全 文 ：白 ,因此比具有生物学活性的蛋白更迟洗脱出来 。
在 RP-HPLC分析的同时 ,取样做 MTT 生物学活性
测定。发现 RP-HPLC分析中有活性蛋白峰的峰面
积相对百分比的增加与 MTT 生物学活性的增加不
成比例关系 。因为复性液中有许多因素会影响
MT T 法生物学活性测定的结果 ,而且 MTT 法本身
就有一定的相对误差 ,因此用 MTT 法是无法获知
rhG-CSF 已复性的蛋白所占的比例的。而 RP-
HPLC法可以看出在复性过程中 ,随着蛋白质折叠
的进行 ,有生物学活性的蛋白增多 。另外 , rhG-CSF
有两对半二硫键 ,复性过程中易形成二硫键错配 ,这
些错配的 rhG-CSF 以及复性不完全 rhG-CSF 的疏
水性比天然结构的 rhG-CSF 疏水性大 ,这都可以通
过 RP-HPLC 检测得到 。因此本实验所述方法适用
于 rhG-CSF 复性动态监测 ,同样也可用于其它基因
工程产品的复性监测 ,提示纯化工作者何时可以结
束复性 ,进入下一步的纯化工作 。
参考文献
1 白东亭 ,许丽峰.重组大肠杆菌的包涵体.中国生物制品学杂
志 , 1996 , 9(4):188.
2 崔立斌 ,马清钧.新生肽链的折叠与重组蛋白可溶性表达.生物
工程进展 , 1998, 18(1):36.
3 Geng XD , Chang XQ.Highperformance hydrophobic interaction
chromatography as a tool for protein refolding.J Chromatogr ,
1992 , 599:185.
4 Benedek K , Dong S , Karger BL.Kinetics of unfolding of p roteins
of hydrophobic surfaces in reversed-phase liquid chromatography.
J Chromatogr , 1984 , 317:227.
5 谢异鸿 ,马红.测定重组人集落刺激因子生物学活性的 MTT 比
色法.中国免疫学杂志 , 1997 , 13(4):225.
(收稿:1999-03-05)
气相色谱法测定细辛挥发油中甲基丁香酚和黄樟醚的含量
周长征 杨春澍 马长华 王嘉琳 (北京 100029北京中医药大学中药学院)
摘要 目的:探讨正品细辛与非正品细辛 、细辛地上部分与地下部分及正品细辛间挥发油中主成分含量的差异 ,为建立中药
细辛的质量评价体系提供资料。 方法:首次用内标法对国产药用细辛 12 个种共 24 个样品挥发油中甲基丁香酚
(methyleugenol)和黄樟醚(saf role)的含量进行了气相色谱分析。结果与结论:正品细辛中甲基丁香酚和黄樟醚的含量远高于
非正品细辛;正品细辛地下部分和地上部分挥发油中两种成分的含量差异不大;三种正品细辛的挥发油中甲基丁香酚的含量
依次为汉城细辛>北细辛>华细辛 ,黄樟醚的含量依次为华细辛>北细辛>汉城细辛。
关键词 细辛;甲基丁香酚;黄樟醚;气相色谱
Quantitative determination of methyleugenol and safrole in Herba Asari by gas chromatography
Zhou Chang zheng (Zhou CZ), Yang Chunshu(Yang CS), Ma Changhua (Ma CH), et al (Beijing University of
T raditional Chinese Medicine , Beijing 100029)
ABSTRACT OBJECTIVE:To quantitatively analyze methyleugenol and safrole in Herba Asari by GC.METHODS:The gas chro-
matographic conditions included column SE-54 , suppor ting gas of N 2 and F ID detector.The internal standard w as n-tetradecane.RE-
SULTS and CONCLUSION:The content of methyleugenol and safro le in Sect.Asiasarum w as far more than that in o ther sections;
There w asn′t evident difference in the content of these tw o compound between the upterranean par t and the subterranean part.In the
case of Sect.Asiasarum , the content of methy leugenol decreased in the fo llowing order:Asarum sieboldii f.seoulense>A.het-
erotropoides var.mandshuricum >A. sieboldii.On the o ther hand , the content of safrole decrease in the following o rder:A.
sieboldii>A.heterotropoides var.mandshuricum >A.sieboldii f.seoulense.
