全 文 ：多指标综合评分法优选山橿中总黄酮提取工艺
陈随清，张婉晴，陈磊磊
（河南中医学院 药学院，河南 郑州４５０００８）
摘 要：目的：优选山橿中总黄酮的提取工艺。方法：采用紫外分光光度法测定山橿中总黄酮含量，高效
液相色谱法测定球松素的含量。采用正交设计方法，综合评价总黄酮提取率、球松素提取率和收膏率三
项指标，优选出最佳提取工艺。结果：最佳提取工艺参数为Ａ３Ｂ３Ｃ３Ｄ２，即药材加１２倍量７０％乙醇，超声波
提取３次，每次１．５ｈ。结论：正交试验结合多指标综合分法优选出山橿总黄酮的提取工艺合理、可行。
关键词：山橿；总黄酮；多指标综合评分法；正交设计
中图分类号：Ｒ９２７ 文献标识码：Ａ 文章编号：１６７３－２１９７（２０１２）０９－００３３－０４
收稿日期：２０１２－０６－１５
基金项目：河南省科技创新人才计划项目（１１４２００５１００１４）；国家科技重大专项课题（２０１２ＺＸ０９１０３２０１－０２４）
作者简介：陈随清（１９６５－），男，博士，河南中医学院教授，研究方向为中药品种整理及质量标准。
中药山橿系樟科Ｌａｕａｃｅａｅ山胡椒属植物山橿Ｌｉｎｄｅｒａ
ｒｅｆｌｅｘａ Ｈｅｍｓｌ．的干燥根，其性温、味辛，具有行气止痛、健
脾消积、活血消肿等作用［１－２］。现已知山橿中含有球松素、乔
松素、樱花素等多种二氢黄酮类化合物，其中球松素的含量
常作为中药山橿质量控制的指标［３］。前期研究证明山橿中
总黄酮成分为其主要有效部位之一［４－５］，为了得到山橿总黄
酮的最佳提取工艺参数，本实验采用Ｚ－ｓｃｏｒｅ法［５］对各项指
标归一化处理，以综合得分评价正交实验优化的提取条件，
结果得到的工艺稳定可行，可为山橿的进一步研究开发提
供科学依据。
１ 仪器与材料
Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＬＣ－２０ＡＴ高效液相色谱仪；Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＵＶ－
２２０１紫外分光光度计；ＡＢ２０４－Ｎ万分之一电子天平；ＡＥ２４０
十万分之一电子天平；ＣＱ－２５Ｄ超声波提取仪（上海超声波
仪器厂）；ＳＢ－１０００旋转蒸发器 （上海爱朗仪器有限公司）。
山橿药材于２０１０年采自河南省新县，经笔者鉴定为樟
科山胡椒属植物山橿Ｌｉｎｄｅｒａ ｒｅｆｌｅｘａ Ｈｅｍｓｌ．的根；球松素
是本实验室自制，ＨＰＬＣ测定其质量分数为９９．０４％。
ＨＰＬＣ用甲醇为色谱纯；乙醇等试剂均为分析纯；水为
超纯水。
２ 方法与结果
２．１ 山橿提取物中总黄酮的测定
２．１．１ 对照品溶液制备
精密称取干燥恒重的球松素标准品２．２２ｍｇ，置１０ｍＬ
容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，得０．２２２ｍｇ／ｍＬ的对照品
溶液
。
具有较好抑制作用［５］，但对肺癌作用报道较少，其作用机制
有待进一步深入研究。
本试验采用盐酸乙醇的混合溶剂以加热回流的方法提
取龙葵药材，提取液浓缩后通过碱沉、萃取的方法得到龙葵
生物碱。本方法提取纯化操作简单易行，获得样品纯度较
高，适于工业化生产。ＭＴＴ实验结果显示龙葵生物碱提取
物在一定浓度范围内均能抑制人肺癌 Ａ５４９细胞的增殖作
用，且具有剂量依赖关系，显示了龙葵生物碱体外抗肿瘤作
用。细胞形态学实验结果证实了龙葵生物碱可改变细胞形
态引起细胞的凋亡或坏死。本实验为今后龙葵生物碱抗肿
瘤有效成分的筛选及抗肿瘤作用机理的研究提供了一定的
理论依据。
参考文献：
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［Ｊ］．山西中医，２０１１，２７（１）：４７－４９．
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究进展［Ｊ］．时珍国医国药，２０１０，２１（４）：９７７－９７８．
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ｉｎｈｉｂｉｔ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ（Ｕ１４）ｖｉａ ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ
ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｂｅａｒｉｎｇ ｍｉｃｅ ａｎｄ ｉｎｄｕｃｉｎｇ ａｐｏｐｔｏ－
ｓｉｓ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｓ［Ｊ］．Ｆｉｔｏｔｅｒａｐｉａ，２００８，２（７）：５４８．
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瘤作用的研究［Ｊ］．中国中药杂志，２０１１，３６（１６）：２１９２－２１９５．
（责任编辑：姜付平）
—３３—
２．１．２ 供试品溶液的制备
精密称取干燥至恒重的提取物０．２ｇ，甲醇溶解，过滤，
置５０ｍＬ容量瓶中定容，摇匀。精密移取０．１ｍＬ定容至
１０ｍＬ容量瓶，得样品溶液。
２．１．３ 总黄酮检测波长的确定
取上述对照品和样品溶液适量，以甲醇溶剂作为空白，
在２００～５００ｎｍ波长扫描，结果显示对照品和供试品溶液均
在（２８６±２）ｎｍ处有最大吸收，故确定２８６ｎｍ为检测波长，
对照品和供试品ＵＶ图见图１。
图１ 球松素对照品（Ａ）及山橿提取物（Ｂ）ＵＶ
２．１．４ 标准曲线的绘制
以对照品溶液为母液，分别精密移取０．１ｍＬ、０．２ｍＬ、
０．３ｍＬ、０．５ｍＬ、０．６ｍＬ、０．８ｍＬ，置于１０ｍＬ量瓶中，加甲醇
至刻度，摇匀；配制成２．２２μｇ／ｍＬ、４．４４μｇ／ｍＬ、８．８８μｇ／
ｍＬ、１１．１０μｇ／ｍＬ、１３．３２μｇ／ｍＬ、１７．８０μｇ／ｍＬ的溶液，在
２８６ｎｍ处测定吸光度。以吸光度对质量浓度进行线性回
归，得回归方程Ｙ＝０．０８１ｘ＋０．００８（ｒ＝０．９９９４），总黄酮以
球松素计在２．２２～１７．８０μｇ／ｍＬ范围内线性关系良好。
２．１．５ 精密度试验
精密吸取同一供试品溶液适量，在２８６ｎｍ波长处连续
测定６次，计算总黄酮的含量，结果总黄酮含量的ＲＳＤ为
１．７６％。
２．１．６ 稳定性试验
精密吸取同一供试品溶液适量，分别于０、１、２、４、８、１２ｈ
测定吸光度，计算总黄酮的含量，结果总黄酮含量的 ＲＳＤ
为２．７８％，说明供试品溶液在１２ｈ内稳定。
２．１．７ 重复性试验
按２．１．２项下平行制备６份样品溶液，分别测定吸光
度，结果总黄酮含量的ＲＳＤ为１．３５％，表明该方法重复性
良好。
２．１．８ 回收率试验
精密称取山橿提取物６份，分别精密加入球松素，按
“２．１．２”项下制备供试品溶液，分别测定吸光度并计算回收
率，结果见表１。
表１ 山橿提取物中总黄酮的加样回收率
提取物
量（ｇ）
样品黄酮
含量（ｍｇ）
加球松
素量（ｍｇ）
测总黄酮
含量（ｍｇ）
回收率
（％）
平均值
（％）
ＲＳＤ
（％）
０．０５０８ １１．６５ ２２．５３ ９７．５８
０．０５１１ １１．７２ ２３．０８ １０１．９
０．０５０２
０．０４８９
１１．５３
１１．６８
１１．１５
２２．９０
２３．０２
１０１．９
１０１．７
９９．７３ ２．６４
０．０５２２ １１．９８ ２２．６５４ ９５．７３
０．０５０７ １１．６３ ２２．７１６ ９９．４３
２．１．９ 样品测定
按“２．１．２”项下制备各山橿提取物正交试验的样品溶
液，在２８６ｎｍ处测定其吸光度，由回归方程计算提取物中
总黄酮质量分数，计算山橿中总黄酮提取率（总黄酮提取率
＝总黄酮的质量分数×提取物的质量／山橿粉末质量），结
果见正交表５。
２．２ 山橿提取物中球松素的测定
２．２．１ 供试品溶液的制备
精密称取干燥至恒重的提取物０．２ｇ，甲醇溶解，过滤，
置５０ｍＬ容量瓶中定容，０．４５μｍ微孔滤膜过滤，得供试品
溶液。
２．２．２ 色谱条件
色谱柱：ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ ｌｕｎａ Ｃ１８（２５０ｍｍ×４．６０ｍｍ，
５μｍ）；检测波长：２９７ｎｍ；柱温：３０℃；流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ；进
