全 文 ：基金项目:云南省卫生科技计划项目(2011WS0096)
通讯作者:琚坚，教授，主任医师，研究方向:中西医结合方法治疗消化
系统疾病。E-mail:jujianyn@ 163． com
doi:10． 3969 / j． issn． 1006-5709． 2015． 03． 020
DNAM-1 在肝纤维化大鼠肝组织中的表达及阴行草水煎
液的干预作用
毕洪钟，潘 金，王 伟，段才华，周湘明，琚 坚
昆明医科大学第二附属医院特需病房，云南 昆明 650101
【摘要】 目的 研究 DNAM-1 在 CCL4 诱导肝纤维化大鼠肝组织中的表达情况，以及阴行草水煎液对其干预作用。方法 120 只
健康 SD大鼠随机分为 6 组:空白对照组、模型组、阴行草组、丹参组、虎杖组及易善复组，每组 20 只。CCL4 皮下注射诱导大鼠肝纤
维化模型。同时，空白对照组、模型组予生理盐水灌胃，其余 4 组大鼠分别予阴行草、丹参、虎杖水煎液及易善复灌胃干预。10 周后
处死大鼠，光镜下观察其肝脏病理组织学改变，进行肝纤维化分期。利用免疫组化 SP 法检测各组大鼠肝组织中 DNAM-1 表达水
平，应用计算机图像分析技术对免疫组化结果进行定量分析。结果 与模型组相比，阴行草组可明显降低 CCL4 诱导的肝纤维化程
度(P ＜ 0． 05);阴行草组大鼠肝组织中 DNAM-1 高于空白对照组，低于模型组(P ＜ 0． 01)。结论 DNAM-1 在肝纤维化大鼠肝脏组
织中过表达;阴行草水煎液对 CCL4 诱导肝纤维化大鼠肝纤维化有明显的防治作用，其主要机制可能是抑制了 DNAM-1 的表达。
【关键词】 肝纤维化;DNAM-1;阴行草
中图分类号:Ｒ575 文献标识码:A 文章编号:1006 － 5709(2015)03 － 0305 － 04 收稿日期:2014-01-19
Siphonostegia chinensis decoction intervention in expression of DNAM-1 in rats with
liver fibrosis
BI Hongzhong，PAN Jin，WANG Wei，DUAN Caihua，ZHOU Xiangming，JU Jian
Department of Special Wards Branch，the Second Affiliated Hospital of Kunming Medical University，Kunming 650101，
China
【Abstract】 Objective To investigate the expression of DNAM-1 in rats with liver fibrosis by carbon tetrachloride
(CCL4)，meanwhile research the Siphonostegia chinensis decoction intervention． Methods One hundred and twenty
healthy SD rats were randomly divided into six groups:blank control group，model group，Siphonostegia chinensis
group，Salvia miltiorrhiza group，Polygonum cuspidatum group and Phosphatidylcholine Capsules group． The model of
liver fibrosis was induced by subcutaneous injection with CCL4． At the same time，the rats in the blank control group
and model group were gavaged with physiological water;rats in Siphonostegia chinensis group，Salvia miltiorrhiza group，
Polyonum cuspidatum group and phosphatidylch oline capsules group were given by Siphonostegia chinensis decoction，
Salvia miltiorrhiza decoction and Polyene Phosphatidylcholine Capsules respectively． After 10 weeks，all rats were exe-
cuted． DNAM-1 in the liver was examined by SP，the results were analyzed by computer image analysis technique． Ｒe-
