全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 29(3)：408—412 2009年 5月
实时荧光定量 PCR(TaqMan)法
测定外源基因的拷贝数
王爱民1，
(1．徐州师范大学 生命科学学院，江苏 徐州 221116；2．江苏省药用植物生物技术重点实验室 ，江苏 徐州 221116)
摘 要：实时荧光定量 PCR是近年新兴的一项技术，因其快速、方便、便宜，需要 DNA样品量少，无需放射性
检测等优点被广泛应用于基因的定量分析。该文就实时荧光定量 PCR(TaqMan)技术的发展、基本原理及测
定外源基因拷贝数的技术流程做一介绍。
关键词：外源基因；拷贝数；实时荧光定量PCR
中图分类号：Q943 文献标识码：A 文章编号：1000—3142(2009)03—0408-05
⋯ ·● ’ n ● ’ Estimating copy am her 0ttransgemc gene by
real-time fluorescent quantitative PCR(TaqMan)
Ⅵ NG Ai—Min1，2
(1．School of Life Science，Xuzhou Normal University，Xuzhou 221116，China；2．Jiangsu Provincial
Key Laboratory of Biotechnology for Medicinal Plant，Xuzhou 221116，China)
Abstract：Real-time fluorescent quantitative PCR iS a new technique which has been developed tO be used in quantita—
tive analysis of genes as wel with the advantages of simpleness，quickness，short needs of target fragment DNA and
none of hazardous radioisotopes in recent years．The development，the principle of real—time fluorescent quantitative
PCR(TaqMan)and the techinical flow of estimating copy number of transgenic gene are introuduced in this paper．
Key words：transgenic gene；copy number!real—time fluorescent quantitative PCR
传统测定基因拷贝数的方法是 Southern Blot—
ting。事实证明它确实是一个行之有效的、准确的
方法，但在实际操作过程中我们也不难发现，它费
时、费力，同时还需大量的 DNA样品，甚至要使用
放射性同位素(Mason等，2003)。近年兴起的实时
荧光定量 PCR(real—time quantitative polymerase
chain reaction，real—time quantitative PCR)技术弥
补了以上的不足(Ingham等，2001；Song等，2002；
Mason等，2003)。实时荧光定量 PCR技术是在
1996年由美国 Applied Biosystems公司推出，它通
过在 PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号
的积累实时监测整个 PCR进程，最后通过标准曲线
对未知模板进行定量分析的方法。其主要优点是：
(1)不需要进行 PCR的后处理，最大限度的减少了
操作过程中可能导致的污染；(2)快速，便宜；(3)避
免使用具有危害的放射性同位素；(4)仅需要少量的
DNA样品；(5)提供一个广泛的定量动力学范围，能
对拷贝数差异较大的不同样品进行精确定量。由于
该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且
与常规 PCR相 比，它具有特异性更强、有效解决
PCR污染问题、自动化程度高等特点，目前已得到
广泛应用。
1 基本原理
实时荧光定量 PCR的发明归功于两个重要的
收稿 日期：2008—02—02 修回日期：2008—12-25
基金项目：徐州师范大学科N~ (0SXLBI3)；徐州市科技局基金(XZ2006221)[Supported by the Scientific Research Foundation of Xuzhou Normal
University(05Xl B13)：the Scientific Research Foundation of Xuzhou Science&Technology Bureau(xz2OO6221)]
作者简介：王爱民(1970一)，女 ，江苏徐州人，硕士 ，副教授 ，主要从事植物生理学的教学与研究，(E-mail)aiminwang@xznu．edu．en
3期 王爱民：实时荧光定量 PCR(TaqMan)法测定外源基因的拷贝数 409
发现：一是发现 DNA Taq聚合酶有 5 一3 外切酶
活性且为双链特异性(Deborab，1999)；二是利用荧
光能 量传 递 技术 (fluorescence resonance energy
transfer，FERT)(Heid等，1996)构建了双标记寡核
苷酸探针 ，即 TaqMan探针。
Higuchi(1993)首次报导了实时定量 PCR技
术。在 PCR反应过程中通过溴化乙锭的插人和一
台改良的热循环仪，用 UV射线照射样品，然后用
CCD相机检测产生的荧光信号。以荧光信号和
PCR循环数为轴作图。这一方法的主要缺陷在于
特异性比较低，在检测到特异性荧光信号的同时，一
些非特异性的 PCR产物也被检测到。现在更多的
是采用 5 核酸酶的方法 ，包括 TaqMan探针 (Gib—
son等 1996，Heid等 1996)，分子标记 (Tyagi&