样体积：１０μＬ；流动相：甲醇－水，程序性梯度洗脱：０～
１５ｍｉｎ，甲醇 （２５％ ～７０％）；１５～５０ｍｉｎ，甲 醇 （７０％ ～
１００％）；５０～６５ｍｉｎ，甲醇（１００％）；６５～８５ｍｉｎ（平衡色谱
柱），甲醇（２５％～７０％）。球松素与相邻杂质峰的分离度大
于１．５，理论塔板数按球松素峰计算大于３ ０００，对照品和供
试品色谱见图２。
图２ 球松素对照品（Ａ）及山橿提取物（Ｂ）ＨＰＬＣ
１．球松素（ｐｉｎｏｓｔｒｏｂｉｎ）
２．２．３ 标准曲线的绘制
精密称取干燥至恒重的球松素标准品１０．０５ｍｇ，置
１０ｍＬ容量瓶中，甲醇溶解定容，摇匀，０．４５μｍ微孔滤膜过
—４３—
滤，得 １．００５ｍｇ／ｍＬ 的 对 照 品 溶 液。分 别 精 密 量 取
０．０１ｍＬ、０．１０ｍＬ、０．５０ｍＬ、１．００ｍＬ、２．００ｍＬ配成梯度溶
液，进样，测定峰面积。以峰面积对球松素的进样含量线性
回归，得回归方程Ｙ＝２８９６６００Ｘ＋５０４７９（ｒ＝０．９９９５）。表
明球松素在０．０１０～２．０１μｇ／ｍＬ范围内与峰面积线性关系
良好。
２．２．４ 精密度试验
精密吸取同一供试品溶液，注入高效液相色谱仪，重复
测定６次，测定峰面积值，计算其ＲＳＤ值为２．２２％。
２．２．５ 稳定性试验
精密吸取同一供试品溶液，分别于０、１、２、４、８、１２ｈ进
样，测定峰面积值，计算其ＲＳＤ为１．５６％。结果表明供试
品溶液在１２ｈ内较稳定。
２．２．６ 重复性试验
按“２．２．１”项平行制备６份样品溶液，测定峰面积，结
果ＲＳＤ为１．８４％，表明该方法重复性良好。
２．２．７ 回收率试验
精密称取山橿提取物６份，分别精密加入球松素，按
“２．２．１”项下制备供试品溶液，按“２．２．２”项下色谱条件测
定并计算回收率，结果见表２。
表２ 山橿提取物中球松素的加样回收率
提取物量
（ｇ）
样品中
球松素
含量（ｍｇ）
加球松
素量（ｍｇ）
测球松
素量（ｍｇ）
回收率
（％）
平均值
（％）
ＲＳＤ
（％）
０．１００４ ５．１９ １０．４３ １０１．３
０．１００１ ５．１８ １０．２８ ９８．７４
０．１００６
０．０９９８
５．２０
５．１６
５．１７
１０．３１
１０．３８
９８．８２
１００．９
１００．０ １．３５
０．１００５ ５．２０ １０．４５ １０１．６
０．１００１ ５．１８ １０．３０ ９９．１３
２．２．８ 含量测定
按“２．２．１”项下制备各山橿提取物正交试验的样品溶
液，记录峰面积，由回归方程计算提取物中球松素含量，计
算山橿球松素提取率（球松素提取率＝提取物中球松素含
量×提取物的质量／山橿粉末质量），结果见正交表５。
２．３ 提取溶剂的筛选
称取山橿粉末四份，每份５０ｇ，分别加入不同的溶剂
５００ｍＬ，超声提取３次，每次１．５ｈ。提取液滤过，合并，减压
浓缩成稠膏状，干燥至恒重，计算收膏率；按“２．１”项和“２．
２”项下建立的方法分别测定总黄酮含量和球松素含量，综
合评价得分表明选取７０％乙醇提取结果较好，结果见表３。
表３ 不同提取溶剂的结果比较
提取溶剂 提取条件
收膏率
Ｘ１
（％）
总黄酮
提取率
Ｘ２（％）
球松素
提取率
Ｘ３（％）
综合评价
得分（Ｙ）
水 料液比 ６．５４ ０．３７ ０．０１ －１３３．５０
５０％乙醇 １∶１０， １１．３７ ２．７８ ０．２１ －５．２７
７０％乙醇 超声１．５ｈ， １２．８０ ３．４０ ０．６２ ８１．２２
９５％乙醇 ３次 １０．９５ ３．２３ ０．６０ ５７．５６
２．４ 正交试验及其结果
通过查阅文献，确定提取时间（Ａ）、提取次数（Ｂ）、料液
比（Ｃ）和提取方法（Ｄ）为考察因素，每个因素各取３个水平，
因素水平见表４。称取山橿药材粉末１８份（分为９组，每组
２份），每份５０ｇ，按Ｌ９（３４）正交试验表中的条件制备样品，
分别测定及计算总黄酮、球松素提取率及收膏率，并对多指
标综合评分。本实验选择Ｚ－ｓｃｏｒｅ法先对每个实验数据归
一化，再赋予三项指标权系数。球松素提取率权重系数设
为０．４，总黄酮提取率和收膏率权重系数同设为０．３，指数系