KEY WORDS Herba Asari , methyleugenol , safrole , gas chromatography
细辛为常用中药 ,中国药典 1995年版一部将北
细辛 [ Asarum heterotropoides Fr. var. mand-
shuricum (Maxim.)Kitag.] 、汉城细辛(Asarum
sieboldi i M iq. var. seoulense Nakai)和 华细 辛
(Asarum sieboldi i Miq.)列为正品 。细辛的主要有
效成分为挥发油 ,挥发油中主要含甲基丁香酚 、黄樟
醚和榄香脂素;其中甲基丁香酚有麻醉和镇痛作用;
黄樟醚为广谱抗霉菌成分 ,但同时有较大毒副作用 ,
两者可作为药材细辛的品质评价指标[ 1] 。我们首
次用内标法测定了 24 个细辛样品中甲基丁香酚和
·836· Ch in Pharm J , 1999 December , Vol.34 No.12 中国药学杂志 1999年 12月第 34卷第 12期
黄樟醚的含量 ,目的在于探讨正品细辛与非正品细
辛 、细辛地上部分与地下部分及正品细辛间该两种
成分含量的差异 ,为建立合理的中药细辛的质量评
价体系提供资料 。
1 药品 、仪器及其工作条件
1.1 实验材料
原植物及产地见表 1 ,所有材料均经杨春澍教
授鉴定 。其中 8 ～ 15号样品采于 1997年 6月 ,其余
样品采于 1996年 6月 。
1.2 药品
表 1 细辛类药材挥发油中甲基丁香酚和黄樟醚的含量
样 品
代号 种类 产地
甲基丁香酚含量/ %
地下
部分
地上
部分
全草
黄樟醚含量/ %
地下
部分
地上
部分
全草
样 品
代号 种类 产地
甲基丁香酚含量/ %
地下
部分
地上
部分
全草
黄樟醚含量/ %
地下
部分
地上
部分
全草
1 华细辛1) 陕西洛南 14.31 14.23 14.28 23.16 15.03 19.97 16 川北细辛1) 四川城口 2.13 10.57
2 北细辛 陕西洛南 58.26 58.24 58.26 0.51 0.49 0.51 17 双叶细辛1) 四川城口 1.54 3.62
3 北细辛 辽宁本溪 22.26 20.91 21.80 22.91 8.06 17.86 18 青城细辛1) 四川峨嵋 5.16 1.39
4 北细辛 辽宁本溪 28.90 22.90 27.32 11.48 16.60 12.88 19 单叶细辛1) 四川峨嵋 6.75 6.51
5 汉城细辛 辽宁本溪 53.29 36.43 46.56 6.77 10.65 8.33 20 短尾细辛1) 四川峨嵋 20.77 0.08
6 北细辛 辽宁凤城 26.09 31.59 27.64 14.21 14.78 14.37 21 铜钱细辛1) 四川巫溪 3.37 4.14
7 北细辛 辽宁本溪 32.95 26.89 31.52 19.81 15.27 18.72 22 山慈菇1) 广西金秀 7.28 0.63
8 华细辛1) 四川城口 0.51 0.49 0.50 35.39 36.54 35.76 23 大别山细辛1)安徽霍山 3.66 14.43
9 华细辛1) 湖北神农架 32.22 34.87 33.07 11.76 13.90 12.50 24 武隆细辛1) 四川武隆 5.24 1.51
10 华细辛1) 四川巫溪 30.16 31.60 30.57 10.38 11.26 10.63 华细辛平均 19.30 20.30 19.61 20.17 19.19 19.72
11 汉城细辛1) 吉林抚松 49.60 43.05 47.73 3.56 6.30 4.34 北细辛平均 37.48 36.40 37.22 10.38 8.72 9.85
12 北细辛 吉林抚松 39.35 39.26 39.32 1.99 2.08 2.02 汉城细辛平均 51.49 39.74 47.15 5.17 8.48 6.34
13 北细辛 吉林柳河 45.37 43.99 45.15 3.56 1.97 3.22 非正品细辛平均 6.21 4.76
14 北细辛 黑龙江五常 40.95 40.98 40.96 9.38 9.50 9.41 正品细辛平均 34.50 32.60 33.85 12.30 11.48 11.80
