全 文 ：2015 年 7 月 1 日 第 7 期
No． 7 1 July 2015
中 医 学 报
CHINA JOURNAL OF CHINESE MEDICINE
第 30 卷 总第 206 期
Vol． 30 Serial No． 206
·中药研究·
* 基金项目:国家科技重大专项课题———创新药物研究开
发———候选药物研究 ( 2012ZX09103201 － 024 ) ; 河南省科技
创新人才计划项目( 114200510014)
山橿乙醇提取物中总黄酮与二苯乙烯类化合物分离工艺研究*
高丹丹，孙孝亚，许佳佳，陈随清
河南中医学院，河南 郑州 450046
摘要:目的:研究山橿药材体积分数 70%乙醇提取物中总黄酮与二苯乙烯类化合物的分离工艺。方法:山橿原药材提取挥发
油后，用体积分数 70%的乙醇超声提取，提取物用不同浓度的乙醇梯度洗脱，收集洗脱液，参照山橿指纹图谱，用高效液相色
谱法测定其中所含的总黄酮及二苯乙烯类化合物的量。结果:山橿药材体积分数 70%的乙醇提取物用体积分数 65%乙醇洗
脱至 1 500 mL时二苯乙烯类化合物的含量最高且总黄酮的量较少;用体积分数 90%的乙醇洗脱至 2 500 mL时总黄酮的量最
高。结论:确立了山橿药材体积分数 70%乙醇提物中二苯乙烯类及总黄酮的分离工艺，为以后山橿有效成分的提取分离及进
一步研究奠定了基础。
文献引用:高丹丹，孙孝亚，许佳佳，等．山橿乙醇提取物中总黄酮与二苯乙烯类化合物分离工艺研究［J］．中医学报，2015，30
( 7) : 1010 － 1013．
关键词:山橿;乙醇提取物;二苯乙烯类;总黄酮;分离工艺
DOI: 10． 16368 / j． issn． 1674 － 8999． 2015． 07． 348
中图分类号:R284． 2 文献标志码:A 文章编号:1674 － 8999(2015)07 － 1010 － 04
Study on Separation Process of Total Flavonoids and Toluylene
Compounds from Ethanol Extract of Lindera Reflexa
GAO Dandan，SUN Xiaoya，XU Jiajia，CHEN Suiqing
Henan University of Traditional Chinese Medicine，Zhengzhou Henan China 450046
Abstract:Objective:Study the separation process of total flavonoids and toluylene compounds from ethanol extract of Lindera reflexa．
Methods:Volatile oil were extracted from Lindera reflexa Hemsl raw material，with volume fraction of 70% ethanol ultrasonic extraction，
extract with different concentration ethanol gradient elution and collecting the eluent，the reference fingerprint atlas of Lindera reflexa，
determination of the contents contained flavonoids and stilbenes compounds by HPLC． Results:70% ethanol extract of Lindera reflexa
used the volume fraction of 65% ethanol elution to 1 500 mL of stilbene compounds content highest and total flavonoids of less;with
90% ethanol elution to 2 500 mL when the highest amount of total flavonoids． Conclusion:Establish separation process of total fla-
vonoids and toluylene compounds from ethanol extract of Lindera reflexa and lay a foundation for the extraction and separation of the ef-
fective components in Lindera reflexa．
Reference citation:GAO Dandan，SUN Xiaoya，XU Jiajia，et al． Study on Separation Process of Total Flavonoids and Toluylene Com-
pounds from Ethanol Extract of Lindera Reflexa［J］． China Journal of Chinese Medicine，2015，30(7):1010 － 1013．
