全 文 ：园 艺 学 报 2006, 33 (5) : 1103～1105
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2005 - 11 - 07; 修回日期 : 2006 - 02 - 28
基金项目 : 国家自然科学基金资助项目 (30500303) ; 重庆市自然科学基金项目 ( CSTS2006BA1001) ; 西南大学博士基金资助项
目 ( SWNUB200411)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: pft@ sdau1edu1cn)
致谢 : 颠茄材料承蒙西南大学生命科学学院邓洪平博士鉴定 ; 英文摘要由美国华盛顿州立大学谭秋敏博士修改 , 特此致谢。
基于颠茄发根的外源基因表达系统的建立
杨春贤 1 陈 敏 1 廖志华 13 谌 容 1 阳义健 1 张 磊 2
(1 西南大学生命科学学院 , 三峡库区生态环境教育部重点实验室 , 天然产物与代谢工程实验室 , 重庆 400715; 2 第二
军医大学药学院生药学教研室 , 上海 200433)
摘 要 : 用携带植物高效表达载体 pCAMB IA1304 + “解除武装 ”的重组 C58C1工程菌转化颠茄无菌苗
真叶 , 发根诱导率达 100%。PCR检测证实发根型质粒 pR iA4和表达型质粒 pCAMB IA1304 +均能整合到颠
茄发根基因组内 , 共转化率达 30%。建立了基于颠茄发根的高效外源基因表达系统 , 为将托品烷类生物碱
东莨菪碱的生物合成关键酶基因导入颠茄 , 实现其次生代谢工程及开展分子育种奠定了基础。
关键词 : 颠茄 ; 托品烷类生物碱 ; 发根 ; 外源基因 ; 代谢工程
中图分类号 : S 567 文献标识码 : A 文章编号 : 05132353X (2006) 0521103203
Establishm en t of the Exogenous Gene Expression System Ba sed on A tropa
be lladonna Ha iry Roots
Yang Chunxian1 , Chen M in1 , L iao Zhihua13 , Chen Rong1 , Yang Yijian1 , and Zhang Lei2
(1Laboratory of N atura l Products and M etabolic Engineering, Key Laboratory of Eco2environm ents in Three Gorges Reservoir Re2
g ion, M inistry of Education, School of L ife Sciences, Southw est U niversity, Chongqing 400715, China; 2D epartm ent of Pharm a2
cognosy Science, School of Pharm acy, Second M ilitary M edical U niversity, Shanghai 200433, China)
Abstract: The disarmed A grobacterium tum efaciens strain C58C1 harboring the p lasm id pR iA4 was engi2
neered by introducing the p lant exp ressing vector pCAMB IA1304 + . The bacteria2free well2growing true leaves
of A. belladonna were infected with the engineered recombined C58C1. The hairy roots were induced from the
wounded sites of the leaves at the frequency of 100%. Then, genom ic PCR was app lied to detect rolB , rolC ,
and antihygromycin gene in different monoclonal hairy root lines. A ll the three genes were simultaneously de2
tected in 30% hairy root clones. The results demonstrated that exogenous genes could be exp ressed in hairy
roots of A. belladonna at a relatively high frequency by the method in the p resent studies. These were funda2
mental works for tropane alkaloids metabolic engineering in hairy roots and molecular breeding of A. belladon2
na.
