全 文 ：【论 著】
阴香植物精油对白色念珠菌生物膜的抑制研究
黄晓敏，王晨明1，管文华，林少芸，袁华珍，余培凯
(韶关学院英东生命科学学院，广东韶关 512005; 1 韶关学院物理与机电工程学院)
摘要 目的 观察阴香精油对白色念珠菌生物膜(BF)的抑制作用。方法 采用改良 Brown平板连续培养法制备
生物膜和应用悬液定量杀菌试验法，对阴香精油抑制白色念珠菌生物膜的效果进行了实验室检测。结果 用体积
分数 2. 5%阴香精油作用 30 min，对培养 3 d的白色念珠菌生物膜达到完全杀灭;作用 90 min对培养 7 d的白色念
珠菌生物膜达到完全清除。用体积分数 2. 5%阴香精油作用 10 min，可完全杀灭悬液内白色念珠菌浮游菌。结论
阴香精油对白色念珠菌生物膜有清除效应，可抑制生物膜形成，对悬液内浮游菌杀灭效果更好。
关键词 阴香精油;白色念珠菌;生物被膜;杀灭效果
中图分类号:R187． 1 文献标识码:A 文章编号:1001 － 7658(2012)08 － 0666 － 03
STUDY ON THE INHIBITORY EFFECTS OF ESSENTIAL OILS ON Candida albicans BIO-
FILM
HUANG Xiao －min，WANG Chen － ming1，GUAN Wen － hua，LIN Shao － yun，YUAN Hua － zhen，YU
Pei － kai
(Yingdong College of Bioscience，Shaoguan University，Shaoguan Guangdong 512005，1 Institute of Physics and Mechani-
cal ＆ Electrical Engineering ，Shaoguan University，China)
Abstract Objective To observe the inhibitory effect of essential oil on Candida albicans biofilm． Methods The mod-
ified Browns Plate method and the carrier quantitative germicidal test were used to observe the inhibitory effect of essential
oil on C． albicans． Results The C． albicans biofilm cultivated for 3 days and 7 days exposed to 2. 5% (v /v)essential oil
compound preparation for 30 min and 90 min respectively were completely killed． While the pelagic C． albicans in suspen-
sions exposed to 2. 5% (v /v)essential oil compound preparation for 10 min were completely killed． Conclusion Essen-
tial oil has cleaning effect on C． albicans biofilm and can inhibit biofilm formation． It has better killing effect on pelagic C．
albicans．
Key words essential oil ;Candide albicans ;biofilm;germicidal effect
〔作者简介〕 黄晓敏(1955 －) ，女，湖南郴州人，大学本科，教授，从
事医学微生物学研究。
〔资助项目〕 香港铭源基金资助项目(2009314 － 140546) ;韶关市
科技计划项目(2011 － 2060502)。
植物精油是一类植物源次生代谢物质，分子量
较小且可随水蒸汽蒸出，具有一定挥发性的油状液
体物质。阴香(Cinnamomum burmannii)为樟科
(Lauraceae)樟属(Cinnamomum)植物，近似肉桂气
味〔1〕，具有散寒、活血之功效，药用价值极高。阴香
叶片和树皮蒸馏提取的芳香油在医药和工业上得到
广泛应用。为研究阴香精油体外抗菌效果，以白色
念珠菌生物膜为作用对象模型，对其进行了实验室
抑菌作用和杀菌效果测定。现将结果报告如下。
1 方法
1. 1 阴香精油制备
选择新鲜阴香叶按 2005 年版《中国药典》提取
植物精油的方法，采用水蒸汽蒸馏法获得阴香叶提