Key words:Lindera reflexa;ethanol extract;toluylene compounds;total flavonoids;separation process
山橿 Lindera reflexa Hemsl 系樟科 Lauraceae 山胡椒属植 物山橿的根，俗名土沉香、香棍等。主要分布于河南(大别
山、伏牛山南部及桐柏山)及华中、华南等地。本品为近年来
发现的民间中草药，历代本草无记载。近代《中国植物
志》［1］《全国中草药汇编》［2］《中药大辞典》［3］《浙江药用植
物志》［4］等均有记载。山橿具有行气止痛、健脾止血、活血消
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肿的功效，主治胃寒疼痛、胃脘胀痛、嗳气吞酸及消化性溃疡
等症;河南省羚锐制药股份有限公司生产的以山橿为主要原
料制成的中成药制剂“胃疼宁片”已用于临床多年，功效确
切［5］。国内目前对山橿的研究大多集中于挥发油类成分，对
其他类成分的报道不多。近年来的研究资料显示山橿中含
有黄酮类和二苯乙烯类化合物［6］，本实验主要探究二苯乙烯
及总黄酮的分离工艺，为后期以山橿为主要成分的中药制剂
的药理、药效学的探究提供依据，并为进一步的研究开发奠
定基础。
1 仪器与材料
1． 1 仪器与试剂 Waters 1525 型高效液相色谱仪配备
2489 型紫外检测器(美国 Waters 公司);EYELA SB-1100 型
旋转蒸发仪(日本东京理化株式会社);DGX-9143 型真空干
燥箱(上海南荣实验室设备有限公司);KQ-500DV 型数控超
声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。DM-130 型大孔吸
附树脂(山东鲁抗立科药业有限公司);色谱甲醇(赛默飞世
尔科技有限公司);其他试剂均为分析纯。
1． 2 实验药材 山橿药材 2010 年采自河南省信阳市新县，
经河南中医学院生药教研室陈随清教授鉴定为樟科山胡椒
属植物山橿的地下根，样品存于河南中医学院生药研究室。
2 方法与结果
2． 1 上样液的制备 称取山橿药材 50 g，按照《中华人民共
和国药典》2010 年版一部附录 XD项下挥发油测定法甲法提
取挥发油［7］，药渣加入 12 倍量的体积分数 70%的乙醇超声
提取 1 h，重复提取 2 次，合并 2 次的醇提取液，调整其醇体
积分数至 70%，静置 12 h，抽滤，减压回收乙醇至无醇味，将
其定容到 1 000 mL，作为上样液备用。
2． 2 供试品溶液的制备
2． 2． 1 树脂的预处理 取市售 DM-130 型大孔吸附树脂，体
积分数 95%乙醇浸泡 24 h，湿法装柱，用乙醇作流动相冲洗
树脂，至与水混合不呈白色混浊为止。再以蒸馏水作流动相
冲洗树脂，洗至无醇味，湿态保存备用。
2． 2． 2 上样液洗脱及供试品溶液制备 取 4 BV(以树脂量
计，下同)的上样液上样，调流速为 1． 0 mL·min －1，上样完
成后静置吸附 2 h。静置后先以 4 BV 的蒸馏水除杂，在以
1 000 mL 体积分数 55%乙醇洗脱，调流速为 1． 5 mL·min －1，收
集体积分数 55%(0 ～ 1 000 mL)的洗脱液。之后在以500 mL
的量依次洗脱，并分别收集体积分数 55% (1 000 ～ 1 500
mL)、体积分数 55% (1 500 ～ 2 000 mL)、体积分数 55%
(2 000 ～ 2 500 mL)洗脱液。将所收集的各个洗脱液依次合
并，并分别吸取 0． 5 mL的体积分数 55%(0 ～ 1 000 mL)、体
积分数 55%(0 ～ 1 500 mL)、体积分数 55%(0 ～ 2 000 mL)、
体积分数 55%(0 ～ 2 500 mL)的洗脱液置于烘箱中挥干，挥
干后用 2 mL 甲醇完全溶解并用 0． 22 μm 的微孔滤膜过滤，
滤液即为供试品溶液。
以 2． 2． 2 的方法分别用体积分数 60%、65%、70%、
75%、80%、85%、90%、95%的乙醇进行梯度洗脱并制成供
试品溶液。
2． 3 色谱条件 Waters Symmetry C18(4． 6 mm × 250 mm，5
μm)色谱柱，紫外检测器，流动相甲醇(A)-水(B)梯度洗脱
(0 ～ 15 min，体积分数 25% ～ 70% A;15 ～ 50 min，体积分数
70% ～ 100% A;50 ～ 65min，100% A;65 ～ 90 min，体积分数
100% ～25%A)，检测波长:297 nm，柱温:30 ℃，流速:1． 0
mL·min －1，进样量:10 μL［8］。
2． 4 实验结果
2． 4． 1 山橿指纹图谱及已指认特征峰的归属 本实验参考
的山橿指纹图谱为陈磊磊参照《中药注射剂指纹图谱研究的
技术要求》(暂行)，运用指纹图谱分析软件 chromap1． 5 进行
分析，根据 10 批供试品高效液相图谱，生成的对照指纹图
谱［9］，见图 1。根据本实验室前期对山橿中分离出的已知成
分的研究，确认了指纹图谱 12 个共有峰中的 7 个成分，结果
见表 1。
图 1 山橿指纹图谱
随着洗脱浓度的递增，指纹图谱中 12 个指纹峰先后的
出现顺序为 1→2→3→8→4→7→5→9→10→11→12→6。根