15 北细辛 黑龙江牡丹江 43.17 42.84 42.97 9.67 9.71 9.68
注:1)为野生药材 ,表中空白处为未测项目
甲基丁香酚和黄樟醚(分析纯 ,日本进口);n-十
四烷(上海化学试剂站分装 ,分析纯);无水乙醚(北
京化工厂产 ,分析纯)。
1.3 仪器及工作条件
GC-MS:PYE-204气相色谱仪 ,SE-54 石英毛细
管色谱柱(30 m×0.32 mm),柱温 40 ～ 220℃,升温
速度 4℃·min-1 ,气化室温度 240℃;载气为氦气 ,柱
前压 68.6 kPa ,进样量:0.13 μl。VG MM70-70H
质谱仪 ,分辨率 500 ,电离方式 EI ,电子能量 70 eV ,
离子源温度 200℃,加速电压 4 kV ,扫描速度 1 s/
dec。KY-GC/MS-DS2数据处理系统。
岛津 GC-7AG气相色谱仪:载气为氮气 ,检测
器 FID ,分流比 50∶1 ,进样量0.5μl ,其他条件同上 ,
岛津 CHROMATOPA C-R4A数据处理系统 。
2 方法与结果
2.1 挥发油提取
按中国药典 1995年版一部附录规定的方法提
取挥发油 ,以无水硫酸钠干燥 。
2.2 挥发油中甲基丁香酚和黄樟醚的确认
用气-质联用法将挥发油的质谱图与标准品质
谱图对照确定两种成分的峰位 。
2.3 内标物的确定
将挥发油的气相色谱图分别与 n-十一烷 、n-十
四烷 、n-十六烷 、n-十七烷及萘的气相色谱图比较 ,
发现只有 n-十四烷符合要求。故选用 n-十四烷做
内标物 。
2.4 线性关系实验
如表 2所示 ,配制不同浓度的若干对标准品溶
液(无水乙醚做溶剂),按“1.3”项条件测定 ,当标准
品浓度为 0 ～ 25 μl·ml-1时呈线性关系。经计算得
回归方程。
表 2 标准品溶液中各标准品的浓度.μg·ml-1
编号 甲基丁香酚 黄樟醚 n-十四烷 编号 甲基丁香酚 黄樟醚 n-十四烷
1 2 2 10 6 7 7 10
2 3 3 10 7 8 8 10
3 4 4 10 8 15 15 10
4 5 5 10 9 25 25 10
5 6 6 10
黄樟醚的回归方程:Y =0.0352+10.002X ,相
关系数 r=0.999 95
甲基丁香酚的回归方程:Y′=-0.0184 +
10.438X′,相关系数 r′=0.99995
X :色谱图中黄樟醚峰面积/n-十四烷峰面积;
Y :每毫升溶液中所含黄樟醚的微升数;X′:色谱图
中甲基丁香酚峰面积/n-十四烷峰面积;Y′:每毫升
溶剂中所含甲基丁香酚微升数。
2.5 含量测定
分别精密量取细辛挥发油 40 μl , n-十四烷 10
μl ,置 1 ml量瓶中 ,用无水乙醚定容至刻度 ,摇匀。
用 1.3所示方法测定 ,每个样品连续进样 3次 ,取平
均值计算含量。结果见表 1。
2.6 回收率实验
·837·中国药学杂志 1999年 12月第 34卷第 12期 Chin Pharm J , 1999 December , Vol.34 No.12
在样品中选择不同含量的样品溶液 ,加入已知
量的标准品进行测定 ,计算回收率 ,结果见表 3 。
表 3 回收率试验测定结果
甲基丁香酚
加入量 测得量 回收率 RSD
/μl /μl / % / %
黄樟醚
加入量 测得量 回收率 RSD
/μl /μl / % / %
2 1.977 98.85 2 1.981 99.06
3 3.059 101.97 3 2.957 98.56
5 5.056 101.11 1.23 5 4.998 99.95 0.85
6 5.984 99.74 6 6.048 100.80
8 8.173 102.17 8 8.014 100.17
15 15.068 100.45 15 15.062 100.41
3 讨 论
3.1 与前人工作的比较
前人对细辛药材挥发油中这两种成分的含量虽
有报道[ 2 ～ 6] ,但所用测定方法均为外标法或面积归
一化法 ,所测样品一般较少 。作者首次用内标法对
国产 24个细辛样品挥发油中甲基丁香酚和黄樟醚
的含量进行了普查 ,样品均为近两年内采集并妥善
保管的花期药材。结果表明 ,正品细辛挥发油中甲
基丁香酚和黄樟醚的平均含量分别为 33.85%和
11.80%,而非正品分别为 6.21%和 4.76%。正品
细辛挥发油中的这两种成分的含量均远高于非正品
细辛 。另外 ,从文献及我们的实验结果来看 ,正品细
