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系统医学 SYSTEMS MEDICINE
系统医学 2016 年 11 月第 1 卷第 11 期
DOI：10.19368/j.cnki.2096-1782.2016.11.114
榄绿粗叶木粗多糖提取工艺及对H22肝癌细胞
毒性影响
梁青龙，郭婷婷，温扬敏
泉州医学高等专科学校基础医学部，福建泉州 362011
[摘要] 目的 研究榄绿粗叶木多糖提取工艺优化及对 H22 肝癌细胞增殖抑制效果。 方法 2016 年 2—5 月从福建
宁化泥坑村采集榄绿粗叶木粗，在单因素分析的基础上，设计 3 因素 3 水平正交实验优化榄绿粗叶木粗多糖提
取工艺。并采用 MTT法测定榄绿粗叶木粗多糖对 H22肝癌细胞增殖抑制效果。 结果 影响榄绿粗叶木粗多糖提
取的首要因素是固液比，其次是水浴时间和温度。 粗多糖最佳提取条件为：温度 70 ℃、时间 12 h、固液比为 1∶15
(A2B2C3)。粗多糖对 H22肝癌细胞具有一定增殖抑制活性，抑制效果随粗多糖浓度增大而增加。 结论 水提醇沉
淀法榄绿粗叶木多糖提取有效方法，榄绿粗叶木多糖具有抑制肿瘤细胞增殖作用。
[关键词] 粗多糖；提取工艺；正交试验；肝癌
[中图分类号] R284.2 [文献标识码] A [文章编号] 2096-1782（2016）11－0114-04
Extraction of Crude Polysaccharides from L. lancilimbus and Inhibition of
Hepatoma Cell Lines H22 in Vitro
LIANG Qing-long，GUO Ting-ting，WEN Yang-min
Department of Basic Medical Sciences, Quanzhou Medical College, Quanzhou , Fujian Province，362011 Chinia
[Abstract] Objective Extraction technology and inhibition of Hepatoma cell Lines H22 in Vitro of crude polysaccha-
rides from L. lancilimbus were researched. Methods L.lancilimbus were collected from Nikeng village, Ninghua coun-
try, Fujian provience from February to May in 2016. Orthogonal experiment was applied to obtain the optimum extrac-
tion condition on the base of single factor experiment. the inhibitions of hepatoma cell Lines H22 in Vitro of crude
polysaccharides were measured by MTT assay. Results The main factor affecting extracting rate of polysaccharides was
solid-liquid ratio, followed by treated time and temperature. The optimum extraction conditions to obtain the highest
polysaccharides were 70℃, 12 h and solid-liquid ratio of 1∶15. polysaccharides from L. lancilimbus could inhibit cell
proliferation of hepatoma cell Lines H22 in Vitro, and the inhibition rate increased with the polysaccharides concentra-
tion. Conclusion Water extracting-ethanol precipitation method were applicable for extraction crude polysaccharides
from L. lancilimbus, and the polysaccharides can inhibit cell proliferation of gastric cancer cell in Vitro.