据二苯乙烯及总黄酮类化学成分结构的差异及同类成分的
相似性，分析得知在大孔吸附树脂中随着乙醇洗脱浓度的增
加，二苯乙烯类成分先被洗脱，黄酮类成分后被洗脱。根据
本实验室前期的研究基础得知山橿指纹图谱的 12 个特征峰
中二苯乙烯类为:1 号、2 号、4 号、7 号、8 号峰;黄酮类成分
为:3 号、5 号、9 号、10 号、11 号、12 号峰;6 号峰为其他类成
分，且含量较少。
2． 4． 2 数据处理 高效液相色谱峰的峰面积与进样液的含
量成正相关，色谱图中较大的特征峰已基本确定，故将其中
的二苯乙烯类的特征峰即 1 号、2 号、4 号、7 号、8 号峰的峰
面积相加来代表山橿药材中二苯乙烯类的量;将 3 号、5 号、9
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号、10 号、11 号、12 号峰的峰面积的相加代表山橿药材中黄
酮类成分的量。但最终要折算出各类成分的总质量为指标
来考察工艺条件，当含量转化为质量时需考虑到洗脱液体积
的因素，进行折算后进行比较。以(0 ～ 1 000 mL)洗脱液峰
面积 A1000为参考基准，则(0 ～ 1 500 mL)洗脱液的峰面积
A1500需乘以系数 k1 = 1． 5，同理(0 ～ 2 000 mL)洗脱液峰面积
A2000需乘以系数 k2 = 2． 0，(0 ～ 2 500 mL)洗脱液需乘以系数
k3 = 2． 5。以折算后的峰面积进行分析和比较见表 2，从而确
定山橿醇提液中二苯乙烯类和总黄酮的分离工艺为:体积分
数 65%的乙醇冲至 1 500 mL 时二苯乙烯的相对含量为
94. 47%，总黄酮的相对含量为 5． 53%，二苯乙烯含量高且总
黄酮含量较低;体积分数 90%的乙醇冲至 2 500 mL时总黄酮
的含量最高。通过对实验的再次验证，验证结果与实验结果
相符，证明实验结果可靠。
表 1 已指认特征峰的成分
特征峰编号 1 2 3 4 5 6 8
成分 二苯乙烯苷(sj-13) 银松素 乔松素 银松素甲醚 球松素 其他类(sj-15) 二苯乙烯(sj-11)
注:sj-11 为 3，5-二羟基-2-(1-对薄荷烯基)-反式-二苯乙烯，Sj-13 为银松素-3，5-二-O-β-D-葡萄糖苷，Sj-15 为 4-羟基-3-［(1R，6R)-1-对薄荷
烯基］-6-(4-苯基-2-乙酰氧基-丁基)-2H-吡喃-2 酮
表 2 各浓度梯度洗脱液的峰面积
浓度梯度 折合后 A1(二苯乙烯类) A1排序 折合后 A2(黄酮类) A2排序 A1-A2 差值排序
55%(0 － 1 000) 593 037． 000 36 0． 000 31 593 037． 000 35
55%(0 － 1 500) 1 361 188． 500 35 0． 000 31 1 361 188． 500 34
55%(0 － 2 000) 2 264 534． 000 32 0． 000 31 2 264 534． 000 32
55%(0 － 2 500) 2 639 827． 500 29 0． 000 31 2 639 827． 500 29
60%(0 － 1 000) 2 424 952． 000 30 0． 000 31 2 424 952． 000 30
60%(0 － 1 500) 2 229 895． 500 33 0． 000 31 2 229 895． 500 33
60%(0 － 2 000) 2 344 968． 000 31 43 634． 000 30 2 323 151． 000 31
60%(0 － 2 500) 2 819 347． 500 28 100 792． 500 29 2 779 030． 500 28
65%(0 － 1 000) 14 307 561． 000 2 540 108． 000 17 13 767 453． 000 2
65%(0 － 1 500) 14 567 101． 500 1 852 963． 000 14 13 998 459． 500 1
65%(0 － 2 000) 14 170 702． 000 3 1 080 738． 000 11 13 630 333． 000 3
65%(0 － 2 500) 13 825 020． 000 4 1 440 712． 500 10 13 248 735． 000 4
70%(0 － 1 000) 3 375 845． 000 27 227 543． 000 28 3 148 302． 000 27
70%(0 － 1 500) 4 376 329． 500 25 340 756． 500 25 4 149 158． 500 25
70%(0 － 2 000) 4 586 972． 000 24 414 126． 000 21 4 379 909． 000 24
70%(0 － 2 500) 3 927 927． 500 26 344 445． 000 24 3 790 149． 500 26
75%(0 － 1 000) 5 561 006． 000 19 345 635． 000 23 5 215 371． 000 17
75%(0 － 1 500) 6 148 990． 500 16 371 077． 500 22 5 901 605． 500 15