取物;再利用无水乙醚萃取，获得无水乙醚与阴香叶
精油的混合物。纯精油分离工艺是利用乙醚的沸点
低(34. 8℃)的原理，将精油混合物置于 40℃恒温水
浴箱中 5 min，乙醚完全挥发掉，剩余为阴香叶精油
与部分沉淀在底层的水。收取上层阴香精油原液用
浓度为 50 g /L吐温 80 生理盐水溶液稀释配制不同
浓度的阴香叶精油试验用液体，经过孔径 0. 22 μm
滤膜滤过除菌后低温保存备用。
1. 2 体外抗菌试验
1. 2. 1 制备菌悬液 试验菌为粤北人民医院检验
·666· Chinese Journal of Disinfection 2012;29(8)
科临床分离的株白色念珠菌，编号为 YBY102，经
TDR －200B全自动型微生物分析仪检测鉴定证实。
取纯化分离培养的典型菌落〔3〕，接种培养出菌悬液
用于制备生物膜。将复苏后传代培养 24 h 的白色
念珠菌临床株接种于 PDA 肉汤中 37℃试管摇床培
养过夜后，用无菌生理盐水离心洗 2 次，再用生理盐
水重新悬浮。用分光光度计 560 nm 测定其吸光度
值，使菌悬液的 A 值达 0. 029(相当菌细胞数约为
1. 5 × 106cfu /ml)。
1. 2. 2 生物膜制备与鉴定 ①制备:以文献〔2〕方法
为基础，结合本试验实际要求进行改良。将孔径
0． 22 mm高分子除菌滤膜用打孔器制成直径 7 mm
圆片，经压力蒸汽灭菌后平铺在 PDA 琼脂平板上。
取 20 μl 白色念珠菌菌悬液加在膜片表面，置 37℃
孵箱培养，每 24 h将膜片转移至新的 PDA 平板上，
连续培养 3 d和 7 d 制备成不同时间的生物膜。②
鉴定:取 PDA 琼脂平板上 BF 载体膜，用 pH 值为
7. 2 的磷酸盐缓冲液(PBS)进行漂洗，在 4℃环境下
以浓度 25 g /L 的戊二醛固定 4 h;再用 PBS 漂洗 3
次，每次 15 min。然后按体积分数 50%、70%、90%
和 100%乙醇作梯度脱水，每梯度 15 min，在 100%
乙醇中连续脱水 3 次;用醋酸异戊酯置换乙醇 0. 5
h。置于二氧化碳临界点干燥仪作二氧化碳临界点
干燥，粘台，用 HCP － 2 离子溅射仪喷金，经扫描电
镜观察确认生物膜的形成。
1. 2. 3 中和剂选择试验 以白色念珠菌为指标菌，
设平行 6 组，用载体定量鉴定试验程序进行中和剂
试验。结果判定标准，依照 2002 年版《消毒技术规
范》规定执行。试验重复 3 次，每次结果均符合要
求，即可判定中和剂选择适宜。
1. 2. 4 对生物膜抑制作用测定 分别将一定浓度
的阴香精油加入到 PDA培养液内，使阴香精油在培
养液内形成不同终浓度，均调 pH值至 7. 4。按照不
同终浓度的阴香精油溶液分别各取 5 ml置 50 ml无
菌三角烧瓶内，将培养 3 d 和 7 d 的生物膜载体膜
片，用无菌生理盐水冲洗 1 min，在每个三角烧瓶内
放入一张膜片。于 22℃水浴(阳性对照为 PBS)作
用不同时间，取出生物膜载体，加入装有 5 ml 中和
剂的玻璃匀浆器内，中和作用 10 min。将膜片研磨，
使载体表面的 BF及 BF内的白色念珠菌脱落，形成
菌悬液，连同阳性对照各取 1 ml 作倾注接种，进行
活菌计数。每个时间段测试 3 次。
1. 3 悬液定量杀菌试验
室温条件下，在无菌试管内加入体积分数
2. 5%阴香精油溶液 4． 0 ml与 1 ml含菌量为 1. 5 ×
106 cfu /ml白色念珠菌浮游菌悬液，立即混匀并计
时。作用至设计时间，取样液 0. 5 ml 加入到 4. 5 ml
中和剂的试管内。经中和作用 10 min，充分混匀取
样液接种培养，进行活菌计数，计算平均杀灭率。试
验重复 3 次。
2 结果
2. 1 中和剂选择试验结果
结果表明，用含卵磷脂 1 g /L、硫代硫酸钠 1
g /L、10 g /L吐温 80 组成的中和剂，可有效中和阴香
精油对试验菌的残留作用，该中和剂及其中和产物
对白色念珠菌活性及培养基无明显影响。
2. 2 生物膜形成鉴定结果
经扫描电镜观察表明，培养 3 d 的白色念珠菌
生物膜载体真菌相互附着，但粘附空间明显表现出
稀疏，黏附在一起的白色念珠菌并不是很厚，可以看
出其层次，此时白色念珠菌生长以酵母相为主，在菌
体上可明显看见的白色念珠菌芽管的形态较少，已
形成生物膜的雏形(图 1)。培养 7 d 的白色念珠菌
生物膜载体可见白色念珠菌分泌的胞外基质和菌体
共同作用下成堆叠累，还可以观察到白色念珠菌间
的多糖蛋白纤维丝(借助其相互作用，形成生物被
膜)。此时，白色念珠菌表现出的芽管，有的比菌体
长出许多倍，生物膜中混有酵母相和菌丝相(图 2)。
由于做 BF显微鉴定时，载体样品处理过程中经过