数设为１００，以综合值进行统计分析，结果见表５和６。Ｚ分
值计算公式：Ｚｉ＝ （Ｘｉ－珡Ｘｉ）／Ｓｉ （１）；
综合评分公式：
Ｙ ＝ （０．３×Ｚａｉ＋０．３×Ｚｂｉ＋０．４×Ｚｃｉ）×１００ （２）
公式（１）中Ｚｉ为某指标值，Ｘｉ为该指标值的平均值，珡Ｘｉ
为该指标标准差，通过计算Ｓｉ值使指标无量纲化。公式（２）
中Ｚａｉ为表５中某组实验测得的收膏率标准化后的数据，
Ｚｂｉ为该组总黄酮提取率标准化后的数据，Ｚｃｉ为该组球松
素提取率标准化后的数据。
表４ 因素水平
水平
因素
Ａ提取时间／ｈ Ｂ提取次数 Ｃ料液比 Ｄ提取方法
１ ０．５ １ １：８ 浸渍
２ １．０ ２ １：１０ 超声
３ １．５ ３ １：１２ 回流
直观分析表明，以综合评分为标准，在所选因素水平范
围内，各因素的作用主次为Ｂ＞Ａ＞Ｃ＞Ｄ，即因素Ｂ（提取次
数）对山橿的提取效果影响最大。由方差分析表明，因素Ｂ
具有极显著性差异（Ｐ＜０．０１）为重要影响因素，因素 Ａ（提
取时间）具有显著性（Ｐ＜０．０５）为主要影响因素，因素Ｃ（料
液比）和 Ｄ 不显著。结合生产成本，优化的水平组合为
Ａ３Ｂ３Ｃ３Ｄ２，即７０％乙醇超声提取３次，每次提取１．５ｈ，料液
比为１∶１２。
２．５ 验证试验
按照优化工艺参数Ａ３Ｂ３Ｃ３Ｄ２提取三批样品，进行验证
试验，结果出膏率平均值为１３．９３％；总黄酮平均提取率为
４．２３％，球松素平均提取率为０．５９％，该结果稳定，表明优
选工艺参数适合山橿总黄酮部位的提取。
３ 讨论
根据本实验室前期研究结果，山橿总黄酮主要为二氢
黄酮类化合物，经典的 ＮａＮＯ２－Ａｌ（ＮＯ）３－ＮａＯＨ 显色比色
法测定总黄酮的结果不够理想，主要是显色不明显，背景干
扰大；由全波长扫描发现山橿中总黄酮与球松素的最大吸
收波长一致，故确定以球松素为对照品直接测定样品吸光
度的方法测定总黄酮的含量。方法学考察证明，该方法结果
稳定，重现性好。球松素的含量测定采用高效液相色谱法，
本实验采用甲醇－水梯度洗脱系统，在２９７ｎｍ条件下测定山
橿中球松素含量，该 ＨＰＬＣ条件准确可靠且能实现样品中
多数成分峰的基线分离，重现性较好。
—５３—
表５ Ｌ９（３４）正交实验结果
实验号 Ａ Ｂ Ｃ Ｄ 收膏率Ｘ１（％） 总黄酮提取率Ｘ２（％）球松素提取率Ｘ３（％） 综合评分／Ｙ
１ １ １ １ １ ４．５３ １．２５ ０．１９ －１８３．１
１ １ １ １ ５．８０ １．６９ ０．２６ －１３４．６
２ １ ２ ２ ２ １１．５７ ３．１０ ０．５１ ４５．２３
１ ２ ２ ２ ９．８０ ２．９８ ０．４７ １１．５１
３ １ ３ ３ ３ １３．５５ ３．５２ ０．５４ ８９．６３
１ ３ ３ ３ １１．８０ ３．６２ ０．６６ １０７．２
４ ２ １ ２ ３ ６．６２ １．７８ ０．２８ －１１７．３
２ １ ２ ３ ６．００ １．６２ ０．２８ －１２９．８
５ ２ ２ ３ １ １２．１９ ３．２３ ０．３７ １９．０３
２ ２ ３ １ １０．２０ ２．８８ ０．４４ ３．９４０
６ ２ ３ １ ２ １２．３８ ３．６０ ０．５５ ８３．０４
２ ３ １ ２ １１．２０ ３．４２ ０．５８ ７２．０２
７ ３ １ ３ ２ ８．５６ ２．７３ ０．１１ －１０７．３
３ １ ３ ２ ７．６０ ２．３２ ０．３７ －６２．８８
８ ３ ２ １ ３ １１．８８ ２．７７ ０．４５ ２０．１２
３ ２ １ ３ １０．４０ ３．５８ ０．５３ ５６．１９
９ ３ ３ ２ １ １４．９３ ３．８０ ０．５８ １２５．２
３ ３ ２ １ １２．６０ ３．９８ ０．５６ １０２．１
Ｋ１ －１０．６９ －１２２．１ －１４．３９ －１１．２３
Ｋ２ －１１．５２ ２６．０１ ６．１６ ６．９４２
Ｋ３ ２２．２６ ９６．５５ ８．２７ ４．３３３
Ｒ ３３．７７ ２１９．．１ ２２．６６ １８．１７
表６ 方差分析
差异来源 离差平方和 自由度 变异均方 Ｆ值 Ｐ
Ａ ４４５３．８１３７ ２ ２２２６．９０６９ ４．９４８７ ０．０３５５
Ｂ １５００３３．０５２２ ２ ７５０１６．５２６１ １６６．７０５１ ０．０００１
