全 文 ：临床口腔医学杂志 2011年 11月第 27卷第 11期 J Clin Stomatol,Nov,2011,Vol.27.No.11
口腔白色念珠菌感染常见于免疫缺陷宿主，包括
HIV阳性以及艾滋患者，接受器官移植的患者，化疗患
者等。由于临床上广谱抗生素、免疫抑制剂和糖皮质激
素的广泛应用，恶性肿瘤发病率升高，我国艾滋病疫情
处于快速上升期，口腔白色念珠菌感染病例也随之急
剧上升。
白色念珠菌作为口腔黏膜多种感染致病因子的作
用已得到肯定[1]。与口腔黏膜病有关的白色念珠菌感
染包括口腔念珠菌病、口腔扁平苔鲜、白斑等[2]。因其
感染会加重许多口腔黏膜病病情。例如，口腔黏膜白斑
如果伴有白色念珠菌感染则癌变倾向较大[3]。
口腔白色念珠菌常以生物膜形态存在，使其致病
性和耐药性增加。本研究检测了白鲜碱对白色念珠菌
及体外白色念珠菌生物膜的抑制作用，并用流式细胞
仪探索白鲜碱对白色念珠菌细胞周期的影响，以期了
解该中药抑制白色念珠菌体外生长的可能机理。
材料和方法
1 材料
1．1 实验菌株
国际标准菌株 ATCC76615，由上海市口腔医学研究所提供。
1．2 主要试剂
白鲜碱及氟康唑（中国药品生物制品检定所），吐温－80（国
药集团），二甲基亚砜（DMSO）、RNA酶及碘化丙啶（PI）（上海鼎
国），XTT比色法细胞繁殖测定试剂盒（上海杰美基因）。培养基：
沙堡氏琼脂（上海伊华医学科技）、RPMI1640液体培养基（GIB－
CO）。YPD液体培养基由酵母提取物（OXOID）、蛋白胨（MER－
CK）、葡萄糖配制。
2 方法
2．1 肉汤微量稀释法酵母菌药敏试验检测白鲜碱对白色念
珠菌体外抑制作用
白鲜碱溶于 DMSO，吐温－80增溶，RPMI1640培养基稀释，
DMSO体积分数≤1 ％，Tween－80体积分数≤4 ％，经对照实验
证明此条件下白色念珠菌体外生长不受抑制（数据未显示）。实
验参照 NCCLS M27－A2[4]推荐方法进行。
2．2 XTT减低法检测白鲜碱对体外白色念珠菌生物膜的抑
制作用
白鲜碱对白色念珠菌体外抑制作用初探 *
施琳俊 1，2，薛婷君 3，吴 岚 1，2，朱彩莲 2，周曾同 1，2**
（1上海交通大学医学院附属第九人民医院·口腔医学院口腔黏膜科 上海 200011；
2．上海市口腔医学重点实验室 上海 200011；3．同济大学附属东方医院口腔科 上海 200120）
［摘要］ 目的：检测白鲜碱对白色念珠菌的抑制作用，及其对白色念珠菌细胞周期的影响。方法：采用白色念珠菌
标准菌株（ATCC76615）为研究对象，用经典方法测定白鲜碱对白色念珠菌的最小抑菌浓度（MIC），抑制生物膜 50 ％
（SMIC50）的药物浓度，流式细胞仪分析白鲜碱对白色念珠菌细胞周期的影响。结果：白鲜碱对白色念珠菌的 MIC为
312．5 μg／mL，对生物膜的 SMIC50为 1250 μg／mL，白鲜碱能使白色念珠菌生长停滞。结论：白鲜碱具有抑制白色念
珠菌生长的能力。
［关键词］ 白色念珠菌；生物膜；白鲜碱；流式细胞仪；细胞周期
［中图分类号］ R781．5 ［文献标识码］ A doi：10．3969／j．issn．1003－1634．2011．11．005
In vitro antifungal activity of dictamnine against candida albicans． SHI Lin－jun1，2，XUE Ting－jun3，WU Lan1，2，
ZHU Cai－lian2，ZHOU Zeng－tong1． 1．Department of Oral Mucosal Diseases，College of Stomatology，The Ninth People＇s Hos－
pital，School of Medicine，Shanghai Jiaotong University，Shanghai 200011，China；2．Shanghai Key Laboratory of Stomatology，
Shanghai 200011，China；3．Department of Stomatolgy，Shanghai East Hospital，Tongji University，Shanghai 200120，China．
［Abstract］ Objective：To investigate the in vitro antifungal activity of dictamnine against candida albicans and the in－