辛中挥发油的含量一般是非正品细辛的 2 ～ 10倍 。
鉴于细辛中主要有效成分为挥发油 ,而甲基丁香酚
和黄樟醚又为挥发油的主成分 ,药典将华细辛 、北细
辛及汉城细辛列为药用细辛正品是合理的。
3.2 3种正品细辛中两种成分的含量差异
从表 2可以看出 , 3种正品细辛全草挥发油中
甲基丁香酚的平均含量分别是:华细辛 19.61%,北
细辛 37.22%,汉城细辛 47.15%;黄樟醚的平均含
量分别是:华细辛 19.72%,北细辛 9.85%,汉城细
辛 6.34%。3种细辛挥发油中两种成分含量的高低
顺序与前人所得结果基本一致[ 2～ 6] ,其中汉城细辛
甲基丁香酚的含量最高 ,黄樟醚的含量最低;华细辛
甲基丁香酚的含量最低 ,黄樟醚的含量最高。因此 ,
可以认为汉城细辛质量最好 ,北细辛次之 ,华细辛最
次。3种正品细辛的挥发油含量分别是:汉城细辛
2.92%,北细辛 2.76%,华细辛 2.68%。因此 ,从挥
发油含量来看 ,也是汉城细辛质量最好。从市场上
的商品来看 ,汉城细辛和北细辛统称为辽细辛入药 ,
商品辽细辛实际上是北细辛和汉城细辛的混杂品 。
综上所述 ,商品辽细辛的质量优于华细辛 ,说明本草
记载最早使用的正品细辛是华细辛 ,而辽细辛后来
居上 ,成为药用细辛之佳品是有道理的 。
长沢元夫[ 7]根据其对日本产华细辛组植物的
研究指出 ,该组植物挥发油中甲基丁香酚的含量北
方高于南方 ,黄樟醚的含量南方高于北方 。顾月翠
等[ 2]的研究中国产华细辛组植物挥发油中该两种
成分的含量也有这种现象。但我们认为 ,该现象与
遗传因素有关 ,地理环境的影响占次要地位 。如 2
号样品由东北移栽到陕西后甲基丁香酚的含量仍很
高 。在 15个正品细辛样品中 ,两种成分的含量相差
悬殊。甲基丁香酚最高为 58.26%,最低为 0.50%;
黄樟醚含量最高达 35.76%;最低为 0.51%。为保
证中药细辛的用药安全 、有效 ,建立合理的量化质量
标准 ,对这两种成分规定含量范围的深入研究是必
要的。
3.3 地上部分与地下部分的含量差异
沈保安[ 8] 、米秋雯等[ 9] 考证认为 ,细辛的药用
部位在民国以前为地下部分 ,现用全草 。王栋等[ 10]
曾用气相色谱面积归一化法 ,对黑龙江产辽细辛中
两种成分的含量进行分析 ,结果发现 ,地下部分甲基
丁香酚占挥发油的 21%～ 39%, 黄樟醚为 17%～
33%;地上部分甲基丁香酚为 1.4%～ 9.5%,黄樟
醚为 0.36%～ 2.13%;地下部分挥发油中两种成分
的含量显著高于地上部分。但我们研究发现 ,各种
正品细辛地上部分与地下部分挥发油中两种成分的
含量基本一致 。我们还发现 ,细辛地上部分一般占
全草重量的 28.7%,而细辛地下部分的挥发油含量
一般只占全草重量的 6.7%。综上所述 ,虽然细辛
地上部分的挥发油含量远小于地上部分 ,但两部分
挥发油的主成分含量基本一致 。因此 ,细辛药用全
草是可行的 ,但其用量须加大。
3.4 新药源的开发
作者研究发现 ,在几种非正品细辛中 ,短尾细辛
挥发油的甲基丁香酚含量比较高(20.77%),黄樟醚
的含量很低(0.08%),挥发油含量也较高(1.55%左
右)。民间使用经验亦认为该种的镇痛效果较明
显[ 1] 。该植物值得进一步研究开发利用 。
致谢 中国中医研究院中药所潘炯光 , 姚三桃研究员给予多
方面指导。
参考文献
1 杨春澍 ,张家俊 ,潘炯光 ,等.中国细辛属植物挥发油的气相色
谱-质谱分析(第四报).中药通报 , 1986 , 11(7):39.
2 顾月翠 ,钟明芳,陈绍槐.四川商品细辛挥发油的薄层层析和气
相层析.中国中药杂志 , 1987 , 18(7):11.
3 杨大峰 , 杨春澍 , 闫汝南.五个不同来源细辛挥发油气相色谱-
质谱分析.中国中药杂志 , 1997 , 22(7):426.
4 李向高 ,郑友兰 ,张崇禧.细辛化学成分的研究.吉林农业大学
学报 , 1988 , 10(3):28.
5 孙海英.辽细辛挥发油的气相-质谱分析.第二军医大学学报 ,
1993 , 14(2):193.
6 陈志歆 ,谭晓梅 ,金贞玉.无土栽培细辛与有土栽培细辛挥发油
·838· Ch in Pharm J , 1999 December , Vol.34 No.12 中国药学杂志 1999年 12月第 34卷第 12期