[Key words] Crude Polysaccharides; Extraction technology; Orthogonal test; Hepatoma
植物多糖具有抗肿瘤、降血糖、抗氧化等多种生
物活性，且兼有较小毒副作用和体内无残留等优点 [1]。
植物多糖的开发与利用已越来越受关注。榄绿粗叶木
(Lasianthus lancilimbus,Merr.) 属 于 茜 草 科 （Rubia
cordifolia L.）、粗叶木属（Lasianthus Jack, nom. cons.）
的一个变种[2]。 传统中医实践表明粗叶木属植物具有
治疗筋骨疼痛，活血止痛等作用，民间还将其用于治
[基金项目] 泉州市科技计划项目（2012Z76)。
[作者简介] 梁青龙（1958.11-），男，福建泉州人，本科，副教
授，研究方向：生理学。
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湿热黄疸等[3]。应用现代分离纯化技术，已从粗叶木属
中的长尾粗叶木[4]等中获得多种具有确定生理活性的
单体物质，而有关榄绿粗叶木药理开发研究较少。 该
文于 2016 年 2—5 月对榄绿粗叶木粗多糖提取工艺
优化及对 H22 肝癌细胞增殖抑制作用进行研究，为
榄绿粗叶木植物的医药价值研究提供基础。
1 资料与方法
1.1 实验材料与试剂
榄绿粗叶木由福建宁化泥坑村采撷，经过泉州林
业局林彦云先生鉴定；氯仿、无水乙醇、硫酸和正丁醇
等蒽酮和葡萄糖，肝癌细胞株、胎牛血清、培养基、
MTT试剂盒等。
1.2 实验方法
1.2.1 温度对粗多糖提取率的影响 将榄绿粗叶木根
用刀切成长约 2~3 cm，宽约 0.5~1 cm小块。称取 50 g，
放入 1 000 mL 三角瓶，再加入固液比 (g/mL)为 1∶10
去离子水。分别放到 40、50、60、70、80 ℃的水浴锅中水
浴 8 h 后，用定性滤纸对上清液进行过滤，滤液再用
Sevag 法除去蛋白后，用终浓度为 80%乙醇溶解，4 ℃
过夜沉淀。 冷冻干燥得到粗多糖粉末，每组实验设 3
个平行。
1.2.2 固液比对粗多糖提取率的影响 称取榄绿粗叶
木根 50 g，分别加入固液比 (g/mL)为 1:4、1:8、1:12、1:
16、1:20去离子水。于 50 ℃水浴锅中水浴 8 h，每组实
验设 3 个平行。 粗多糖提取同 1.2.1。
1.2.3 时间对粗多糖提取率的影响 称取榄绿粗叶木
根 50 g，分别加入固液比(g/mL)为 1:12 去离子水。 于
50 ℃水浴锅中水浴 3、6、12、24、36 h， 每组实验设 3
个平行。 粗多糖提取同 1.2.1。
1.3.4 正交试验优化粗多糖提取工艺 采用 L9(34)正
交进行正交试验优化多糖提取工艺，实验因素及水平
见表 1。
表 1 实验因素与水平
1.3.5 粗多糖测定 粗多糖含量的测定应用蒽酮比色
法[5]。标准曲线方程：y=0.5934x+0.4321，R2=0.9997。粗
多糖提取率(%)=（粗多糖质量/根质量）×100%。
1.3.6 榄绿粗叶木粗多糖对 H22 肝癌细胞增殖抑制
实验 H22 肝癌细胞用含 10％胎牛血清的 RPMI-
1640 培养基培养，取对数生长期细胞，分装于 96 孔
板，每孔 100 μL 调节细胞密度约为 6 000 个细胞每
孔。 每孔分别加入终浓度为 0（空白对照组）、0.5，1.0、
2.0、4.0 mg/mL 的粗多糖。 于 5％CO2、37 ℃饱和湿度
条件下培养 24、48、72 h 后，采用 MTT 法分别测定细
胞增殖抑制率。 细胞增殖抑制率(%)=(1－实验组吸光
度/空白对照组吸光度)×100%
2 结果与分析
2.1 温度对粗多糖提取率的影响
随着温度增加，榄绿粗叶木粗多糖提取率增大
（见图 1）。 当温度达到 60 ℃以上时，粗多糖提取率趋
于稳定。 与温度为 30 ℃比较，在 60、70、80 ℃条件下
粗多糖提取率均差异有统计学意义(P﹤0.05)。 而 60、
70、80 ℃条件下，各组粗多糖提取率差异无统计学意
义(P﹥0.05)。 表明 60、70、80 ℃条件下，粗多糖提取率
较高且比较稳定。
图 1 温度对粗多糖提取率的影响
2.2 固液比对粗多糖提取率的影响
