全 文 ：应 用 生 态 学 报 年 ! 月 第 ∀ 卷 第 # 期
∃% &∋ ( ) ( ∗+, − ∋ . / + 0 . 11/ &( 2 ( ∃+ /〔只二3 , +4 5 6 7 , ∀ 8# 9 : ; 一 ; <
( = > ?≅ Α 菌在非豆科放线结瘤植物
根际内的存活与分布 关
林建群 张忠泽 苏凤岩 王育英 李维光
8中国科学院沈阳应用生态研究所 , 沈阳 ! !巧 9
&摘要 Β提取 几 Χ展故 菌 7ΔΕ − ∋ . , 制备具专一性的寡核昔酸探针 , 通过同源杂交 , 在人工
接种的木麻黄根际 内检测 出痕量 几视>? 故 菌 6 结果表明 , 厂沁>? 必 可在环境因子的作用下
被动迁移 6 不论接种点的位置如何 , 经 7 个月的时间稳定后 , 其分布状态基本相同 , 主要
集中于土层下 Φ 一 ;! ∃ = 处 6
关键词 凡视>? 故 分子生态学 杂交 根际
)Χ ΕΓ ≅Γ Α Η Α > Ι Ι ≅Δ 5Ε≅ϑ Χ 5≅Κ > Κ Λ 矛’ΕΧ >? 白 ≅> 5Ε ΚΙ Χ Μ ΜΙ ≅> ΕΝ ≅Ο ΚΔ 1ΝΜ代 Κ Λ Α 4 5≅> Κ ΕΝ妞Α Η 1ΗΑ > 5Δ 6 /≅>
∗≅Α > Π Χ> , Θ ΝΑ > Ρ ΘΝΚ > Ρ Ο Μ , ) Χ 0Μ > Ρ ΣΑ > , Τ Α > Ρ 3 Χ Σ≅> Ρ Α > Ι / ≅ Τ Μ≅Ρ Χ Α > Ρ 8&>Δ 5≅5 Χ 5Μ ΚΛ .户洲诫石刀及必 , , 凡义Ι 叨之必 ) ≅>。 , 从价, ,茗 ! ! < 9一以 ≅> · ∗ 6 八妙Υ 6 皿飞记 6 , 7 , ∀ 8# 9 : ; 一
; < 6
ς Ε Α Μ Μ 0, 5Θ>? ≅Α ≅> 5ΝΜ ΕΝ ≅ΟΚ Δ ΩΝΜ Ε Μ Κ Λ 汤‘ΧΑ Ε ≅>Α 4Χ > > ≅儿动 Α = 故>Α 4Α > ϑΜ Ι Μ 5Μ4 5ΜΙ 5ΝΕΚ 吃Ν
Ν ΣϑΕ≅ Ι≅ΟΑ 5≅Κ > Κ Λ 厂’Ε8 Υ戒故 7 )Ε− ∋ . Ξ ≅5Ν Δ卿 5Ν Μ5≅Μ ΔΩΜ 4 ≅Λ≅Μ 4Κ = ΩΗΜ = Μ> 5 Α ΕΣ Κ Η≅Ρ Κ> Χ Μ ΗΜΚ 5≅Ι ΜΔ 6
ς Ν Μ ΕΜΔ Χ Η5Δ Δ ΝΚ Ξ 5ΝΑ 5 厂9飞Υ成≅Α ΑΕ Μ = ≅Ρ Ε Α 5ΜΙ Χ > Ι ΜΕ 5ΝΜ ≅> ΛΗΧ Μ > Μ Μ Κ Λ Μ> Γ ≅ΕΚ > = Μ > 5ΑΗ ΛΑ Μ5ΚΕΔ 6 .≅ 5Μ Ε
7 =Κ > 5Ν Δ , 5Ν Μ ≅Ε Ι ≅Δ 5Ε≅ ϑΧ 5ΗΚ > Δ 一> Ι ≅ΛΛΜ Ε Μ > 5 ≅> Κ4 Χ ΗΑ 5≅Κ > ΩΚ ≅> 5Δ ΑΕ Μ ΔΑ = ≅ΗΑ Ε , Α > Ι ΜΚ > ΜΜ > 5ΕΑ 5≅> Ρ Α 5 Δ一 ;! Μ = ΔΚ 一 ΗΑ ΣΜ Ε 6
Ψ Μ Σ Ξ Κ Ε Ι Δ 几 Χ , Ο?故 , Ζ Κ ΗΜ Μ Χ ΗΑ Ε Μ ΜΚ ΗΚ Ρ Σ , % Σϑ Ε ΗΙ ≅ΟΑ 5≅Κ > , − Ν≅ΟΚ ΔΩ Ν ΜΕ Μ 6
引 言
非豆科树木共生固氮是一种重要的生
物固氮资源 , 在森林 营造 中发挥了重要的