Key words: A tropa belladonna; Tropane alkaloids; Hairy root; Exogenous gene; Metabolic engineering
Regeneration
1 目的、材料与方法
莨菪碱和东莨菪碱等托品烷类生物碱是作用于副交感神经系统的抗胆碱药物 , 由于两者对中枢神
经系统有不同的作用 , 目前在商用市场东莨菪碱的需求量是莨菪碱的 10倍。颠茄 (A tropa belladonna
L. ) 一直是生产莨菪碱和东莨菪碱的主要药源作物〔1〕, 但是天然颠茄中托品烷类生物碱含量很低 ,
且东莨菪碱含量远远低于莨菪碱〔2〕。农杆菌介导的遗传转化是外源 DNA进入植物细胞最成功和应用
最广泛的方法之一。本研究以颠茄无菌苗 “解除武装 ”的根癌农杆菌 (Ag robacterium tum efaciens) 菌
株 C58C1 (含 pR iA4质粒 )、pCAMB IA1304 +质粒 (携带 1个潮霉素抗性基因即 hygr) 为主要试材 ,
园 艺 学 报 33卷
建立了基于颠茄发根的高效外源基因表达系统 , 为将东莨菪碱生物合成途径中的关键酶基因导入颠
茄 , 实现其次生代谢工程以及开展分子育种奠定基础。
以 pB I121为真核表达盒供体 , H indⅢ和 EcoRⅠ双酶切 pB I121和 pCAMB IA1304。回收 pB I121表达盒
及 pCAMB IA1304大片段 , 连接此二回收产物 , 转化大肠杆菌 DH5α, 在 LB +卡那霉素 ( Kanamycin,
Kan) 50 mg·L - 1平板上筛选得到单克隆 , 抽提质粒 , H indⅢ和 EcoR Ⅰ双酶切验证 , 构建 pCAM2
B IA1304+ 。再用 pCAMB IA1304+转化空载 C58C1感受态 , 在 YEB + Kan 50 mg·L - 1 +利福平 (R iferp in)
40 mg·L - 1平板上挑取单菌落进行 PCR验证 , 获得携带 pCAMB IA1304+的重组 C58C1工程菌〔3〕。
选取展开 10 d左右的颠茄无菌苗生长一致的真叶 , 剪成 2 cm2左右的外植体用于转化〔3〕。浸染时间
3 m in, 共培养的培养基为 MS +乙酰丁香酮 100μmol·L - 1 , 共培养 2 d后转入 MS +头孢霉素 (Cefo2
taxime, Cef) 250 mg·L - 1 , 20 d后统计发根诱导率 , 并随机抽取 20个外植体统计发根数。剪取长约 5
cm的发根 , 接种到 1 /2 MS + Cef 250 mg·L - 1培养基上 , 挑选生长迅速、分支多、具典型发根形态特征
的单克隆 , 每 10 d继代 1次。
单克隆发根转入 1 /2 MS +潮霉素 (Hygromycin, Hy) 30 mg·L - 1 + Cef 250 mg·L - 1培养基中进行
14 d的进一步抗性筛选 , 所得单克隆发根分为 A、B两组 : 分支较多、生长旺盛的为 A组 , 生长缓慢、
部分褐化的为 B组。继代 3次后 , 发根转入 1 /2 MS培养基继代培养 , 除菌完成后用 SDS法〔3〕提取发根
基因组 DNA 用于 rolB、 rolC、 hygr基因片段的 PCR 检测〔3〕。 rolB ( 423 bp ) 正向引物为 frolb: 5pi2
GCTCTTGCAGTGCTAGATTT23pi, 反向引物为 rrolb: 5pi2GAAGGTGCAAGCTACCTCTC23pi; rolC (626 bp) 正
向引物为 frolc: 5pi2CTCCTGACATCAAACTCGTC23pi, 反向引物为 rrolc: 5pi2TGCTTCGAGTTATGGGTACA23pi;
hygr (812 bp) 正向引物为 fhygr: 5pi2CGATTTGTGTACGCCCGACAGTC23pi, 反向引物为 rhygr: 5pi2CGATG2
TAGGAGGGCGTGGATATG23pi。 rolB 和 rolC的 PCR反应条件为 : 94℃预变性 5 m in, 然后开始 35个循环
包括 94℃变性 40 s, 55℃退火 40 s, 72℃反应 1 m in, 最后于 72℃延伸 8 m in; hygr的 PCR反应条件为
94℃预变性 5 m in, 然后开始 35个循环包括 94℃变性 45 s, 55℃退火 45 s, 72℃反应 1 m in, 最后于 72℃
延伸 8 m in。
将部分发根在继代过程中产生的愈伤组织转入 MS培养基 , 于 (25 ±1) ℃、光强 55μmol·m - 2 ·
s
- 1 12 h /d继代培养 , 芽再生。将长约 1 cm不定芽切下 , 转入 1 /2 MS + IBA 011mg·L - 1培养基中生根。
2 结果分析与讨论
211 发根农杆菌介导的颠茄遗传转化体系的建立
本试验采用的 C58C1本身是根癌农杆菌 , 经 “解除武装 ”后保留 Helper质粒 , 导入 pR iA4质
粒 , 改造后的 C58C1丧失了使植物产生冠瘿组织的能力 , 成为高效转化的发根农杆菌。在本试验中 ,
被感染的 50个外植体均发根 , 诱导频率达 100 % , 每个外植体平均发根数为 1615条。发根均从外植
体伤口部位长出 (图版 , A)。选取具有典型发根形态特征的单克隆 40个 (图版 , B ) 进行 Hy抗性
筛选及 PCR检测。
图版说明 : A. 从叶片伤口处诱导出的发根 ; B. 颠茄发根单克隆 ; C. 颠茄转基因发根的再生 ; D. 再生的转基因幼苗。
Explana tion of pla tes: A. Hairy roots induced from the wound sites of leaf of A. belladonna; B. Hairy root line of A. belladonna; C. Regenera2
ted shoots from hairy root line of A. belladonna; D: Young regenerated transgenic p lant.