fluence of dictamnine on the cell cycle of candida albicans． Method：NCCLS M27－A2 broth microdilution method was ac－
cessed to evaluate the in vitro activity of dictamnine against candida albicans（ATCC 76615）． XTT－reduction method was
used to test the SMIC50 of dictamnine against candida albicans biofilms． Flow cytometer was applied to determine the effect
of dictamnine on the cell cycle of candida albicans． Result：MIC of dictamnine against candida albicans was 312．5 μg／mL．
SMIC50 of dictamnine against candida albicans biofilms was 1250 μg／mL． Dictamnine can stop the growth cycle of Candi－
da albicans． Conclusion：Dictamnine displayed in vitro antifungal activity against candida albicans．
［Key words］ candida albicans；biofilm；dictamnine；flow cytometer；cell cycle
*基金项目：上海市卫生局中医药科研基金（2006L031A）；
上海市自然科学基金（11ZR1420400）；
高等学校博士学科点专项科研基金
**通讯作者：周曾同：Tel：021－23271699－5696
E－mail：zhouzengtong＠hotmail．com
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临床口腔医学杂志 2011年 11月第 27卷第 11期 J Clin Stomatol,Nov,2011,Vol.27.No.11
参考文献报道方法 [5]，100 r／min、30 ℃水浴摇床中用 YPD
培养基培养白色念珠菌过夜（＞18 h），收集菌体，PBS清洗。RP－
MI1640培养基稀释菌液至 1～5×106菌落形成单位／毫升（CFU／
mL）。将 100 μL菌悬液接种于 96孔板，35 ℃培养 48 h，使白色
念珠菌完全黏附于平底 96孔板基底，形成生物膜结构。生物膜
形成后，PBS洗 3次。白鲜碱及氟康唑分别按倍比稀释浓度加入
96孔板，设定生长对照孔及阴性对照孔，35 ℃培养 48 h。使用
XTT比色法细胞繁殖测定试剂盒，450 nm波长条件下测吸光度。
以抑制白色念珠菌生长 50 ％的药物浓度作为 SMIC50。实验重
复三次，取平均值。
2．3 流式细胞仪检测白鲜碱对白色念珠菌细胞周期的影响
用 YPD培养基调整菌悬液至 1×106 ～ 107 CFU／mL。白鲜
碱溶液用 YPD培养基倍比稀释，并设空白对照。将不同浓度白
鲜碱 YPD溶液与菌悬液混合，分别在 37 ℃水浴摇床培养 6 h、
12 h和 24 h后，PBS洗 2次，70 ％ PBS酒精固定，4 ℃过夜（＞18
h），形成单细胞悬液。单细胞悬液用 PBS洗 2次，加 RNA酶，37
℃孵育 2 h，加 PI染液，4 ℃染色 18 h，300目尼龙网过滤，上机
检测。流式细胞仪参数：氩离子激光，激发波长 488 nm，PI发射
波长 610 nm，电子信号线性放大，检测器为 FCS，SSC，FLα，每份
样品检测 10000个细胞。测定软件 cell quest，分析软件 Modfit。
增殖指数（PI ％）计算方法
PI ％＝（S＋G2／M）／（G0／G1＋S＋G2／M）×100 ％。
3 统计学方法 相同时间点不同药物浓度组间以及相同
药物浓度不同时间点组间的增值指数（PI ％）差异使用 Spss16．0
软件的独立样本 t检验分析。
结 果
1 白鲜碱对白色念珠菌的最小抑菌浓度（MIC）为 312．5
μg／mL。
2 白鲜碱对白色念珠菌生物膜的抑制作用
随着白鲜碱浓度递增，其对白色念珠菌生物膜的抑制作用
呈逐步增强趋势，氟康唑对其无明显抑制作用，白鲜碱对白色念
珠菌 SMIC50（抑制生物膜 50 ％）为 1250 μg／mL（图 1）。
3 白鲜碱对白色念珠菌细胞周期的影响
12 h培养组内，白鲜碱三个浓度的 PI ％相较于生长对照均