作用 6 非豆科共生固氮效率取决于共生体
8植物和菌 9相互作用 , 并受生长环境制约 6
经多年的深人研究 , 人们 已基本了解 了水
分 、养分 、通气等宏观因子对共生效率的影
响 6 但对作用机理 , 特别是环境条件对根际
0八Θ> ?故 存活 、 生 长 、 分布 的影 响研究 较
少 , 主要是缺乏相应的研究手段 6 深人研究
上述问题 6 将有助于了解 凡长 [Η? 故 菌感染
和结瘤过程 , 制定有效地管理措施 , 充分发
挥固氮效率 , 满足生产实践的需要 6
目前世界上对 凡视 ΕΗ? ΗΑ 菌在土壤中的
动态研究 , 多 以结瘤情况作衡量指标 6 Φ!
年代末 , 随着生物技术的发展 , 实现 了对微
量菌 体 的 检测 6 荷 兰 % ΑΝ > 等 ∴;Β 比 较
凡双 > ?≅Α 及其他放线菌 7 )Ε − ∋ . 序列 , 标
出差异 , 以此合成寡核昔酸探针 , 检出了微
瘤中的 凡视欣故 菌 , 为深人研究弗氏菌的
生 态 学 奠定 了 基 础 , 但 用 此 技术 揭 示
于沁 、?ΗΑ 在土壤和根际内的活动状况尚未
见报导 6 本文应用改进的寡核昔酸探针技
术 , 对 几双 ,Η? ΗΑ 菌在 自然环境下的动态变
化作了细胞跟踪研究 , 以查 明其在根际的
存活及分布特点 6
, 国家自然科学基金 、国家科委和中国科学院资助
项目
< 年 Υ 月 ; ! 日收到 , 7 年 月 ; 日改回 6
; Υ 应 用 生 态 学 报 ∀ 卷
Υ 材料与方法
Υ 6 菌种及培养条件
几 Χ >? 必 % 01∃ ∃ &;分离自木麻黄 8∃乃妞月>Α
4Χ > >≅ 护妙口= 必二 96 用有氮 ]Α Ω 培养基 , ΥΦ ℃ 振荡
8Φ ! 甲= 9培养 ∀ 一 ! Ι , 离心收集菌体 ∴ Φ Β 6 水洗 Υ
次 , 匀浆 , 定量悬于水中供接种 6
Υ 6 Υ 供试苗的栽培
将经沙培长至 # 一 7 。= 高的木麻黄苗 , 分别
移栽于长培养管 、短培养管8 株⊥ 管9和 平板培养
箱8图 9 内, 土层厚度分别为 ;! 、 和 Φ 。= , 置温
室内 , 室内光照时间 7 Ν · Ι 一 ‘, 温度 7 一 ΥΦ ℃ 6 每
日浇水 8接菌后表层接种组从表层浇水 , 深层接
种组从底部将水注人 , 均将水面控制在土层高度
的 ⊥ ; 以 下 9 6 每 Υ 周 注人 次 ⊥# 强 度 的
% Κ ΑΡΗ Α> Ι 无氮培养液 ·
行号 Υ 6 < < < ! Υ 6 < 8。= 9
· 荟 苦 荟 · 开
Υ , 并 并 务 6 关
; _ _ _ 林 _ _
! · 资 圣 釜 6 ,
图 平板培养箱栽苗 、接种及取样位置8第 ; 行仅标出
取样位置 9
0 ≅Ρ 6 Η 以昭ΕΑΟ> Κ Λ 默Ι Η≅> Ρ Δ , ≅> Κ4 Χ ΗΑ 5≅Κ > Α > Ι ΔΑ = Ω Η≅> Ρ
ΗΚ4 Α 5≅Κ >Δ ≅> Μ Χ Η5 ΧΕΜ 8ΔΑ = Ω Η≅> Ρ ΗΚ4Α 5 ≅Κ > < = ΑΕ ?ΜΙ Κ > ΗΣ ≅>ΕΚ Ξ ∋ Κ 6 ; 9 6