Ｃ １８８１．０４０７ ２ ９４０．５２０３ ２．０９０１ ０．１７９７
Ｄ １１５８．５４９７ ２ ５７９．２７４９ １．２８７３ ０．３２２３
ｅ ４０４９．９５８０ ９ ４４９．９９５３
参考文献：
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京：人民卫生出版社，１９７８．
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［５］ 张涛，陈随清，张峰，等．山橿治疗胃溃疡及镇痛抗炎有效部
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［６］ 邱东．多指标综合评价方法的系统分析［Ｍ］．北京：中国统计
出版社，１９９１．
（责任编辑：余 婷）
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ｔｅｎｔ ｏｆ ｔｏｔａｌ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ｂｙ ＵＶ ａｎｄ ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｉｎｄｅｘ ｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔ ｏｆ ｐｉｎｏｓｔｒｏｂｉｎ ｂｙ ＨＰＬＣ．Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ｗａｓ
ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ ｂｙ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ．Ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｑｕａｎｔｉｔｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｔｏｔａｌ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ，ｔｈｅ ｐｉｎｏｓｔｒｏｂｉｎ ａｎｄ ｄｒｙ ｅｘｔｒａｃｔ ｙｉｅｌｄ ｒａｔｅ ｗｅｒｅ
ｒｅｇａｒｄｅｄ ａｓ ｔｈｅ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｉｎｄｅｘｅｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ｗａｓ Ａ３Ｂ３Ｃ３Ｄ２．Ｔｈａｔ ｉｓ ａｄｄｉｎｇ ｔｗｅｌｖｅ ｔｉｍｅｓ ａｍｏｕｎｔ
ｏｆ ７０％ａｌｃｏｈｏｌ ａｎｄ ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｗｉｃｅ，１．５ｈｏｎｃｅ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ ｃｏｍｂｉｎｅ ｗｉｔｈ ｍｕｌｔｉ－ｉｎｄｅｘ ｔｅｓｔ ｐｒｏｖｉｄｅｄ ａ
ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｆｏｒ ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ ｔｏｔａｌ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ｆｒｏｍ Ｌｉｎｄｅｒａ ｒｅｆｌｅｘａ Ｈｅｍｓｌ．
Ｋｅｙ Ｗｏｒｄｓ：Ｌｉｎｄｅｒａ Ｒｅｆｌｅｘａ Ｈｅｍｓｌ；Ｔｏｔａｌ Ｆｌａｖｏｎｏｉｄ；Ｍｕｌｔｉ－ｉｎｄｅｘｅｓ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ；Ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ
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