显著提高（P ＜0．05）（表 2），提示白鲜碱在 12 h时间点促进白色
念珠菌的增殖。312．5 μg／mL药物组及 1250 μg ／mL药物组
内，培养 12 h 后的 PI ％值显著高于培养 6 h 后的 PI ％（P ＜
0．05）（表 3），其余均无统计学意义。用药后 6 h和 24 h，各浓度
都有大量处于 DNA合成期－S期细胞（表 1，图 2），白鲜碱能使白
色念珠菌生长停滞。
图 1 白鲜碱对白色念珠菌生物膜的影响
图 2 不同浓度白鲜碱作用不同时间后对白色念珠菌细胞周期的影响
表 2 同一时间点，不同浓度 PI ％分别与对照组（0 μg ／mL）PI ％比较
0 312．5 P 625 P 1250 P
6 h 79 79．5 － 85．9 － 82．4 －
12 h 81．1 87．7 0．003 92 0．001 88．8 0．002
24 h 75．8 77．7 － 74 － 88．6 －
表 3 同一浓度，不同时间点 PI ％分别与 6 h的 PI ％比较
6 h 12 h P 24 h P
0 79 81．1 － 75．8 －
312．5 79．5 87．7 0．012 77．7 －
625 85．9 92 － 74 －
1250 82．4 88．8 0．009 88．6 －
药物浓度
（μg ／mL）
1250
625
312．5
0
G0／G1
17．6
14．1
20．5
21．0
S
54．6
61．2
35．7
40．5
G2／M
27．8
24．7
43．8
38．5
PI
82．4
85．9
79．5
79．0
G0／G1
11．2
8．0
12．3
18．9
S
14．2
0．8
0．6
15．1
G2／M
74．6
91．2
87．1
66．0
G0／G1
11．4
26．0
22．3
24．2
S
63．4
45．5
51．6
60．0
G2／M
25．2
28．5
26．1
15．8
PI
88．6
74．0
77．7
75．8
6 h（细胞周期比例／％） 12 h 24 h
表 1 不同浓度作用不同时间后对白色念珠菌细胞周期的影响
PI
88．8
92．0
87．7
81．1
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临床口腔医学杂志 2011年 11月第 27卷第 11期 J Clin Stomatol,Nov,2011,Vol.27.No.11
讨 论
生物膜是微生物在自然状态下的生存形式[6]。白
色念珠菌具有一系列毒性因子以助其在人体内生存和
繁衍。其中最重要的是利用多种机制黏附在宿主表面
的能力，从而在生物组织与生物材料的表面形成一种
由大量基质将其包裹的生物膜，抵御体液冲刷等使其
从黏附表面脱落的力量。口腔环境中处于粘附状态的
细菌与处于游离状态的细菌有很大的不同，最主要的
区别在于对临床常规抗菌药物明显耐药，且对宿主防
御机制产生保护作用[5，7]，白色念珠菌亦是如此。
根据我们前期研究结果，选择具有抗白色念珠菌
潜力的白鲜皮的有效成分白鲜碱进行研究。白鲜碱能
抑制植物致病真菌孢子的萌发[8]。Zhao[9]报道白鲜皮多
种二甲氯提取物中，白鲜碱是最有效的抑制黄瓜黑星
病菌的化合物。Yang[10]证实白鲜碱对稻瘟病菌有抑制
作用。Guo[11]发现了白鲜碱对模式真菌啤酒酵母的抗菌
活性。Pfyffer等[12]报道了白鲜碱对真菌 DNA的作用，
在近紫外光下引起丝状真菌的致死性损伤，认为 DNA
是生物碱的体内光毒性的主要作用靶点。国内已有报
道白鲜碱对白色念珠菌有体外抑制作用[13]。但关于其
抑制白色念珠菌生物膜尚无报道。而对其抑制白色念
珠菌的机制亦需研究。
有关白鲜碱能抑制体外白色念珠菌生长的现象，
本研究结果与梁晓英[13]的结果一致。而本研究的进一
步发现是：白鲜碱能抑制白色念珠菌生物膜的活性。对
各种抗真菌药物的耐药性是白色念珠菌生物膜的重要
特征，生物膜对菌落而言是一层保护膜，常用抗生素和
杀菌剂很难穿透生物膜接触到念珠菌表面发挥作用。
白鲜碱对白色念珠菌生物膜的抑制潜力为日后的药物
临床应用带来了希望。
本实验还发现白鲜碱对白色念珠菌生物膜的抑制
作用与细胞周期有关。在所选观察时间点 6 h、12 h和
24 h均没有表现出用药后 PI ％明显减小，但观察白鲜
碱药物作用不同时间的直方图可以看到。在用药后 6 h
和 24 h，各浓度都有大量处于 DNA合成期－S期细胞。
由于 PI ％是由 S期和 G2期细胞共同决定，所以，当 G2
期没有明显改变时 PI ％也无明显差异。细胞周期的调
节与 DNA损伤修复是密切相关的，DNA损伤时会导致
细胞周期停滞于 G1期、S期或 G2期，从而防止受损伤