‘ 栽苗位置 )Μ ΜΙ Η≅> Ρ Δ ΗΚ4 Α 5≅Κ > , · 接种位置 &>Κ4 ΧΗΑ 石Κ >ΗΚ4 Α 5≅Κ > 6 _ 取样位置 )Α = Ω Η≅> Ρ ΗΚ4Α 5≅Κ > 6
Υ 6 ; 接种方式
移栽后 周 , 分 # 组处理接种小苗 6 对照组 87
支短管9不接菌 [ 表层接种组 87 支短管 , ; 支长
管9在表层下 。= 处接人 ! 6 ! 14 Γ · 管一 ’的菌
量 [ 深层接种组 87 支短管 , ; 支长管9在距表层
Φ 、Υ< 4 = 处接人 ! 6 ! 1∃ Γ · 管 一 的菌量 [ 培养箱
接种组的接种深度为 6 < 。= , 每处接菌量为 ! 6 !
1∃ Γ 8图 9 6
Υ 6 # 供试土样的采集
培养 7 个月后 , 将培养管表层厚 ! 6 < 4 = 的土
弃之 , 沿管的中轴线每 Υ 。= 取样 份 6 培养箱土
样每行均从左边接种点开始 , 由左至右每隔 < 4=
用自制取样器取样品 份8图 Η 9 6 采集的土样密
封于塑料袋中, 一 Υ! ℃保存 6
Υ 6 < 土样中几祖>? 必 − ∋ . 的提取∴∗
定量土样用 1]) 缓冲液离心洗涤 次后 , 加
人适量 ς ( 缓冲液 8Ω%∀ 6 Υ 9 , 冰浴 中超 声破碎
87! Ξ , ;! < 次, 共 < 次9 6 ;! ! 甲= 离心 , 将上清
液移至另一离心管中 , 再于原管中加人少许 ς (
缓冲液 , 重复离心洗涤 Η次 , 将 Υ 次上清液合并 6
加人等体积的的酚 : 抓仿, 异戊醇8Υ< : Υ# : 9
混合液, 振荡 < 而 > , 静置 < 而 > , ;Υ! = ≅> 分相, 将水相移至另一离心管中 6 重复上
述过程直到相界面的白色蛋白沉淀消失 6 在得到
的水相中加人等体积的氯仿振荡 < =≅ > , 静置 <
=≅ > , ; 分相 6 取水相加人 Υ 6 <
倍冰冻乙醇 , 一 Υ!℃沉淀 Υ # Ν , Υ !!! 印= 离心 Υ <
= ≅> , 弃乙醇 , 加人 # ℃ ς ( 缓冲液重溶沉淀, 加Υ 6 <
倍体积的冰冻乙醇 , 再加人 ; ⎯ Η· / 一 ‘的乙酸钠
8Ω% ) 6 Υ9 至终浓度为 ! 6 ; =Κ 卜/ 一 ‘, 混匀 , 一 Υ!℃
贮存备用 6 使用时 , Υ !! ! ΕΩ = 离心 Υ < = ≅> 沉淀
− ∋ . , 弃乙醇 , 用 ς ( 缓冲液溶解 − ∋ .6
Υ 6 ‘ − ∋ . 的检测
配制浓度为 ! 6 ∀ 的琼脂糖凝胶 , 采用 ! 6 < Ψ
ς ]( 为电泳缓冲液 , 将 − ∋ . 样品混于加样缓冲
液8#! 蔗糖 , ! 6 Υ< 浪酚蓝 9后 , 加人到样品槽
中, 在 # Γ · 4= 一 ‘的电压降下泳胶 , 待浪酚蓝泳动
至一定距离后 , 停止电泳 , 取出凝胶 , 加入适量的
浓度为 ! 6 < 拜Ρ · = Η一 ‘的嗅化乙锭液, 染色 # ! = ≅>
后 , 将凝胶转人无菌水中浸泡 Υ! = ≅> 6 置凝胶于
紫外观察仪上 , 观测澳酚蓝带前缘的 − ∋ . 荧光
亮团 6
Υ 6 ∀ 探针的选择 、标记
% Α Ν>8 Φ9 的研究结果表明, 探针 ( 01 可特
异性的识别赤杨 属的 凡Χ >? 必 及木 麻黄属的
