从宿主植物来看,自黑龙 33分
离的菌株分别位于群 & ( A)、& ( B)、∋、(、)、∗、+
和,中,而来自Willimas的菌株却只位于群 &( A)、&
( B)和 − 中,说明自黑龙 33分离的菌株表现出了更大
的多样性.
图 2 供试菌株的数值分类树状图
Fig. 2 Dendrogram of num erical classif icat ion of st rains tested.
1) HH29, 2) WW3, 3)HH3, 4) HH4, 5)HH19, 6) HH13, 7)HHG31, 8)HHG35, 9)HH 34, 10) HW19, 11) HH24, 12 )HH17, 13) HW5, 14) WW14, 15) HW1,
16) HW13, 17) HW15, 18) HWG18, 19) HW20, 20) WH1, 21) WHG21, 22) WW7, 23) WW1, 24) WW5, 25) WW2, 26) WW6, 27) HW4, 28 )HW8, 29) HW3,
30) HW2,31) HH26, 32) WW4, 33)HH 9, 34) WH11, 35) WH16, 36 )HW14, 37) WH18, 38) WH3, 39) WH2, 40 ) WH5, 41 ) WH6, 42) WHG20, 43 ) HH 30,
44) WW12, 45) WW13, 46)HH27, 47) HH22, 48)HH11, 49) HH10, 50)HH2.
5994 期 陈明周等:费氏中华根瘤菌( Sinorhiz obium f r edii )的多样性研究
38 鉴别特征的选择
从本研究群的菌株中找出出现频率.95%的特
征,并将该群 95%以上的成员均表现为正反应的特征
记为∃ + %,均表现为负反应的特征记为∃ - %. 出现频率
介于 6% ~ 94%的特征记为∃ / %(表 3) .
表 3 各群菌株的鉴别特征
Table 3 Distinctive features of strains grouped
鉴别特征
Distinct ive feature
& ( A) & ( B) ∋ ( ) ∗ + − ,
链霉素 St reptomycin / / + + + - + + -
四环素 T et racyline - / - - - + - - -
黑色素 Melanin / - + / + + + - +
刚果红 Congo red + + + + + + + -
山梨醇 Sorbitol + + + - + + + + +
阿拉伯糖 Arabinose / / + + + - + + -
葡萄糖 Glucose + + + + + + - + +
丁二酸钠 Sodium succinate + + + + + + - + +
乳 糖 Lactose + + + - + + + + +
果 糖 Fructose + + + / / + + + +
麦芽糖 Maltose + + + / / + + + +
甲硫氨酸 Methionine / / + + + - + + -
丙氨酸 Alanine + + + + - + + + -
精氨酸 Arginine - - + - - - - + +
谷氨酸 Glutam ic acid - - + - - - - + +
色氨酸 T ryptophan - - + - - - - + +
KNO 3 + + + + + + - + +
( NH4) 2SO 4 + + / + + + - + +
酪氨酸 T yrosine + + + + - + + + -
半胱氨酸 Cysteine / / + + + - + + -
+ Posit ive reaction, - Negat ive react ion, / Part ially posit ive or negat ive
react ion.
从表 3可以看出,群 &( A)、& ( B)、(、)、∗和 +
的菌株不能利用精氨酸、谷氨酸和色氨酸; 群 & ( A)、
∋、(、)、∗和 +的菌株对四环素敏感;群∗和,的菌
株对链霉素敏感且不能在以阿拉伯糖为唯一 C 源的
培养基上生长; 群& ( B)和 − 的菌株不产生黑色素;群
+不能在以 KNO3、NH4( SO4) 2 及群 ,不能在以酪氨
酸或半胱氨酸为唯一 C源的培养基上生长, 说明各类
群菌株的表型多样性.
4 结 论
41 本研究从生物学特性和质粒图谱两方面比较分
析了来自两种土壤、两个大豆品种的费氏中华根瘤菌
的多样性. 其相似性极高, 在对抗生素抗性、CN 源利
用上相同,但在产黑色素上有一定差异.宿主和地理位
置来源相同的菌株也并未完全聚在一起, 说明来源于
同一土壤、同一宿主的菌株的表型性状却不同;而来源
于不同土壤、不同宿主植物的菌株却可一致.
42 所有菌株的质粒组成也具有多样性.来自于同土
壤、同一宿主植物的不同根瘤菌出现了不同的质粒型.
43 供试菌株的表型性状与质粒型之间不存在明显
的相关性.于树状图谱同一群的菌株,其质粒型也呈现
出多样性;属于同一质粒型的菌株可分属于不同的群.
如菌株HH22、WH6、HH2、WW13、HW14的表型性状
一致,属于同一群却分别属于第 1、2、3、4 和第 5质粒
型;菌株 WW3 和WW13 属于第 4 质粒型, 其表型性
状却有差异,也分别属于不同的群.
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作者简介 陈明周,男, 1975 年生, 在读博士生, 主要从事微生
物多样性和生物固氮的分子遗传学方面的研究, 发表论文多
篇. Email: mzhouchen@ hotmail. com
600 应 用 生 态 学 报 12卷