Kramer，1996)，SYBR Green I染料(Yin等 2001，
Schmittgen等 ，2000)等。有关实时定量 PCR的名
词概念可参看相关文献(Ginzinger，2002)。
PCR反应体系中，在加入一对引物的同时加入
一 个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，5 端
和 3 端分别标记一个报告荧光基团，如 FAM(6-羧
基荧光素)，TET(四氯一6一羧基荧光素)，JOE(2，7-二
甲基一4，5-二氯一6一羧基荧光素)，HEX(六氯一6一甲基
荧光素)和一个淬灭荧光基团，如 TAMRA(6一羧基
四甲基诺丹明)。两者之间构成能量传递结构。探
针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸
收，不出现荧光信号变化；PCR扩增时，Taq聚合酶
的5 3 外切酶活性将与底物结合的探针酶切降解，
报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，使淬灭基团的淬
灭作用被解除，从而荧光监测系统可接收到荧光信
号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，
实现了荧光信号的累积与 PCR产物形成完全同步。
实时荧光定量 PCR一般使用 ct值(每个反应
荧光信号达到设定域值所经的循环数)定量，由于
Ct值与模板初始拷贝数的对数成线性关系，利用已
知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，只要获得
未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品
的起始拷贝数(Woo等，1999)。一些与癌变有关的
基 因，如 HER2／neu(Milson等，2003)，erbB2
(Bi~che等，1998)，MYCN(De等，2002；Raggi等，
l999)等基因拷贝数的变化均可通过这种方法得到
检测。也 利用该方法检 测 了番茄外 源 nptlI，
TSWV-N基因(Mason等，2003)以及 pmi，adh基
因的拷贝数(Ingham等，2001)。
目前市场上有许多种实时定量 PCR仪可供选
择；其中包括ABI7700，BI7900，BI7O00(Applied 一
osystems)，MX4000 (Stratagene，LaJolla，CA，
USA)．Lightcycler(Roche，Alameda，CA，USA)，
iCycler(Bio—Rad，Hercules，CA，USA)，Smarteycler
(Cepheid，Sunnyvale，CA，USA)，Robocycler(MJ
Research，Incline Vilage，NV，USA)等。
2 测定外源基因拷贝数的技术流程
2．1引物、探针的设计
与普通 PCR相 比，real—time PCR对引物的要
求较高。引物的优劣直接关系到是否能扩增出特异
的目的基因，并且能够排除在扩增中形成引物二聚
体。通常对引物设计的要求主要包括：3 端应无二
级结构、重复序列、回文结构和高度的变异；两条引
物之间不能发生互补，尤其是在 3 端；两条引物中
的GC含量应保持大体一致，其含量应占引物碱基
的4O ～7O ，不应有 G／C和 A／T富集区的非平
衡分布；引物的Tm值一般都设计在 59～60℃，这
主要是因为在 6O℃ Taq酶的5 一3 外切核酸酶的活
性最强，并且引物位置要尽可能的靠近探针，扩增片
断长度要小于400 bp。
实时荧光定量 PCR的灵敏之处其一就在于
PCR反应体系中引入序列特异性的第三个寡核苷
酸——探针。探针的优劣直接影响到荧光信号的接
收效果。Taq聚合酶的外切核酸酶的活性是双链特
异性的，因此它只对和模板结合的探针起作用，而对
游离的探针不起作用。在real—time PCR进程中，探
针必须和模板紧紧结合才能保证 Taq聚合酶从 5
端水解探针核苷酸。因此探针的熔链温度(Tm)一
般都设计在 68～7O℃，这样，当60℃变性和延伸时
探针模板结合的是非 常稳定的。对 富含 AT的序
列 ，可在 3 端引入 MGB(minor groove binder)来增
加探针和模板结合的稳定性(Kutyavin等，2000)。
同时还应注意：探针的长度必须小于 3O bp，否则荧
光报告基团和荧光猝灭基团距离较远，荧光能量传
递作用减弱，背景信号增加；探针 5 端第一个碱基
一 般不能是 G，否则会猝灭荧光。
目前，TaqMan real—time PCR的引物和探针多
是由公司专业人员设计的。
2．2反应体系和反应参数的确定
实时定量 PCR通常采用的反应体系见表 l。
410 广 西 植 物 29卷
如果扩增片段较短，在 100 bp以内，可采用两步扩
增法，即 95℃变性 2O～3O S，60℃退火延伸 30 S，
同时接收荧光信号；如果片段稍长则可采用三步法，
即增加 72℃延伸 45 S，并在延伸阶段接收荧光信
号。循环数一般为45~55。
2．3模板的浓度
如果研究者是进行首次实验，那么应选择一系
列稀释浓度的模板来进行实验，以选择出最为合适
的模板浓度。基因组 DNA的模板浓度在 50pg～
5ng之间选择。一般而言，使 Ct值位于 15～3O个
循环比较合适，若大于 30则应使用较高的模板浓
度，如果 Ct小于 15则应选择较低的模板浓度。
表 1 实时荧光定量 PCR反应体系
Table 1 The reaction system of real-time
fluorescent quantitative PCR
成分 Composition 用量 Dosage
5×PCR Buffer：
25 mM MgClz：
2 mM dNTP：
25 pM Primer F：
25 pM Primer R：
10 pM TaqMan Probe：
1 U／ L Taq DNA Polymerase
模板 DNA：
ddH2O：
2．4优化探针、引物的量