4 4& ; 菌, 因此本实验选用 了 ( 01 探针 ∴;Β 6 其碱基
序列为 : < ’ α ∃. α α .∃∃〔:ς ς . ∃α α . ς ∃∃ ; ’ , 试
验用探针由中国科学院微生物所合成 6
将 6 Υ 户Η寡核昔酸探针 8< Ω = Κ Η· 拜一 9, Υ 6 #
群 ! 入 几 噬菌体多核 昔酸激 酶缓 冲液 , 7 风
∴ , 一 ; Υ1 Β盯1 8比活度 < ! ! ! Μ ≅ ·Ζ 一 ‘[ ! = ∃≅ ·耐 一 ‘
水溶液98! Ω =Κ Η9 , Υ 6 ∀ 拜Η高纯水混匀后加人 Φ
单位几 噬菌体多核昔酸激酶 , 充分混匀 , ;∀ ℃温
育 # < = ≅> 后 , 于 7Φ℃ 将反应混合液加热 ! = ≅> ,
灭活 ς# 噬菌体多核昔酸激酶 6 标记完的探针用
# 期 林建群等∗ Ν Ο>? 故 菌在非豆科放线结瘤植物根际内的存活与分布
一一⊥6⊥
洲二 匕
! ∀ 一 # ∃ 膜法测定反应液的比活度 % 应达到 & ∋ ((
)∗ ·+,−. 一 ’/ 01 2 3& · # 杂交条件及放射 自显影 012
取 4 5 6 贮存样 , 7 ℃ ∃& (( ,8 + 离心 , 弃上
清 , 加人 ∃( 闪高纯水溶解 4 5 6 沉淀 , 再加人 &(
产9 甲酞胺 % ∃ (( : / , 1 拜9 甲醛 % ;1 : / , & 产∃ &( ‘
<以二, =# ℃温育 ∃∋ + ∗− , 冰浴冷却 3 利用多孔加样
过滤器将已变性的 4 5 6 样品点到硝酸纤维素滤
膜 %孔径 ( 3 &( 拌+ /上 , 于室温彻底晾干滤膜后 , 再
置于真空炉中 #( ℃干烤 & > 3
将点有 4 5 6 样品的硝酸纤维素滤膜放入塑
料袋中 , 加人预杂交液 , 7( ℃ 水浴中轻柔振荡温
育 > 再加人已标记的探针 , 同样条件下温育 &7
> 3
杂交完毕后 , 取出滤膜进行洗涤 3 分别在 = ?
< 义二≅ ( 3 ∃ : Β , Χ Δ ’ Ε Φ ? 段艾 Γ ≅
( 3 ∃ : < ! < 和 ( 3 & ? << ) ≅ ( 3 ∃ : + ∗− 各洗膜 & 次 3 7 组对 照分别在 ;(℃ 、 7 (℃ 、
7 ∋℃ 、 ∋(℃下 , 于 ( 3 & ‘ ∋ ; 二≅ ( 3 ∃ : < ! < 液中, 各
洗膜 ;( + ∗− 3 载有土壤样品 4 5 6 的 滤膜在 7( ℃
下冲洗 3 用滤纸除去滤膜上的大部分液体后 , 再
用 <Β ,Β− 包装膜覆盖滤膜 , 并将其固定于 Η 光片
夹中, 在暗 室中放 入 Η 光 片 , 作好标记后 , 在
一 1( ℃下曝光 1 & > 3 然后用专用的显影和定影液
冲洗胶片 3
∃ & 3 ∋ Ι
∃( 一 7 ∃ ( 一 ; ∃( 一 & ∃( 一 ∃
ϑ, Β − Κ 一Β 菌量
「, Β − Κ 9Β Λ . − ΔΛ − ΔΕ %8 ) Μ ’Ε . ΝΟ少
; 实验结果
; 3 ∃ 供试土样中 几视 ,9Κ 心 4 5 6
土样 厂认 ,9Κ 故 4 5 6 提取 , 其效率与样
品内 厂> − Κ敌 的菌浓度有关 3 样品内所含
的 万> − Κ故 菌量越多 , 提取效率越高 3 当菌
