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食品及化妆品中香豆素和黄樟素类化合物分析方法研究进展



全 文 :香料香精化妆品 2013年2月第1期
FLAVOUR FRAGRANCE COSMETICS February,2013,NO.1
综述与专论
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食品及化妆品中香豆素和黄樟素类化合物分析方法研究进展
作 者
1.云南烟草科学研究院,云南昆明 650106;
2.昆明理工大学化学工程学院,云南昆明650093;
3.中国科学院西双版纳热带植物园,云南昆明 650223
韩 熠1 张承明1 喻 坤2…………………………………
孟 霞3 陈永宽1 缪明明1…………………………………
作 者 简 介
韩熠(1976—),男,博士,助理研究员,
主要从事烟用材料有害成分分析方法
研究。
E-mail:hanyi762002@yahoo.com.cn
摘 要
  对近年来国内外食品及化妆品中香豆素和黄樟素类化合物分析方法的研究现状进行了综述,主要分析了各种样品处理
及分析方法的特点,指出目前分析方法的主要问题和今后的研究重点。
关键词
香豆素 黄樟素 气相色谱 液相色谱
Recent Advances in Analytical Methods for Coumarins and Safroles in Food and Cosmetics
HAN Yi1 ZHANG Chengming1 YU Kun2 MENG Xia3 CHEN Yongkuan1 MIAO Mingming1
(1.Yunnan Academy of Tobacco Science,Kunming 650106,Yunnan,China;2.Colege of Chemical Engineering,
Kunming University of Science and Technology,Kunming 650093,Yunnan,China;3.Xishuangbanna Tropical Bo-
tanical Garden,Chinese Academy of Sciences,Kunming 650223,Yunnan,China)
Abstract: Recent advances in analytical methods for coumarins and safroles in food and cosmetics are reviewed.Different
sample preparation and analytical methods are described.In addition,the main problems and key points of future development
with personal perspectives are discussed.
Key words: coumarin safrole gas chromatography liquid chromatography
收稿日期:2012-08-19
  香豆素是一类有芳香气味的化学物质,广泛存
在于许多植物中,如熏草豆、香草、车轴草、毛蕊花、
桂皮、熏草、草木犀等都含有高浓度的香豆素。香
豆素作为一种重要的香料,常用作定香剂、脱臭剂,
配制香水和香料,也用作饮料、食品、香烟、塑料制
品、橡胶制品等的增香剂。医药上将其加入药剂中
作为矫味剂。目前经动物实验,香豆素已被证实对
肝肾具有中等毒性。
美国食品药品管理局(Food and Drug Admin-
istration,FDA)早在1954年就禁止将香豆素用作
食品添加剂。目前,FDA已将香豆素列为“禁止在
人类食品中直接添加或使用的物质”,但一些含香
豆素的天然物质如茜草科的车轴草因其香豆素香
味,仍然允许“只用于酒精饮料”[1],而澳大利亚对
酒精饮料中香豆素的使用限量则为10mg/kg[2]。
欧洲食品安全局(EFSA)规定香豆素的每日耐受摄
入量(TDI)为0.1mg/kg体重[3],同时还规定香豆
素在甜点、早餐麦片和面包中的最大用量从5mg/
kg到50mg/kg[4],印度则禁止在各类食品中使用
香豆素和二氢香豆素[5]。欧盟的化妆品和非食品
产品委员会(SCCNFP)早在2000年就提议在化妆