4011
5期 杨春贤等 : 基于颠茄发根的外源基因表达系统的建立
212 颠茄发根的继代培养、Hy抗性筛选及 PCR
检测
发根继代 3次 , 彻底除菌后转入 1 /2 MS培养
基继代培养。各单克隆发根进行 Hy筛选 14 d后 ,
A组共获得 12个单克隆 , B组共获得 28个单克
隆。经 PCR检测 , 这 40个单克隆全部含 rolB 和
rolC片段 (图 1 )。A 组的 12 个单克隆全部含
hygr片段 , B 组的 28个单克隆无 hygr片段。说
明具有 Hy抗性的单克隆都是 pCAMB IA1304 +与
pR iA4质粒共转化形成的发根 , Hy抗性的获得是
由于 pCAMB IA1304 +质粒携带的 hygr在发根中表
达的 结 果。B 组 单 克 隆 由 于 未转 入 pCAM2
B IA1304 +质粒故不具有 Hy抗性。在所有 40个单
克隆中 , pCAMB IA1304 +质粒与 pR iA4质粒的共
转化率达 30%。pCAMB IA1304 +可用于在发根中
图 1 颠茄发根 ro lB、 ro lC和 hygr的 PCR检测
M: 核酸分子量标准 DL 2000; + : 作为阳性对照的重组
C58C1的 pR iA4、pCAMB IA1304 +质粒 ; - : 作为阴性
对照的颠茄普通根 ; T1～T5: 不同的发根单克隆 ;
hygr: 潮霉素抗性基因。
F ig. 1 PCR ana lysis of rolB , ro lC and an tihygrom yc in
genesin m onoclona l ha iry roots of A. belladonna
M: DL 2000 marker (100 - 2 000 bp) ; + : Plasm id pR iA4
and pCAMB IA1304 + as positive control; - : Negative control;
T1 - T5: Tested monoclonal hairy root lines 1 - 5;
hygr: Antihygromycin gene.
同时表达多个目的基因 , 包括托品烷类生物碱生物合成途径中的关键酶基因。在颠茄发根遗传转化中
可将 30 mg·L - 1 Hy作为共转化的选择压。
颠茄发根生长迅速 , 继代培养时间以 10 d左右为宜 , 且选用具有发根典型形态特征的单克隆进
行培养 , 提高转化率。提取 DNA的发根必须采用在无 Cef培养基上继代 3次以上彻底除菌的发根 ,
以降低假阳性率。
213 发根的植株再生
发根愈伤组织培养在 MS培养基 30 d后部分分化出不定芽 (图版 , C)。
目前 , 转基因发根不定芽的诱导时间较长 , 频率较低。其愈伤组织和不定芽诱导培养基有待进一
步筛选。
不定芽转入生根培养基 5 d后开始生根 (图版 , D )。不定芽在 MS基本培养基中也能生根 , 但经
历时间较长。Subroto等研究表明 , 转基因颠茄不定芽生根较困难 , 在 MS培养基中添加不同浓度的
2, 42D, NAA等均未成功〔4〕, 可能是使用的工程菌不同所致。
再生苗长势良好 , 生长正常。
综上所述 , 本试验建立了基于颠茄发根的外源基因表达系统 , 为将托品烷类生物碱生物合成途径
中的关键酶基因导入颠茄 , 实现其代谢工程及开展分子育种提供了技术平台。
参考文献 :
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