体含量达到 ( 3 ∃ ΠΘ Ρ · Μ 一 ‘土壤时 , 提取效
率趋于恒定 %图 &/ , 约 为 Σ& : % 以纯培养
所提取到的 4 5 6 量 为基准 / 3 当含菌量为
& 3 ∋ Τ ∃( 一 ; ΠΘ Ρ · Μ 一 ‘土壤时 , 回收率可达
# # : 0 9 2 3
; 3 & ϑ,Β − Κ必 4 5 6 样的检测率
从 几视,9Κ 故 纯培养样 中提取 4 5 6 , 经
梯度稀 释后 , 在 多种 条 件下 与制备探 针
杂交 3 经显影 , 可见系列阳性杂交点 % 图; / 3
图 & 土样中几刀成故 菌浓度与 4 5 6 提取量的关系
ϑ∗Μ 3 & 4 Λ 9Β , ∗. − Ε > ∗8 Υ Λ Δς Λ Λ − Δ > Λ Β+ . Ω − Δ . Ξ Λ Τ Δ ,Β Λ Δ ΛΧ 4 5 6
Β− Χ 9几∃&成必 Θ. − Λ Λ − Δ,Β Δ∗. − ∗− 劝∃∃ 3
从图 ; 可见 , 在洗膜温度为 ;( ℃ 时 , 检测
下限 为 ∃ ( 一 ‘1 Μ 4 5 6 % 相当于 ; Τ ∃( 一 ’∋
Π)Ρ 菌体含量 , 下 同/ Φ 7( ℃ 时 , 检测下限
为 ∃ ( 一 ‘; Μ 4 5 6 % ; 义 ∃( 一 “ Π)Ρ / Γ 7 ∋℃ 时 ,
检测下限为 ∃ ( 一 1 Μ 4 5 6 % ; 浓 ∃ ( 一 ’ ΠΛ / Γ
洗 膜 温 度 过 高 % / ∋( ℃ / , 将 检 测 不 到
厂论 − Κ故 4 5 6 的存在 几视−Κ 故 4 5 6 的检
测灵敏度与洗膜温度有关 3 负对照样在 7
种洗膜温度下 , 结果均为阴性 3
; 3 ; 根际 万> ,9Κ 敌 分布及变化
接入的 几叹 Φ9Κ 必 在根代谢产物及外部
环境的作用下 , 培养 = 个月 , 经探针系统检
测 , 发现它们的数量和分布发生 了很大的
变化 %图 7/ 3 图 7 的 ∃ 一 7 组 为管内培养
样 , 在管内不论接种的位置是上部还是下
部 , 长管还是短管 , 在培养管上部 ( 一 # )+
的范围内, 厂> & − ΚΨ’Β 的数量少 Φ而从 # 一 ∃(
Θ + 处开始 , 菌含量 明显增多 3 接种点在上
部的培养管 , 厂沁 ∃9Κ 9’Β 菌 向下迁移可贯穿
整个 土 层 Φ 接种 点 在 下 部 的 培 养 管 ,
凡视 − Κ9Β 菌向上迁移可接近土壤表层 3
图 7 第 ∋ 组为平板培养样 , 各取样点
均分布有 几欢,9Κ 故 3 在本试验中 , 凡双 ,9Κ 故
菌的水平最大迁移距离可达 ∃& 3 ∋ )+ 3 菌
体含量与结瘤情况基本呈正相关关系 , 即
结瘤多的位置 , 其菌体含量也多 3
# 期 林建群等 : 凡视成敌 菌在非豆科放线结瘤植物根际内的存活与分布
不能根据杂交信号确定土壤 中厂Ν Υ Ε≅? Η’Α 的
数量 6 但仍可根据杂交信号 的强弱来比较
各个不 同位点的 6凡视 ΕΗ? 故 的相对数量 6
# 6 Υ 提高 − ∋ . 提取效率的途径
从土壤 中直接提取 − ∋ . , 要 比先进行
菌的分离再提取 − ∋ . 的方法效率高 , 因
为粘附在土壤颗粒上的菌丝很难被全部分
离出来 6 从土壤 中直 接提取 出来 的 − ∋ .