75%(0 － 2 000) 6 635 326． 000 14 437 658． 000 19 6 416 497． 000 14
75%(0 － 2 500) 6 725 975． 000 13 452 560． 000 18 6 544 951． 000 13
80%(0 － 1 000) 4 871 328． 000 23 299 753． 000 26 4 571 575． 000 23
80%(0 － 1 500) 5 213 407． 500 22 293 872． 500 27 5 017 492． 500 21
80%(0 － 2 000) 5 382 388． 000 20 429 558． 000 20 5 167 609． 000 18
80%(0 － 2 500) 5 351 157． 500 21 771 712． 500 15 5 042 472． 500 20
85%(0 － 1 000) 7 791 341． 000 11 547 225． 000 16 7 244 116． 000 9
85%(0 － 1 500) 7 918 921． 500 10 1 052 256． 000 12 7 217 417． 500 10
85%(0 － 2 000) 7 975 184． 000 9 1 517 244． 000 9 7 216 562． 000 11
85%(0 － 2 500) 7 485 012． 500 12 1 686 345． 000 6 6 810 474． 500 12
90%(0 － 1 000) 9 733 831． 000 5 972 475． 000 13 8 761 356． 000 5
90%(0 － 1 500) 8 992 771． 500 8 1 895 790． 000 3 7 728 911． 500 8
90%(0 － 2 000) 9 231 772． 000 7 2 421 046． 000 2 8 021 249． 000 7
90%(0 － 2 500) 9 279 965． 000 6 2 584 480． 000 1 8 246 173． 000 6
95%(0 － 1 000) 1 824 796． 000 34 1 540 363． 000 8 284 433． 000 36
95%(0 － 1 500) 6 532 365． 000 15 1 706 808． 000 5 5 394 493． 000 16
95%(0 － 2 000) 5 631 634． 000 18 1 658 166． 000 7 4 802 551． 000 22
95%(0 － 2 500) 5 728 015． 000 17 1 711 307． 500 4 5 043 492． 000 19
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3 讨论
大孔吸附树脂是由聚合单体和交联剂、致孔剂、分散剂
等添加剂经聚合反应制备而成的一类有机高聚物吸附剂，通
过静电引力和范德华力对吸附质作用达到分离的目的［10］。
按其极性强弱，通常分为非极性、弱极性和极性 3 类，在水和
有机溶剂中可以吸收溶剂而膨胀。大孔吸附树脂就自身特
性而言，具有理化性质稳定，不溶于酸、碱及有机溶剂，选择
性较好，不受无机物影响、比表面积较大、交换速度较快、机
械强度高、对被提取物污染小、热稳定好等众多优点，在环
保、医药、化工、分析化学、临床鉴定等领域应用很广泛。
黄酮类化合物和二苯乙烯类化合物为中药中常见且含
量较大的活性成分，根据其极性常采用乙醇提取［11-12］，经过
等电点沉淀、离心与超滤处理，可除去其中所含的大多数杂
质，黄酮类化合物因其含有酚羟基，依据氢键吸附原理常采
用聚酰胺色谱分离纯化。
黄酮与二苯乙烯类化合物结构相似，乙醇提取时不易将
两者分离，但二者的极性不同，利用 DM-130 型大孔吸附树脂
对不同极性物质的吸附能力不同，采用不同浓度的乙醇梯度
洗脱，可达到比较理想的分离水平，本实验利用此方法对山
橿中的黄酮类成分和二苯乙烯类成分进行了分离，并获得了
比较理想的效果，为进一步研究提供了参考。但由于大孔吸
附树脂具有粒径分布广、分离效果较差这一缺点，可进一步
结合制备液相色谱，可达到很好的分离纯化富集效果。
参考文献:
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收稿日期:2015 － 02 － 02
作者简介:高丹丹( 1987 － ) ，女，河南开封人，硕士研究生，研
究方向:中药规范化种植与质量标准研究。
通信作者:陈随清( 1965 － ) ，男，河南濮阳人，教授，博士研究
生导师，主要从事中药规范化种植与质量标准研究。Email:
suiqingchen@ sohu． com
编辑:
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来 稿 要 求
来稿文字、数字、计量单位和符号务请按有关国家
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《中医学报》编辑部
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