探针、引物相对量是实时荧光定量PCR反应非
常重要的影响因素。引物浓度太低，会致使反应不
完全；若引物太多，则发生错配以及产生非特异产物
的可能性大大增加。探针浓度太低，荧光信号较弱；
若浓度太高，则会影响信躁比。一般在首次实验过
程中，必须先通过一系列梯度浓度的探针和引物的
正交预实验来确定两者的相对量。最基本的原则是
获得在 15～30之间最小的 Ct值和最大的信号／背
景比值。
2．5内源参照基因及标准品的选择
测定基因的拷贝数多数是通过相对定量的方
法，即同一DNA模板两个完全独立的扩增反应，一
个是内源参照基因，通过标准曲线可知其起始量；一
个是目的基因，通过标准曲线也可以得到其起始量。
目的基因起始量与内源参照基因起始量的比值即为
目的基因的拷贝数。
内源参照基因(Endogenous reference gene)多
数是选取生物体内源的低拷贝基因，如玉米的乙醇
脱氢 酶基 因 alcohol dehydrogenase(Ingham 等，
2001；Shou等，2004)；大豆的凝集素基因 soybean
lectin(Schmidt& Parrott，2001)；番茄的液泡蔗糖
酶 基 因 tomato vacuolar invertase(German等，
2003)，及抗坏血酸过氧化物 酶基 因 ascorbate per—
oxidase(Mason等，2003)；烟草的谷氨酰胺合成酶
基 因 plastidic glutamine synthetase(Bubner等，
2004)；油菜 的高 移动 组蛋 白基 因 high—mobile—
group protein I／Y基因(Weng等，2004)；水稻的蔗
糖磷酸合酶基因 sucrose phosphate synthase(Ding
等，2004)及一些内源性管家基因(house keeping
gene)如 p一肌动蛋白、p2一微球蛋白和 18s rRNA(Li—
vak& Schrnittgen，2001)等。
标准品可以是纯化的质粒 DNA，体外转录的
RNA，或者是 体外 合成 的 ssDNA。但 Song等
(2002)等认为，理想的标准品应该是已插入外源基
因的植物基因组DNA，并且用Southern Bloting已
准确测得插入外源基因拷贝数。在相同的扩增条件
下目的基因测得的荧光信号量同标准曲线进行比
较，从而得到 目的基因的量 。
2．6定量校正曲线的建立
转基因和内源参照基因的定量 PCR校正曲线
的建立是用定量 PCR的方法分析转基因外源基因
拷贝数的关键步骤。在应用校正曲线计算外源基因
或内源参照基因的拷贝数前，首先确定建立的定量
校正曲线的可靠性和合理性。即所有基因PCR反
应的效率要相似，并且最好大于或者等于90 。这
能够通过将正控制模板 1O倍连续稀释，以模板浓度
值的logE10]对数值绘制 Ct曲线；曲线的斜率可以
看作 PCR反应的效率。斜率为一3．32表示 PCR反
应效率为 100 。关于这方面的细节和其他的计算
方法请看有关文献(Nigro等，2001；Ginzinger等，
2000；Meijerink等，2001)。
2．7外源基因拷贝数的计算
在定量 PCR反应中，C 是扩增目的基因的量
达到固定域值 (threshold)时的循环数，描述定量
PCR反应的公式是：
XT—X0×(1+Ex) ·x—Kx， ⋯⋯⋯⋯ ⋯⋯⋯ ①
这里 X 扩增目的基因分子达到域值时的量，
X。是起始 目的基因分子的量，Ex是 PCR反应效
率，C 。 是目的基因分子的量达到域值时的循环数，
K 在公式中表示它是一个常数。
对于参照基因来说，PCR反应公式为：
度 度 度
L L
止 撒 麟 撕
3期 王爱民：实时荧光定量 PCR(TaqMan)法测定外源基因的拷贝数 411
Rr—R。×(1+ ) 7-,R==KR，⋯⋯⋯ ⋯⋯⋯ ⋯⋯ ②
这里，R 扩增内源参照基因分子达到域值时的
量，R。是起始内源参照基因分子的量， 是 PCR
反应效率，G 。 是内源参照基因分子的量达到域值
时的循环数，K 为常数。从 PCR扩增公式可看出，
达到域值时的循环数(Ct值)与起始模板(X。或 R。)
的对数成线性关系。因此，通过梯度稀释目的基因
或内源参照基因模板 DNA量，其浓度的对数与相
应的Ct值可以做一条直线，称为标准曲线(Stand—
ard curve)。通过标准曲线，PCR反应效率与常数
K可以求得。
1+E一1O一 ，⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯ ③
K一10 ，⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯ ④
这里S(slope)是标准曲线的斜率，J是截距(in—
tercept)，代人由标准曲线得到的值③、④。两基因
起始浓度的比一X。／R。可以由最终公式⑤得到 ：
X ／17 =101％． 一， )，s ：～[(c —IR)， ] ⋯ ⋯⋯⋯ ⑨
这里 Jx和J 分别是目的基因和内源参照基因
相对标准曲线的截距，S 和s 分别是两基因的斜
率，C ， 和C ， 是每一个被检测样品中目的基因与
内源参照基因达到域值时的循环数。如果内源参照
基因(R。)的拷贝数确定，则目的基因的拷贝数(X。)
可计算出来。
如果转基因植 物都为 代，对于外源转基 因
来说是杂合子；而对于内源参照基因来说是纯合子，
因此，得到的X。／R。值必须翻倍(x 2)。
如果标准品是 已插人外 源基 因的植物基 因组
DNA，并且用 Southern Bloting准确测得插入外源
基因拷贝数的话，一种快速方便的计算外源转基因
的拷贝数的方法是采用相对定量的方法，即分别根
据同一 DNA模板构建的外源转基因和内源参照基
因的定量校正曲线得知各基因的起始量，那么外源
基因与内源参照基因起始量的比值，就是外源基因
的拷贝数。
3 展望
该技术借助于荧光信号来检测PCR产物，一方
面提高了灵敏度，另一方面还可以做到 PCR每循环
一 次就收集一个数据，建立实时扩增曲线，准确地确
定 Ct值，从而根据 Ct值确定起始 DNA拷贝数，做