DNA复制，或阻止畸形有丝分裂发生。与细胞周期停滞
和损伤 DNA修复密切相关的 DNA损伤检查点是细胞
周期检查点的一种，是目前研究的热点。当受到内源性
或外源性致 DNA损伤药物作用时，细胞会调动自身检
查点机制来防止损伤 DNA的诱变错误复制。当整个基
因组妥协时，检查点机制在细胞周期进程中产生负调
控，导致生长停滞或凋亡。如抗肿瘤药物羟基脲能够抑
制 DNA合成，触发 S期检查点使细胞阻滞于 S期，抑
制复制起点，稳定复制叉[14]。所以，虽然白鲜碱在本实
验中并未体现出降低增殖指数的作用，但根据白鲜碱
对悬浮态及生物膜态的白色念珠菌均有明显抑制作用
的现象，很可能是因为在药物作用下其 DNA受到了不
同程度的损伤，启动了 S期检查点机制的结果。这与之
前有人研究提出白鲜碱直接或间接影响了真菌细胞遗
传物质的正常合成，以致不能完成正常细胞周期，从而
抑制真菌生长甚至导致死亡[9]的推测不谋而合。
总之，本研究表明白鲜碱对白色念珠菌生物膜具
有抑制作用。白鲜碱对白色念珠菌抑制的可能机制与
该药对白色念珠菌细胞周期的影响，从而使白色念珠
菌生长停滞。白鲜碱具有潜在的临床应用价值。
［参 考 文 献］
［1］
［2］
［3］
［4］
［5］
［6］
［7］
［8］
［9］
［10］
［11］
［12］
［13］
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656· ·
临床口腔医学杂志 2011年 11月第 27卷第 11期 J Clin Stomatol,Nov,2011,Vol.27.No.11
［14］
［J］． 中国农学通报，2009，25（16）：21－24．
Liu H，Wang Y． The Function and Regulation of Budding Yeast Swel
in Response to Interrupted DNA Synthesis［J］． Mol Biol Cel，2006，
17（6）：2746－2756．
收稿日期：2011－07－21
环孢素 A（Cyclosporin A，CsA）是一种强效免疫抑
制剂，在治疗自身免疫性疾病和抗排异反应的同时，引
起药物性牙龈增生[1]，发生率为 30 ％～50 ％[2]，其病理
机制尚不明确。病理特征有：牙龈上皮增厚，结缔组织
成分增加，血管化作用增强[3]。关于 CsA致血管化作用
增强机制的研究国内尚未见报道。
本实验建立 CsA性牙龈增生（CsA－induced gingi－
val overgrowth，CsA－GO）大鼠模型。定量分析 CsA对大
*基金项目：哈尔滨市科技局优秀学科带头人研究专项资金项目（2009RFXXS214）
黑龙江省卫生厅科研基金资助项目（2010－007）
哈尔滨医科大学附属第一医院科研基金资助项目（Q08－005）
**通讯作者：马 肃：Tel：0451－85553988
环孢素 A对大鼠牙龈结缔组织血
管基膜层粘连蛋白表达的影响 *
牛少非，马 肃 **，刘培红
（哈尔滨医科大学口腔医学院牙周病科 黑龙江 哈尔滨 150001）
［摘要］ 目的：观察环孢素 A（Cyclosporin A，CsA）对大鼠磨牙牙龈结缔组织面积，血管数量，血管面积以及层粘
连蛋白（laminin，LN）表达的影响。方法：建立 CsA大鼠牙龈增生模型。制备下颌第一磨牙石蜡切片，分别进行 HE染色，
LN免疫组织化学染色。定量分析牙龈结缔组织面积、血管面积、5个视野血管数量计数。观察牙龈结缔组织内血管基膜
LN的表达。结果：①组织测量结果：实验组颊侧牙龈结缔组织面积大于对照组，实验组颊舌侧牙龈结缔组织血管数量
总数和均数多于对照组，实验组颊舌侧牙龈结缔组织中的血管总面积占牙龈结缔组织总面积的百分比大于对照组（各
组数据 P﹤0．05）②免疫组化结果：LN阳性表达于血管基膜、上皮基膜等部位。对血管基膜上 LN阳性的血管进行分区
域计数，实验组的总数和均数均大于对照组（P﹤0．05），且实验组血管基膜上 LN表达强度上调。结论：①．CsA使大鼠牙
龈结缔组织内血管化作用增强。②CsA使大鼠牙龈结缔组织内血管基底膜上 LN表达增多。
［关键词］ 环孢素 A；大鼠牙龈；血管化；组织测量；层粘连蛋白
［中图分类号］ R781．4 Q786 ［文献标识码］ A doi：10．3969／j．issn．1003－1634．2011．11．006
The effect of cyclosporin A on the vascularization and expression of the laminin on the BM of blood vessels in