sults Compared with model group，the degree of liver fibrosis was reduced in Siphonostegia chinensis grup (P ＜
0． 05)． The expression of DNAM-1 in Siphonostegia chinensis group was higher than that in the blank control group，
lower than that in the model group (P ＜ 0． 01)． Conclusion DNAM-1 can express in rats with liver fibrosis． The pro-
tective effect of Siphonostegia chinensis decoction has been confirmed in liver fibrosis rats induced by CCL4． The main
mechanism may inhibit the expression of DNAM-1．
【Key words】 Liver fibrosis;DNAM-1;Siphonostegia chinensis
临床上主要导致肝纤维化(hepatic fibrosis，HF)的
病因有病毒性肝炎、酒精肝、脂肪肝、自身免疫性疾病
等。DNAM-1 是一种主要表达于 NK 细胞、T 细胞等
多种细胞表面的活化性受体［1］，已被确定为自身免疫
性疾病的遗传危险因素［2］。
虽然目前的研究认为 HF在未进展到肝硬化阶段
前的病理改变是可逆［2］，但临床上缺乏治疗肝纤维化
高效安全的药物。中医辨证地认为肝纤维发病机制为
肝肾功能失调，气滞血瘀，肝部筋络受阻，肝纤维化类
似于受过创伤的皮肤形成的疤痕［3］。但单纯的中药
制剂治疗肝纤维化效果并不明显，多种中药组成的复
方制剂依然是首选。阴行草主要具有抗菌抗炎、活血
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化瘀、保肝利胆、降低血清胆固醇等作用［4］，本研究旨
在探讨 DNAM-1 在 CCL4 诱导肝纤维化大鼠肝脏中的
表达情况及阴行草水煎液对其干预作用。
1 材料与方法
1． 1 材料 健康 SD 大鼠 120 只，平均体质量(200 ±
20)g，购自昆明医科大学动物实验中心;阴行草、虎
杖、丹参购自昆明医科大学第二附属医院中药房;
CCL4 购自天津市辗添化工有限公司;橄榄油购自重
庆市野蜂橄榄油有限责任公司;易善复(多烯磷脂酰
胆碱)购自赛诺菲安万特(北京)制药有限公司。
1． 2 试剂 兔抗鼠 DNAM-1 多克隆抗体购自美国 bi-
orbyt公司;链霉素抗生物素蛋白 －过氧化物酶(SP)
试剂盒及 3，3-二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒均购
自北京中杉金桥生物技术有限公司。
1． 3 方法
1． 3． 1 实验动物分组:将 120 只健康 SD大鼠随机分
为 6 组，每组 20 只，分别为:模型组、阴行草组、丹参
组、虎杖组、易善复组、空白对照组。
1． 3． 2 大鼠肝纤维化模型的建立:给予除空白对照组
外的各组大鼠 CCL4 橄榄油混悬液背部皮下注射(3
ml·kg －1·d －1，CCL4:橄榄油的比例为 1∶ 3)造模，空
白对照组背部皮下注射橄榄油溶液，2次 /周，持续 10周。
1． 3． 3 药物干预:药物干预组在造模的同时，分别给
予相应药物 1 ml /100 g每天灌胃，持续 10 周;模型组
和空白对照组均给予蒸馏水 1 ml /100 g 每天灌胃，持
续 10 周。
1． 3． 4 肝脏组织采集及病理学检测:剖杀大鼠前予禁
食 24 h，无菌条件下全麻取大鼠肝脏右叶中部约 1． 0
cm ×1． 0 cm 大小组织，处死大鼠。肝组织经 0． 9%的
生理盐水漂洗后，以 10%甲醛固定，石蜡包埋，连续冠
状切片，厚 4 μm，行 HE及 VG染色观察肝脏病理。
1． 3． 5 免疫组化染色:采用免疫组化 SP 法。DNAM-
1 一抗的工作浓度为 1∶ 100，免疫组化 SP 法染色步骤
严格按 S-P 试剂盒说明书进行操作。
1． 3． 6 肝脏病理结果判定:根据肝纤维化分期标准进
行组织学分期，分为 S0 ～ S4 期:S0 期无成纤维细胞增
生，胶原纤维含量正常，无纤维化;S1 期汇管区纤维化
扩大，局限窦周及小叶内纤维化;S2 期汇管区周围纤
维化，纤维间隔形成，小叶结构保留;S3 期纤维间隔伴