到了真正意义上的DNA定量，这是 DNA定量技术
的一次飞跃。实时荧光定量 PCR(TaqMan)法测定
外源基因拷贝数，具有高的特异性和高信噪比的优
势，并且方法简单、快捷，需要 DNA量少，不需进行
放射性检测，再加之其高通量和低成本，已在许多领
域得到广泛应用。但是应该看到，这种检测方法对
低拷贝的准确性较高，而对多拷贝的检测的准确性
还有待提高(Bubner等，2004)，因此这种方法并不
能完全的替代传统的 Southern Blotting，而应该是
传统方法的补充，尤其是在大批量的转基因株系的
初筛中。
参考文献：
Bi6che I，Olivi M，Champ6me MH，eg a1．1998．Novel approach to
quantitative polymerase chain reaction using real—time detection：
application to the detection of gene amplification in breast cancer
[J]．1nt J Cancer，78(5)：661—666
Bubner B，Gase K，Baldwin IT．2004．Two-fold differences are the
detection limit for determining transgene copy number in plants
by real-time PCR[J]．BMCBiotechnol。4：14～24
De Preter K，Speleman F，Combaret V，et a1．2002．Quantification
of MYCN。DDX1，and NAG gene copy number in neuroblastoma
using a real—time quantitative PCR assay[J]．Mod Pathol，15
(2)：159—166
Deborab SG．1999．Quantitative real—time polymerase chain reac—
tion for the core facility using TaqMan and the Perkin-Elmer—
PApplied biosystems division 7700 sequence detector[J]．J Bio一
17o2 Tech，10(1)：11～16
Ding J，Jia J，Yang L，et a1．2004．Validation of a rice specific
gene，sucrose phosphate synthase。used as the endogenous refer—
ence gene for qualitative and real-time quantitative PCR detection
of transgenes[J]．J Agric Food Chem，52(11)：3 372—3 377
German MA，Kandel—Kfir M，Swarzberg D，el a1．2003．A rapid
method for the analysis of zygosity in transgenic plants[J]．Plant
Sci，164：183～ 187
Gibson UE．Heid CA， tliams PM．1996．A hovel method for re．al
time quantitative RT-PCR[J]．Genorne尺 ，6(10)：995—1 O31
Ginzinger DG，Godfrey TE，Nigro J，et a1．2000．Measurement of
DNA copy number at microsatelite loci using quantitative PCR
analysis[J]．CancerRes，60(19)：5 405—5 409
Ginzinger DG．2002．Gene quantification using real—time quantita—
tive PCR：al emerging technology hits the mainstream[J]．Exp
Hematol，30(6)：503—512
Heid CA，Stevens J，Livak KI，el a1．1 996．Real—time quantitative
PCR[J]．GenomeRes．6(10)：986-994
Higuehi R，Fockler C，Dolinger G，el a1．1993．Kinetic PCR anal—
ysis：real—time monitoring of DNA amplification reactions[J]．
Biotechnology(Ny)，11(9)：1 026— 1 030
Ingham DJ，Beer S，Money S，et a1．2001．Quantitative real—time
PCR assay for determining transgene copy number in transformed
plants[J]．Biotechniques，31(1)：l32—140
Kutyavin IV，Afonina IA，Mils A，et a1．2000．3 一minor groove
binder-DNA probes increase sequence specificity at PCR exten—
sion temperatures[J]．NucleicAcidsRes，28(2)：655—661
Livak I(J，Schmittgen TD．2001．Analysis of relative gene expres—
sion data using real—time quantitative PCR and the 2(一De lta Delta
412 广 西 植 物 29卷
C(T))Method[J]．Methods，25(4)：4O2—408