虽污染有腐殖酸 , 但大部分腐殖酸可在酚⊥
氯仿抽提 的过程中去除 , 剩下的小部分可
通过 酚⊥ 氯仿反复抽提 或在将 − ∋ . 固定
于硝酸纤维素膜 时的 )) ∃ 洗膜步骤中去
除 , 不会对结果造成影响 6
# 6 ; 根际 万人Υ ΕΗ? Ο’Α 菌迁移的动力
被接种到土壤中的于沁 ,Η? 故 菌可在环
境因素的作用下被动迁移 6 其迁移的动力
主要应归结为水流的带动 6 在水的作用下 ,
几视 > ?Η’Α 的袍子囊抱子及菌丝可以经土壤
间隙移往他处 6 对 于植物培养管来说 , 无
论是将菌接种到管的上部还是下部 , 经过
一段时间8本实验是 7 个月9的稳定后其分
布状态基本相同 : 几双ΕΗ? 敌 菌均集中于下
部 , 而上部分布较少 6 对于接种点在下部的
植物培养管来讲 , 因浇灌小苗时水流的方
向是 自上而下 , 所以很易将接种点的菌带
到土壤深部 6 对于接种点在底部的植物培
养管来讲 , 浇灌小苗时水流的方向是 自下
而上 , 而且浇水时一般控制水面上升不超
过植物培养 管高度 的 ⊥; , 但仍在管的上
部发现有 于9祝ΕΗ? ΗΑ 菌存在 , 这种现象可以
用土壤的毛细管作用来说明 , 即随着土壤
表层水分的蒸发 , 土壤深层的水分可通过
土 壤 间 隙 上 升 到 土 壤 表 层 , 从 而 将
凡视 ,Η? 故 的抱子囊抱子及菌丝带往管的上
部 6 植物培养箱 中的 厂沁>? 放 菌能够从接
种点迁移到其它部位 8在各个实验点均检
测到 ∃∃ &; 的存在 9 , 系 厂沁 ΕΗ? Η’Α 抱子及菌
丝在土壤间隙液体中的扩散所造成 的 , 也
有可能是菌丝粘附在植物根上 , 随着根 的
不断延伸而移往他处 6
参考文献
王育英 、林建群、张忠泽等 6 < 6 土壤中 凡视戒必 菌
− ∋ 八提取 6 微生物学杂 志 , < 8 9 : #Υ 6
. ? ? ΜΕ= Α > Δ 6 . 6 2 6 / 6 , % Α Ν > , 2 6 Μ 5 Α Η6 6 ΖΚ ΗΜ4 Χ ΗΑΕ
Μ 4Κ ΗΚ Ρ Σ Κ Λ 0, 召 >? 必 : Α Ι Γ Α > 5 Α Ρ Μ Δ Α > Ι Ι ≅ΔΑ Ι Γ Α > 5昭Μ Δ Κ Λ
5 ΝΜ Χ β Κ Λ 2 ∋. ΩΕ Κ ϑΜ Δ 6 厂认∗ > Ο Α >Ι Δ , , ;∀ 8 9 : # 一
<# 6
% Α Η、残 2 6 Α > Ι . ? ? Μ Ε = Α > Δ , . 6 2 6 6 ! 6 <”5 Ν Μ 5 ≅Μ
! Η≅Ρ Κ > Χ Μ χ阶 5ΗΙ Μ ΩΕ Κ ϑ Μ Δ ΛΚ Ε , Ι Μ > 5 ≅Λ≅Μ Α 5 ≅Κ > Κ Λ 厂’9Υ>? 必
Δ 5 Ε Α ≅> Δ 6 丁公Θ> 5 Α >Ι Δ 而Η , Φ 8Υ 9 : Υ ! 一Υ 6