品中禁用二氢香豆素、7-甲氧基香豆素、6-甲基香豆
素和7-甲基香豆素[6],而最新的欧盟化妆品法规
Regulation(EC)No 1223/2009中已将双香豆素、环
香豆素、醋硝香豆素、二氢香豆素、7-甲氧基香豆素、
7-甲基香豆素、4-甲基-7-乙氧基香豆素、非天然的呋
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喃类香豆素纳入禁用物质列表[7]。
我国对食品和化妆品中香豆素的使用也做出了
明确的规定。GB 2760-2011中允许使用的食品用合
成香料名单包括二氢香豆素、6-甲基香豆素、八氢香
豆素,但未规定添加限量[8]。2010年7月,台湾地区
食品管理机构发布通知禁止在食品中添加香豆素,
同时规定“惟饮料中因使用天然香料,导致天然香料
本身所含之香豆素残留时,其含量仍应在2.0mg/kg
以下”[9]。我国的GB7916-1987《化妆品卫生标准》中
规定6-甲基香豆素的最大允许浓度为0.003%[10],而
《化妆品卫生规范》(2007版)中明确规定二氢香豆
素、双香豆素、7-甲基香豆素、7-甲氧基香豆素、醋硝
香豆素和7-乙氧基-4-甲基香豆素为禁用物质。
黄樟素天然存在于肉桂、肉豆蔻、黑胡椒和紫
苏等植物中。黄樟素是许多食用天然精油如黄樟
精油、八角精油和樟脑油的主要成分。FDA的研究
显示,黄樟素是白鼠和老鼠的致肝癌物,在小鼠饲
料中添加0.04%~1%的黄樟素,150d到2a可诱
导小鼠产生肝癌。鉴于上述结果,在美国不再允许
黄樟素作为食品添加剂[1]。目前,国际日用香精香
料协会(International Fragrance Association)规定
黄樟素在化妆品中的最大允许浓度为0.01%,并禁
用六氢香豆素、6-甲基香豆素和7-乙氧基-4-甲基香
豆素[11]。欧盟的88/388/EEC指令规定在食品和
饮料中黄樟素的最大用量为1mg/kg,而酒精体积
含量超过25%的酒精饮料中最大用量为5mg/kg,
含肉豆蔻的食品为15mg/kg[12]。我国于2005年
实施的《易制毒化学品管理条例》将黄樟素列为第
一类易制毒化学品[13]。
由于香豆素类化合物和黄樟素的毒副作用,建
立准确、快速、简便的香豆素和黄樟素分析检测方
法,对于评估食品、化妆品及香精香料的安全性有
着重要作用。高效液相色谱法(HPLC)、液相色谱-
串联质谱法(LC-MS/MS)、气相色谱法(GC)和气
相色谱-质谱联用法(GC-MS)是测定香豆素和黄樟
素类化合物的常用分析方法,本文对近年来国内外
文献报道的香豆素和黄樟素分析检测方法及我国
的相关标准进行了简要的总结。
1 食品中香豆素和黄樟素的分析方法
1.1 高效液相色谱法(HPLC)和液相色谱-串联质
谱法(LC-MS/MS)
1999年,陈捷和胡国昌[14]用 HPLC分离食品
中的香豆素并用紫外检测器在275nm波长处测
定。文章分析了含油脂的固体样品、不含油脂的固
体样品和饮料、酒类等液体样品,样品均用无水乙
醚萃取,萃取液在40℃水浴上用氮气吹干,残留物
再用甲醇与水的混合溶剂反萃。方法最低检出限
为0.015mg/L,在2~10mg/L浓度范围内有良好
的线性关系。此方法准确、重现性好,但乙醚萃取
体积大,样品处理稍显繁琐。
近年来,由于LC-MS/MS比普通的液相色谱
仪有更高的分析选择性和灵敏度,越来越多的研究
均采用LC-MS/MS来分析复杂食品基体中的香豆
素和黄樟素。
王辉等[15]在用LC-MS/MS测定沙田柚果肉汁
中的呋喃香豆素类化合物时采用梯度洗脱法分离
了沙田柚果肉汁的正己烷和乙酸乙酯提取物,电喷
雾(ESI)质谱确证了沙田柚果肉汁中6种结构相近
的呋喃香豆素类化合物的结构。随后,相同的研究
小组[16]改变了之前依次用正己烷和乙酸乙酯分别
萃取的方法,用正己烷和乙酸乙酯的混合溶液多次
萃取,萃取浓缩液通过硅胶层析柱洗脱。两篇报道
均在最佳色谱条件下,通过与文献对照,先用一级
质谱对样品进行定性分析,再对照二级质谱碎片离
子以确证化合物。
Raters等[17]用LC-MS/MS分析包括混合调味
香料、肉桂饼干、姜饼和糖果在内的500种食品中
的香豆素时采用内标法(d4-香豆素)定量并与高效
液相色谱-紫外检测器法(HPLC-UV)进行比较,结
果表明采用 LC-MS/MS的选择性和灵敏度均比
HPLC-UV高100倍。LC-MS/MS的检出限和定
量限分别为0.03mg/kg和0.05mg/kg。