Mason G，Pmvero P，Vaira AM ．eta1．2003．Estimating the mum—
ber of integrations in transformed plants by quantitative real-time
PCR[J]．BMCBiotechnol，2：2O一29
Meijerink J，Mandigers C，van de Locht L，et a1．2001．A noveI
method to compensate for diferent amplification effieiencies be—
tween patien DNA samples in quantitative real-time PCR[J~．J
Mol D n朋 ，3(2)：55—61
Millson A，SuIi A，Hartung L，et a1．2003．Comparision of two
quantitative polymerase chain reaction methods for detecting
HER2／neu amplifcation[J]．J Mol Diagn，s(3)：184—190
Montgomery RA。Dalma n MJ．1997．Semi-quantitative polymerase
chain reaction analysis of cytokine and cytokine receptor gene ex—
pression during thymic ontogeny[J]．Cytokine，9(10)：717—726
Nigro JM，Takahashi MA．Ginzinger DG，eta1．2001．Detection of
lp and 19q loss in oligodendroglioma by quantitative microsatel—
lite analysis，a real-time quantitative PCR assay[J]．Am J
Pathol，4：1 253— 1 262
Raggi CC，Bagnoni ML，T0nini GP，et a1．1999．Real-time quanti—
tative PCR for the measurement of MYCN amplification in hu—
man neuroblastoma with TaqMan detection system[J]．Clin
Chem，45(11)：1 918—1 924
Schmidt MA．ParrottⅥrA．2001．Quantitative detection of trans-
genes in soybean[Glycine u Merril1]and peanut(Arachis
hypogaea)by real—time polymerase chain reaction[J]．Plant
C ￡Rep，20：422-428
Schmittgen TD，Zakrajsek BA，M．1ls AG，eta1．2000．Quantitative
reverse transcription-polymerase chain reaction to study mRNA
decay：comparison of endpoint and real-time methods[J]．Anal
Biochem，285(2)：194—204
Sbou HX，Frame BR，W1litham SA，et a1．2004．Assessment of trans—
genie maize events produced by particle bombardment or Agrobaeteri—
urn-mediated transformation[]]．Mol Breed，13：201—2o8
s0ng P，Cai CQ，Skokut M 。et a1．2002．Quantitative real-time
PCR as a screening tool for estimating transgene copy number in
wHIsKERsTM derived transgenic maize[J]．Plant Cell Rep。
20：948— 954
Tyagi S，Kramer FR．1996．Molecular beacons：probes that fluo—
resce upon hybridization[J]．Nat Biotechnol14(3)：303-308
Weng HB，Pan AH，Yang LT，et a1．2004．Estimating number of
transgene copies in transgenic rapessed by real-time PCR assay
with HMG I／Y as an endogenous reference gene[J]．Plant Mol
Biol Rep，22：1— 12
Wo0 TH，Patel BK，Cinco M，et a1．1999．Identification of Lepto-
spira biflexa by real-time homogeneous detection of rapid cycle
PCR product[J]．J Microbiol Methods，35(1)：23-3O
Yang L，Zhao Z，Ding J，et a1．2005．Estimating copy number of
transgenes in transformed rice by real—time quantitative PCR[J]．
C^ J F0od Hygiene，17(2)：140—144(in chinese)
Yin JL，Shackel NA，Zekry A，et a1．2001．Real-time reverse tran-
scriptase-polymerase chain reaction(RT-PCR)for measurement of