多次乙醇脱水与干燥等步骤，因此可以推测生物被
膜中白色念珠菌之间在未处理前充满了黏液，而且
这些黏液中糖类物质占大部份。
图 1 培养 3 d的白色念珠菌 BF(×3000)
图 2 培养 7 d的白色念珠菌 BF(×3000)
·766·中国消毒学杂志 2012 年第 29 卷第 8 期
2. 3 抑制生物膜试验结果
结果表明，用体积分数 2. 5%阴香精油作用 30
min，对培养 3 d 的白色念珠菌生物膜达到完全杀
灭;作用 90 min 对培养 7 d 的白色念珠菌生物膜达
到完全清除(表 1)。
表 1 阴香精油对白色念珠菌生物膜抑制试验结果
时间
(min)
不同浓度(%)阴香精油对培养不同时间生物膜作用不同时间的存活菌数(cfu /膜载体)
培养 3 d生物膜
2. 5 1. 5 0. 75
时间
(min)
培养 7 d生物膜
2. 5 1. 5 0. 75
0 74 000 000 52 000 000 33 000 000 0 81 000 000 84 000 000 79 000 000
10 54 000 480 000 2 240 000 10 6 340 000 74 200 000 255 000 000
20 101 502 698 30 412 000 665 000 2 320 000
30 0 175 560 60 574 4 120 10 300
40 0 86 244 90 0 380 1 200
50 0 42 204 120 0 0 186
60 0 0 110 150 0 0 0
70 0 0 26
80 0 0 0
注:0 作用时间为阳性对照组菌数。
2. 4 杀菌试验结果
试验结果显示，在室温条件下，将白色念珠菌浮
游菌于体积分数 2. 5% 阴香精油悬液内作用 10
min，检测不出存活菌，可达到完全杀灭。
3 讨论
阴香精油是一类植物源次生代谢物质，其化学
成分非常复杂，大致可分为萜烯类、芳香族、脂肪族
和含氮含硫 4 大类化合物。阴香精油具有来源于天
然、对人体相对安全、与环境友好、生物活性多样等
特点，开发植物精油具有广阔的发展前景。
本试验选择白色念珠菌作为指标模型细菌，依
据其广泛分布于人体皮肤、黏膜以及环境表面，是一
种重要的条件致病性真菌，很容易成为免疫力低下
人群致病菌。近 20 年来，白色念珠菌病的感染发病
率增加了近 40 倍，其中相当一部分与白色念珠菌形
成生物膜(BF)密切相关〔3〕。白色念珠菌具备从酵
母相向菌丝相转换的特性，转化为菌丝状态的白色
念珠菌，致病能力显著增强〔4〕。芽管是白念菌丝体
的早期形态，是临床鉴定白色念珠菌的依据之一，同
时研究显示芽管的形成与白色念珠菌毒力的增强密
切相关。
现有的抗菌剂抗菌性能检测标准是以游离于液
体培养基中的细菌和真菌的单细胞状态作为研究对
象，这虽然在程序上简化了外界环境对实验结果的
影响，但越来越多的研究表明在自然状态下，微生物
很少以这种纯培养基中的游离形式存在，生物膜才
是它们最常见的生存方式和生态环境。因此，本试
验采用模拟生物医学材料体外制备白色念珠生物
膜，观察该制剂体外抑菌效果;同时对游离菌体也进
行了杀灭试验。试验结果显示，经 3 d 和 7 d 的孵
育，白色念珠菌可在载体上形成早期以酵母相为主
和成熟期的白色念珠菌长出比菌体长出许多倍牙管
的生物膜，生物膜中的白色念珠菌形成酵母相和菌
丝相的菌体。抑菌和杀菌试验结果证明，该阴香精
油在体积分数 2. 5%及其以下浓度的溶液，均显示
出良好的抑菌和杀菌效果。结果提示，该精油对悬
液内游离真菌的杀灭作用比对生物膜杀灭容易;培
养 3 d的白色念珠菌生物膜对阴香精油的耐受能力
不如培养 7 d者强。但成熟与不成熟的生物膜均随
阴香精油浓度增加其耐受时间和杀灭时间缩短，此
可能与生物膜真菌感受环境信号有关〔5〕，在抗菌药
物浓度增高环境信号刺激下，真菌表面相关蛋白发
生应答，使真菌粘附性发生改变，从而调节真菌生物
膜的分散〔6〕。结果充分反映出真菌从生物膜状态
恢复成浮游状态，则有利于恢复阴香精油的敏感性，
这个过程就是生物膜的分散。
(本研究得到南方医科大学电子显微镜室安连
兵老师提供的电镜技术支持，在此致谢。)
参 考 文 献
〔1〕 王锦鸿，陈仁寿．临床实用中药辞典［M］． 北京:金盾出版社，
2003:667 － 802．
〔2〕 Hoiby N，Kroqh JH，Moser C，et al． Pseudomonas aeruginosa and
the in vitro and in vivo biofilm mode of growth［J］． Microbes In-
fect，2001，3(1) :23．
〔3〕 Mukherjee PK，Chandra J，Kuhn DM，et al． Mechanism of flucon-