rats gingival connective tissue． NIU Shao－fei，MA Su，LIU Pei－hong． Department of Periodontics，School of Stomatology，
Harbin Medical University，Heilongjiang Harbin 150001，China．
［Abstract］ Objective：1 the aim of this experimental study was to examine the vascularization of CsA－induced gingi－
val overgrowth．2 to observe the expression of the laminin on the BM of blood vessels in the CsA－GO model． Method：13
male Wistar rats were randomly divided into two groups ．the experimental objects（8 rats）were given intragastric administra－
tion of fresh milk with CsA and the control group（5 rats）were given fresh milk－equal－volume． the duration of this treatment
last 20 days． At the end of the experimental period，rats were sacrificed． the first molar of mandibles with surrounding gin－
giva were prepared for making paraffin sections． the paraffin sections were used for HE and immunohistochemisty respective－
ly． in the HE sections，histomorphometric analysis included the measurement of the number of blood vessel profiles in five
individual fields of 120×120 um2，the total area of blood vessels and the GCT area． the positive expression of laminin were
observed and analyzed under a microscope． Result：the histomorphometric findings showed that：1 the number of blood vessel
profiles increased in the CsA group compared to control group（P ＜0．05）．2 the area of GCT and the total area of blood vessel
profiles increased（P ＜0．05）．the positive expression of laminin on the BM of blood vessels increased in the CsA group com－
pared to control group． Conclusion：1 the results of the study suggest that increased positive expression of laminin may be
associated with the pathogenesis of the CsA－GO．2 the increased number and total area of blood vessel profiles showed that
angiogenesis may occur in the pathogenesis of the CsA－GO．
［Key words］ gingival overgrowth；cyclosporin A；laminin；histomorphometric analysis vascularization
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
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