cytokine and growth factor mRNA expression with fluorogenic
probes or SYBR Green I[J]．1mmunol Cel Biol，79(3)：213—221
术 木 术 木 木 木 术 术 术 术 木 术 术 术 术 术 木 木 爿c 术 术 术 木 木 术 丰 术 术 术 术 术 术 术 木 木 术 术 木 术 术 术 爿c 术 木 术 木 术 术 木
(上接第 376页 Continue from page 376)
to)me of poplar and application to the discovery of drought-stress
responsive proteinsFJ]．Protetnnics，6：6 5O9—6 527
Rakwal R，Komatsu S．2000．Role of jasmonate in the rice(Oryza
sativa)sel~defense mechanism using proteome analysis[j~．Elec—
trophoresis，21：2 492—2 500
Ramagopal S 1987．Salinty stress induces tissue-specific proteins in
barley seedlings[J]．Plant Physiol，84：324-331
Ramani S，Apte SK．1997．Transient expression of multiple gene in
sa-linity-stressed young seedling of rice(Oryza sativa)ev．Buraq
Rata[J]．Biochem B phys Res G∞Ⅲ “”，223：663-667
Rep M，【)ekker HL，Vossen JH，et a1．2002．Mass spectrometric i—
dentification of isoforms of PR proteins in xylem sap of fungus-in—
fected tomato[J]．Plant Physiology，130：9O4～917
Rossignol M，Pehier JB，Mock HP，et a1．2006．Plant proteome analy—
sis：A 2004-2006 updated]．Proteomics，6：5 529—5 548
Salekdeh GH，Siopongco J，Wade U ，eta1．2002m Proteomic analysis
of rice leaves during drought stress and recovery[J-]．Proteomics，
2：1 131一 I 145
Salekdeh GH，Siopongco J，Wade LJ，et a1．2002．A pmteomi c印一
proach to analyzing drought-and sah-responsivenes in rice[J~．P
Crop Res．76：199—219
Sarry JE。Kuhn L，Ducruix C，et a1．2006．The earlyresponses
of Arabidopsis thaliana cells to cadmium exposure explored
by protein and metab01iteprofiling analyses[J]．Proteomics，
6：2 18O— Z l98
Shaholari B，Peskan-Berghofer T，Oelmuller R．2004．Receptor
kinases with leucine-rieh repeats are enriched in Triton X-IO0 in—
soluble plasma membrane microdomains from plants[J]．Physiol
Plant，122：397— 403
Slaymaker DH，Keen NT．2004．Syringolide elicitor-induced oxi—
dative burst and protein phosphorylation in soybean cels，and
tentative identification of two affected phosphoproteins[J]．
Plant Sci，166：387～ 396
Vincent D，Lapierre C，Poler B，et a1． 2005． Water deficits affect
cafeate O-methyhransferase，1 gnification，and related enzymes in
maize leaves．A proteomic investigation[J]．Plant Physiol，137：
949——960
Vincent D。Zivy~L 2007．Plant Proteome Responses to Abiotic
Stress[M]／／J amai J Thelen(eds)．Plant proteomies．Berlin
Heidelberg：Springer：346—364
W u DH 。Laidman DL． 1 997． Isolation of six low molecular
weight heat shock proteins and partial characterization of
heat shock protein 29 from mung bean hypocotyls[J]．Phy—
tochemistry，44：985—989
Yan S，Tang Z，Su W ，et a1．2005．Proteomic analysis of salt
stress—responsive proteins in rice root EJ]．Proteomics，5：
235— 244