小叶结构紊乱，无肝硬化;S4 期早期肝硬化。
1． 3． 7 免疫组化结果判定:DNAM-1 蛋白的阳性着色
主要定位于细胞浆和细胞核，呈淡黄色 －棕黄色细颗
粒。选择组织切片中代表性区域，由两名病理教研室
专家以盲法行免疫组化染色观察计算积分(immuno-
histochemistry reaction score，IＲS)，具体操作如下:(1)
阳性细胞数≤5%为 0 分，6% ～ 25%为 1 分，26% ～
50%为 2 分，51% ～75%为 3 分，＞ 75%为 4 分;(2)阳
性强度无色为 0 分，淡黄色为 1 分，黄色为 2 分，棕黄
色为 3 分。将(1)(2)两者积分相乘，0 分为阴性
(－)，1 ～ 4 分为弱阳性(+)，5 ～ 8 分为阳性(+ +)，
9 ～ 12 分为强阳性(+ + +)，若两位专家结果相差 3
分则重新判定。
1． 3． 8 免疫组化结果定量分析:应用 HPIAS-1000 型
高清晰度病理图文分析系统对免疫组化结果进行定量
分析。根据阳性单位(positive unit，PU)结果来判断免
疫组化染色强度的差异。操作步骤按照 HPIAS-1000
型高清晰度病理图文分析仪使用手册进行。
1． 4 统计学处理 采用 SPSS 17． 0 统计学软件包进
行统计学处理，等级资料及多样本间总体比较采用秩
和检验，各组之间进行独立样本的非参数检验两两比
较;PU值计量资料用均值比较中的单因素方差分析。
P ＜ 0． 05 为差异有统计学意义，P ＜ 0． 01 为差异有显
著统计学意义。
2 结果
2． 1 大鼠生存状态观察 造模过程中，模型组大鼠饮
食饮水量逐渐减少，体质量下降，大便干燥，小便黄，皮
毛疏松脱落无光泽，精神不振;空白对照组大鼠毛发光
泽，体质量增加，体态活泼，食量饮水量及大便正常;中
药剂量组和易善复组的大鼠上述症状均有不同程度减
轻，特别是中药各组大便干燥、小便黄的症状明显改
善。造模结束后，模型组死亡 2 只，丹参组死亡 1 只，
其余各组大鼠均存活。
2． 2 光镜下肝脏病理学改变 空白对照组大鼠肝脏
肝小叶正常，汇管区结构完整、界限清晰，未见纤维组
织增生和其他异常(见图 1 A1 ～ A2);模型组大鼠肝脏
细胞肿胀、脂肪变性，正常肝小叶已破坏，坏死区有炎
细胞浸润，肝窦多数受压变窄或闭塞，门脉区有大量假
小叶形成(见图 1 B1 ～ B2)。阴行草组(见图 1 C1 ～
C2)、丹参组(见图 1 D1 ～ D2)、虎杖组(见图 1 E1 ～
E2)和易善复组(见图 1 F1 ～ F2)大鼠肝细胞坏死较模
型组减轻，未见假小叶，肝小叶多呈放射状分布，胶原
纤维间隔减少，汇管区纤维结缔组织增生不明显。
2． 3 各组大鼠纤维化分期的比较 模型组肝纤维化
分期程度最高，药物干预后，各组肝纤维化分期程度有
所下降，但与空白对照组比较，差异有统计学意义(P
＜ 0． 05，见表 1)。
2． 4 DNAM-1 在各组大鼠肝脏中的表达情况 光镜
下空白对照组细胞核和细胞浆可见淡黄色细颗粒，阴
行草组细胞核和细胞浆可见黄色细颗粒，模型组细胞
核和细胞浆可见棕黄色细颗粒。与空白对照组比较，
模型组 DNAM-1 表达阳性率更高(P ＜ 0． 05);阴行草
组与模型组、空白对照组比较，差异均有统计学意义
(P ＜ 0． 05);丹参组、虎杖组、易善复组与模型组相比，
差异无统计学意义(P ＞ 0． 05，见表 2、图 2)。
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图 1 光镜下肝脏病理学改变 A1:空白对照组(HE 100 ×);A2:空白对照组(VG 100 ×);B1:空白对照组(HE 100 ×);B2:模型组
(VG 100 ×);C1:阴行草组(HE 100 ×);C2:阴行草组(VG 100 ×);D1:丹参组(HE 100 ×);D2:丹参组(VG 100 ×);E1:虎杖组(HE
100 ×);E2:虎杖组(VG 100 ×);F1:易善复组(HE 100 ×);F2:易善复组(VG 100 ×)
Fig 1 The liver change of pathological under light microscopy A1:blank control group (HE 100 ×);A2:blank control group (VG
100 ×);B1:model group (HE 100 ×);B2:model group (VG 100 ×);C1:Siphonostegia chinensis group (HE 100 ×);C2:Sipnonoste-