azole resistance In candida albicans biofilms:phase － specific role
of efflux pumps and membrane sterols［J］． Infect Immun，2003，71
(8) :4333．
·866· Chinese Journal of Disinfection 2012;29(8)
〔4〕 Costerton JW，Stewart PS，Greenberg EP． Bacterial Biofilms:a
common cause of persistent infections［J］． Science，1999，284
(5418) :1318．
〔5〕 Camilli A，Bassler BL． Bacterial small － molecule signaling path-
ways［J］． Science，2006，311(5764) :1113．
〔6〕 Kong FK，Vuong C，Otto M，et al． Staphylococcus quorum sensing
in biofilm formation and infection［J］． Int J Med Microbiol，2006，
296(2 － 3) :133．
(收稿日期:2012 － 01 － 30)
【短篇报道】
唐山市托幼机构消毒质量监测
付学红，杜淑艳
(唐山市疾病预防控制中心，河北唐山 063000)
中图分类号:R174 文献标识码:B 文章编号:1001 － 7658(2012)08 － 0669 － 01
为了规范唐山市托幼机构消毒方法，预防托幼
机构感染性疾病的发生与流行，我们于 2009 － 2011
对唐山市托幼机构进行消毒质量监测，并将结果进
行分析。
1 方法
采样和检测方法依据 2002 年版《消毒技术规
范》、GB15979 － 2002《一次性使用卫生用品卫生标
准》和 GB /T18204 － 2000《公共场所卫生标准》进
行。室内空气采用平板沉降法，将直径 9 cm的营养
琼脂平板在采样点暴露 5 min，36℃培养 48 h 记录
细菌总数;玩具、室内物体表面、工作人员手、餐饮具
用无菌棉拭子沾湿采样液，按规定涂抹采样面积，将
棉拭子头投入到 10 ml 无菌胰胨生理盐水中，振荡
混匀后进行活菌计数和大肠菌群检测。餐饮具大肠
菌群采用大肠菌群快速检测纸片进行现场采样，每
份样品贴 2 张 5 cm × 5 cm 浸湿的纸片，30 s 后取
下，置无菌塑料袋内，36℃培养 18 h。使用中消毒液
用无菌吸管取 1 ml加入到 9 ml 含相应中和剂的稀
释液中混匀，进行活菌计数。
结果判定，室内空气细菌总数≤2 500 cfu /m3;
物体表面(含玩具)细菌总数≤10 cfu /cm2、大肠菌
群不得检出;工作人员手细菌总数≤300 cfu /只，大
肠菌群不得检出;餐饮具细菌总数 ＜ 5 cfu /cm2、大
肠菌群不得检出;使用中消毒液细菌总数≤100
cfu /ml，为合格。
2 结果
共采样 452 份，合格 365 份，平均总合格率
80. 75%，2009 － 2011 年合格率依次为 78. 98%、
79. 50%和 84. 33%;室内空气、玩具、物体表面、工
作人员手、餐饮具、使用中消毒液合格率依次为
88%、92. 78%、82. 83%、66. 33%、76. 00%和 100%
(表 1)。
表 1 唐山市托幼机构消毒质量监测结果
监测项目 采样份数 合格份数 合格率(%)
室内空气 50 44 88. 00
玩具 97 90 92. 78
物体表面 99 82 82. 83
工作人员手 98 65 66. 33
餐饮具 100 76 76. 00
使用中消毒液 8 8 100. 00
合计 452 365 80. 75
3 讨论
连续 3 年监测结果显示，唐山市托幼机构总体
合格率不高，但有逐年提高趋势。工作人员手合格
率较低，这与国内有关文献报道相一致〔1〕，分析原
因，可能与工作人员卫生意识欠缺、洗手设施材料不
健全、洗手方法不正确有关。餐饮具合格率也较低，
建议相关部门加大对托幼机构消毒工作的监督监测
力度，有针对性地对从业人员进行消毒知识、消毒操
作技能培训，提高消毒意识及预防疾病相关知识水
平，以确保托幼儿童的身体健康。
参 考 文 献
〔1〕 韩佳音． 广东省托幼机构消毒质量最监测报告［J］．中国消毒
学杂志，2011，28(5) :608．
(收稿日期:2011 － 12 － 11)
·966·中国消毒学杂志 2012 年第 29 卷第 8 期