Rychlik[18]分析香豆素时采用了稳定同位素稀
释LC-MS/MS方法。研究者用[13 C2]-醋酸酐与水
杨醛反应制备内标物[13 C2]-香豆素,并用质谱和核
磁共振(NMR)表征。内标法定量的方法检出限和
定量限分别为2.9μg/kg和8.6μg/kg。实验发现
胡萝卜中能检出痕量香豆素,而以肉桂为配方的食
品中则含有高含量的香豆素。
Vierikova等[19]采用超高效液相色谱-电喷雾
串联质谱(UPLC-ESI-MS/MS)测定了各种食品中
的香豆素残留。样品用二氯甲烷为萃取剂进行加
速溶剂萃取(ASE),萃取液用凝胶渗透色谱(GPC)
净化。采用ASE和UPLC缩短了样品处理和分离
时间。方法的检出限和定量限分别为20μg/kg
和50μg/kg。
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1.2 气相色谱法(GC)
从近年来的报道发现,气相色谱-氢火焰离子化
检测器法(GC-FID)是分析食品中香豆素和黄樟素
最常用的方法。
2001年,Choong等[20]采用 GC-FID分析了软
饮料中的黄樟素和异黄樟素。样品未经处理直接
进样,以1,4-二羟基苯(DHB)为内标定量。检出限
为0.25μg/mL。分析的25种软饮料中有20种检
出目标物。
吴婷等[21]为了同时分析吐司面包、番茄酱、广
式香肠、可乐、葡萄酒中的黄樟素、侧柏酮、龙蒿脑
和甲基丁香酚,采用同时蒸馏萃取方法以二氯甲烷
为提取剂将待测物从食品基质中分离出来,用1,4-
二溴苯和乙酸苯乙酯为内标定量。GC-FID测定黄
樟素的方法检出限为0.2μg/mL。结果表明除肉
制品基质中的提取不理想外,对于大多数食品,同
时蒸馏萃取的前处理方法能很好地解决待测物与
干扰组分的分离问题。
有人还报道了采用甲醇萃取、超声和过滤食品
样品并用GC-FID同时测定其中咖啡因和禁用香料
(二甘醇、二甘醇乙醚、香豆素)的方法[22]。
2 化妆品中香豆素和黄樟素的分析方法
2.1 高效液相色谱法(HPLC)和液相色谱-串联质
谱法(LC-MS/MS)
采用带二极管阵列检测器(DAD)的液相色谱
检测化妆品中的香豆素和黄樟素是报道最多的方
法,分析物从一种到十几种。有的文献还用 LC-
MS/MS对目标物进行确证。
2005年,黄薇等[23]采用 HPLC-DAD(二极管阵
列检测器)测定了化妆品中的6-甲基香豆素,检测波
长275nm。最低检出限为1μg/g。样品用无水乙醇
萃取,分析15种不同类型化妆品,均未检出目标物。
田富饶等[24]则建立了HPLC-UV法测定化妆品中6-
甲基香豆素含量的方法。样品经甲醇超声提取
20min,离心,过滤,检测波长275nm。方法检出限
和定量限分别为0.05mg/kg和0.10mg/kg。
李洁等[25]报道了用 HPLC-DAD测定化妆品中
的3种香豆素类物质(香豆素、7-甲氧基香豆素和6-
甲基香豆素)的方法。样品采用甲醇超声提取。3种
物质的最低检出限分别为0.03μg/mL、0.01μg/mL
和0.03μg/mL。对14种香水样品和16种其他类
型化妆品的检测结果发现,只有小部分香水中含有
一种或两种香豆素类化合物。
赵晓亚等[26]采用 HPLC-DAD测定了化妆品
中6种香豆素类化合物(7-甲氧基香豆素、二氢香豆
素、双香豆素、7-甲基香豆素、醋硝香豆素和7-乙氧
基-4-甲基香豆素)。样品用无水乙醇超声提取,检
测波长分别为278nm和308nm,外标法定量。检
出限为0.2~0.5mg/kg。对50个进出口化妆品进
行抽检,均未检出目标物。
席海为等[27]报道了 HPLC-DAD同时测定化
妆品中17种香豆素类化学成分的方法。样品采用
甲醇超声提取。检测波长分别为210nm、220nm
和250nm。17种香豆素类化合物的定量下限为
1mg/kg。应用本方法对15个进出口化妆品进行检
测,均未检出含有香豆素类化学成分。
程艳等[28]在用 HPLC-DAD测定化妆品中的
双香豆素和环香豆素时,采用乙腈-氢氧化钠溶液超
声提取,提取液用乙酸调节pH 至中性,选择306
nm为两种香豆素物质的检测波长,外标法定量,并
采用LC-MS/MS确证。LC-MS/MS方法对双香豆
素和环香豆素的定量下限均能达到1ng。
2.2 气相色谱法(GC)和气相色谱-质谱联用法
(GC/MS)
除了 Wisneski[29]采用GC-ECD(电子捕获检测