gia chinensis group (VG 100 ×);D1:Salvia militorrhiza group (HE 100 ×);D2:Salvia militorrhiza group (VG 100 ×);E1:Polygonum
cuspidatum group (HE 100 ×);E2:Polygonum cuspidatum group (VG 100 ×);F1:Polyene phosphatidylcholine capsules group (HE 100
×);F2:Polyene phospha tidylcholine capsules group (VG 100 ×)
表 1 各组大鼠纤维化分期的比较
Tab 1 Comparison of rats with fibrosis stage in each group
组别 例数
纤维化分期
S0 S1 S2 S3 S4
模型组* 18 0 2 2 7 7
阴行草组＊▲ 20 1 6 6 5 2
丹参组＊▲ 19 2 7 5 5 0
虎杖组＊▲ 20 1 5 7 6 1
易善复组＊▲ 20 1 8 5 6 0
空白对照组 20 20 0 0 0 0
注:与空白对照组比较，* P ＜ 0． 01;与模型组比较，▲P ＜ 0． 01。
图 2 免疫组化染色后大鼠肝脏组织中 DNAM-1 的表达(400 ×) A:弱阳性表达;B:阳性表达;C:强阳性表达
Fig 2 DNAM1 expression in rat liver tissue after immunohistochemical staining(400 ×) A:weakly posituve expression;B:positive
expression C:strong positive expression
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表 2 DNAM-1 在各组大鼠肝脏中的表达
Tab 2 Expression of DNAM-1 in rats with liver fibrosis
组别 弱阳性 阳性 强阳性 合计
空白对照组 7 10 3 20
模型组 4 7 7 18
虎杖组 6 9 5 20
丹参组 5 8 6 19
阴行草组 2 13 5 20
易善复组 5 9 6 20
2． 5 DNAM-1 免疫组化定量分析结果 PU 值越大，
阳性反应强度越大;PU 值越小，阳性反应强度越小。
阴行草组中 DNAM-1 的 PU 值(34． 12 ± 3． 69)高于空
白对照组(25． 14 ± 2． 38)，而低于模型组(48． 26 ±
1． 25)，差异均有统计学意义(P ＜ 0． 01);模型组 PU
值高于空白对照组，差异有统计学意义(P ＜ 0． 01)。
3 讨论
表面黏附分子 DNAM-1(DNAX accessory molecu-
lar 1，CD226)是一种主要表达于 NK 细胞、T 细胞等多
种细胞表面的活化性受体［1］，属于免疫球蛋白超家族
的成员之一，胞外区有 2 个免疫球蛋白 V 样结构
域［6-7］。转录因子 AP-1、ets1、Sp1 参与 DNAM-1 表达
的调控［8］，并通过作用于 TGF-β1 参与肝纤维化的形
成［11-15］。此次研究中大鼠肝脏组织免疫组化结果表
明 DNAM-1 在肝纤维化模型组与空白对照组中的表达
存在差异性(P ＜ 0． 05)，免疫组化定量分析结果也证
明了 DNAM-1 在肝纤维化模型组中表达明显增强。说
明 DNAM-1 的过表达在肝纤维化进展过程中起到了重
要的促进作用，具体机制一方面可能与 AP-1、est1、Sp1
和 TGF-β相互调节作用有关，参与了 TGF-β1 /Smad调
控途径，另一方面其本身可以促进 IL-6、TNF-α 的释
放［16］，增加炎症反应，进一步加重了肝纤维化程度。
此次实验同时肯定了阴行草水煎液对肝纤维化的
治疗效果，与模型组相比阴行草组可显著降低 CCL4
诱导的肝纤维化程度。阴行草主要化学成分包括多种
挥发油、黄酮、奎尼酸酯、生物碱类、木脂素类等起到了
抗菌抗炎、活血化瘀、保肝利胆、降低血清胆固醇等作
用［5］。阴行草水煎剂可以明显降低 CCL4 造成肝损伤
大鼠体内转氨酶水平。实验中通过阴行草组水煎液的
干预，大鼠肝脏组织中 DNAM-1 的表达与模型组比较，
差异有统计学意义，与空白对照组比较，差异也有统计
学意义，定量分析显示阴行草组 DNAM-1 表达水平高
于空白对照组，低于模型组，说明阴行草发挥抗纤维化
作用可能与抑制 DNAM-1 的表达有关。
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(责任编辑:王全楚)
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