Ψ Κ ΗΗ > Μ , 2 6 Α> Ι . Ι Α叱 6 ς 6 % 6 Φ7 6 ∋ Κ Γ Μ Η Α ΩΩ Ε ΚΑ Μ Ν ΛΚ Ε
Ε Α Ω≅Ι Δ Μ > Δ Η5 一Γ Μ Ι Μ 5Μ Μ 5 ≅Κ > Κ Λ = ≅Μ ΕΚ ΕΡ Α > ≅ΔΕ>Δ : 2 ∋ .Ω ΕΚ ϑΜ Δ 5Κ : − ∋ . 6 &> Ζ ΗΜ Ε Κ ϑ ≅Κ ΗΚ Ρ Σ一 Φ 7 8( Ι 6 & 6 / Μ ≅Γ Μ 9 6
. = Μ Ε ≅ΜΑ> ) 又 ≅Μ 5 Σ ΛΚ Ε Ζ ≅Μ ΕΚ ϑ ≅Κ Η89Ρ Σ 6 Τ ΑΔ Ν≅> Ρ 5 Σ Κ > 6 2 6
∃ 6 , Ω Ω 6 ! 一 Υ 6
Ζ Σ ΕΚ ≅Ι , 2 6 2 6 Μ Ε Α Η6 ! 6 2Μ 5 Μ Μ 5 ≅> Ρ 0, 之又成必 ≅> Ρ 1∃ − 6 ∋ ≅5Ε Κ Ρ Μ > 0 ≅δ Α 5≅Κ > : . Μ Ν ≅Μ Γ Μ = Μ > 5 Δ Α> Ι
! ϑε Μ Μ 5≅Γ Μ Δ 6 1 6 Ζ 6 α Ε ΜΔ Ν Κ ΛΛ6 & 6 ( Γ Α > Δ − Κ 5Ν , α 6 )5Α Μ ΜΣ 6
Μ 5 Α Η6 8( Ι 9 6 ∃Ν Α Ω=Α > φ % Α ΗΗ, ∋ ΜΞ 3 Κ Ε ? , Ω Ω , # Υ 6
1 ≅Μ Α Ε Ι 6 ∃二 1 Κ >阳 > > Μ 5 , ∃ 6 Μ 5 Α Η6 Υ 6 「冲5 Μ Μ 5 ≅Κ > Α> Ι
Μ > Χ = Μ Ε Α 5 ≅Κ > Κ Λ ϑΑ Μ 5Μ Ε一Α ≅> 阶 ϑΣ Ι ≅Ε Μ Μ 5 2 ∋ . Μ δ 5Ε Α Μ 5≅Κ >
Α > Ι 伪 ΗΣ = Μ Ε Α Δ Μ ΜΗ、Α ≅> Ε ΜΑ Μ 5 ≅Κ > · 月妙人Ν才 Α心( >。。> 。欲Ο Ζ人, 动≅口左哟 , , < Φ 8 9 : Υ ∀ ∀ 一 Υ ∀Υ Υ 6
) Α > ΗϑΕΚ ? , ∗ 6 Α > Ι 0 Ε≅ 5Δ4 Ν , ( 6 0 6 Μ 5 Α Η6 Φ 6 Ζ Κ ΗΜ4 Χ ΗΑΕ∃ΗΚ > 一> Ρ 6 ∃ Κ ΗΙ ΔΩ Ε ≅> Ρ % ΑΕ 阮 Ε / ΑϑΚ ΕΑ 5Κ Ε Σ 1 ΕΜ Δ 6 1Ε≅ > 5 Μ Ι
&> 5 Ν Μ , > ≅5 Μ Ι ) 5Α 5 Μ Δ Κ Λ . = Μ Ε ≅Μ Α 6
Υ 一Α > Ρ , Υ 6 Υ 6 Μ 5 Α Η6 Φ # 6 . Μ Κ > ΗΩΑΕ ≅ΔΚ > Κ Λ Μ Χ Η5 Χ Ε Α Η
4 Α ΕΑ Μ ΕΜ Ε≅、5 :4 Δ Α > Ι ≅> ΛΜ Μ 5一Γ ≅5Σ Κ Λ 09 划>? 必 ≅ΔΚ ΗΑ 5 Μ Δ ΛΕΚ =
Ε图5 >ΚΙ /ΗΗΜ Δ Κ Λ肠侧八朋 Δ1Μ4 ≅Μ Δ 6 子公Θ > 5 Α 尹心 ) 为了, ∀ Φ8 9: ∀ 一 ! 6