器)分析香水中的香豆素并用GC/MS确证以外,直
接用GC-FID定量或用GC/MS定性定量已发展为
目前测定化妆品中的香豆素和黄樟素的主要方法。
肖上甲和王世平[30]用GC-FID测定了13种不
同类型化妆品中的6-甲基香豆素。选择给电子能
力较强的偶极溶剂丙酮溶解样品,超声波均质离心
后经 HP-1色谱柱分离,氢火焰离子化检测器检测。
样品中均未检出6-甲基香豆素。
李洁等[31]采用 GC/MS测定了化妆品中的香
豆素、7-甲氧基香豆素和6-甲基香豆素。样品采用
甲醇超声提取。3种物质的最低检出限分别为:
0.3、0.5和0.3μg/mL。对15种香水样品的测定
发现只有两种香水中含有香豆素。样品采用甲醇
超声提取。分析灵敏度比相同研究小组采用液相
色谱法[25]的分析结果约低10倍。
赵晓亚等[32]报道了 GC/MS同时测定化妆品
中5种香豆素类化合物(7-甲氧基香豆素、二氢香豆
素、7-甲基香豆素、醋硝香豆素和7-乙氧基-4-甲基
香豆素)的方法。样品用无水乙醇超声提取,外标
法定量。方法采用DB-1701低/中等极性色谱柱,
比DB-5MS非极性柱的分离效果好,色谱峰型尖
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锐,对称性好。醋硝香豆素的检出限为5.0mg/kg,
二 氢 香 豆 素 和 7-甲 基 香 豆 素 的 检 出 限 为
0.5mg/kg,7-甲氧基香豆素和7-乙氧基-4-甲基香豆
素的检出限为0.1mg/kg。对45个进出口化妆品进
行抽检,均未检出目标物。有研究者[33]还用甲醇作
萃取剂,GC/MS测定了化妆品中的黄樟素和6-甲基
香豆素。方法定量限分别为5μg/g和10μg/g。
3 国内相关分析标准及法规
近年来,我国陆续制定了一系列测定香豆素及
黄樟素的国家标准、行业标准或法规。从目前制定
的标准法规来看,GC-FID和 HPLC是主要的检测
手段,而萃取溶剂多选择甲醇或乙醇。值得注意的
是,这些标准或法规中多数只规定了一至两种物质
的分析方法,而随着其他成分的毒理学信息及添加
用量的披露,同时检测更多的香豆素和黄樟素类化
合物的分析标准可能将是今后制定标准的方向。
GB 28363-2012《食品安全国家标准 食品添加
剂 二氢香豆素》[33]采用GB/T 14454.1-2008《香料
试样制备》[34]中的样品处理(脱水过滤)和 GB/T
11538-2006《精油 毛细管柱气相色谱分析 通用
法》[35]中的分析方法(GC-FID法)测定食品添加剂
中的二氢香豆素。GB/T 14454.15-2008[36]规定了
以癸酸乙酯为内标,GC-FID分析黄樟油中黄樟素
和异黄樟素的方法。GB/T 24800.9-2009[37]中采
用无水乙醇超声提取化妆品中的香豆素,高速离心
过滤后,用GC-FID测定。
出入境检验检疫行业标准[38]中采用甲醇超声
提取化妆品中的黄樟素和6-甲基香豆素,GC-FID
测定和GC/MS确证;另一标准[39]则用乙腈和氢氧
化钠混合溶液超声提取化妆品中的双香豆素和环
香豆素,HPLC-DAD检测。
在国家食品药品监督管理局制定的《化妆品中
6-甲基香豆素的检测方法》[40]中,分别规定了用
HPLC-UV和GC-FID的检测方法。其中的高效液
相色谱法中,样品经振荡、超声、离心、过滤等步骤
后用 HPLC-UV检测;而气相色谱法中,除以上的
处理过程外,还需用无水硫酸钠脱水。
4 结语
目前,分析食品及化妆品中香豆素和黄樟素多
采用液相萃取与色谱分离结合的方法,HPLC、LC-
MS/MS、GC-FID和 GC/MS是常用的分析方法。
已有研究采用内标法定量以提高分析的灵敏度和
选择性,但有的报道中采用传统的液液萃取时萃取
溶剂用量较大或毒性较大,而研究除液相萃取外的
其他萃取手段、微萃取技术和绿色萃取技术除了可
提高分析选择性和灵敏度外,还可减少对环境和人
体健康的危害。快速色谱分离(如 UPLC)可大大
缩短分析时间,提高分析通量。另外,研究同时检
测多种香豆素和黄樟素类物质的分析方法对产品
质量控制及应对国内外不断变化的产品质量法规
要求有重要意义。
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殽殽

.2011-03-29.
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