固液比小于 1:12 mg/mL 时，随水量增加，粗多糖
提取率迅速增大。 而当固液比达到 1∶12 mg/mL时，固
液比继续增加榄绿粗叶木粗多糖的提取率无显著增
加（图 2）。 考虑到水量大，后续蒸发时间过长，耗时费
力，且可能破坏粗多糖，所以选择固液比 1:12 mg/mL
比较合适。
水平 温度（℃） 时间(h) 固液比(g/mL)
1
2
3
60
70
80
6
12
24
1:8
1:12
1:15
115
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图 2 固液比对粗多糖提取率的影响
2.3 时间对粗多糖提取率的影响
水浴时间＞24 h 时，榄绿粗叶木粗多糖提取率随
时间增加而增大，水浴时间 24 h时提取率最大（图3）。
与水浴时间 24 h比较，水浴 3 h 和 6 h 实验组粗多糖
提取率差异有统计学意义(P﹤0.05)，而水浴 12 h 和
36 h 实验组粗多糖提取率差异无统计学意义。 显示
继续延长处理时间对粗多糖提取率无显著影响。
图 3 时间对多糖提取率的影响
2.4 正交实验优化粗多糖提取工艺
表 2 正交实验结果
注：实验数据为 3 次试验结果平均值。
以粗多糖提取率为指标， 采用 3 因素 3 水平正
交实验对榄绿粗叶木粗多糖提取工艺进行优化，结果
见表 1。 直观分析显示影响粗多糖提取的主次顺序依
次为：固液比、水浴时间和水浴温度(C＞B＞A)。 方差分
析(表 2)显示，固液比对榄绿粗叶木粗多糖提取率差
异有统计学意义(P＜0.05)，而温度和时间对榄绿粗叶
木粗多糖提取率差异有高度统计学意义 (0.15＜P＜
0.01)。综合考虑榄绿粗叶木粗多糖提取最佳工艺是温
度 70 ℃、时间 12 h、固液比为 1∶15(A2B2C3)。 见表 3。
表 3 粗多糖提取的正交实验方差分析
2.5 粗多糖对肝癌细胞毒性作用
榄绿粗叶木粗多糖对 H22 肝癌细增殖抑制作用
见图 4，培养 24 h 后，不同粗多糖浓度对 H22 肝癌细
抑制差异无统计学意义（P＞0.05）。 细胞培养 48 h 和
96 h，肿瘤细胞的生长抑制率显著增加，且随粗多糖
浓度增大而增加。
图 4 多糖对 H22 肝癌增殖抑制率的影响
3 讨论
分离及纯化是研究多糖功能及性质的前提，水提
醇沉淀法是粗多糖提取最原始且应用最广泛的方法。
其原理是利用粗多糖不溶于有机溶剂，在粗多糖提取
水溶液中加入高浓度乙醇等使粗多糖沉淀析出，从而
达到初步分离的目的[6]。 该方法具有简单、经济、条件
温和不会破坏粗多糖等特点， 已广泛应用于多糖提
取。张国华等[7]以多糖提取率为指标，采用正交试验研
因素 偏差平方和 自由度 F P
温度(A)
时间(B)
固液比(C)
误差
0.076
0.086
0.149
0.005
2
2
2
2
15.84
17.84
30.89
0.05＜P＜0.10
0.05＜P＜0.10
＜0.05
组别 A温度(℃) B 时间(h) C 固液比（g/mL） 提取率(%)
1
2
3
4
5
6
7
8
9
K1
K2
K3
R
1 (60)
1 (60)
1 (60)
2 (70)
2 (70)
2 (70)
3 (80)
3 (80)
3(80)
1.38
1.59
1.55
0.21
1 (6)
2 (12)
3 (24)
1 (6)
2 (12)
3 (24)
1 (6)
2 (12)
3 (24)
1.37
1.54
1.61
0.24
1 (1:8)
2 (1:12)
3 (1:15)
2 (1:8)
3 (1:12)
1 (1:15)
3 (1:8)
1 (1:12)
2 (1:15)
1.40
1.43
1.69
0.29
1.11
1.36
1.66
1.38
1.77
1.61
1.63
1.48
1.55
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究冬虫夏草多糖的提取工艺。 结果显示加水量 10：1，
时间 0. 5 h，提取 3 次时提取率最高。 乙醇浓度 67%
时多糖沉淀效果最佳。 提示影响粗多糖提取的主要
因素包括提取时间、温度、固液比及 pH 值等，通过
优化提取工艺提高粗多糖提取率是的主要手段之
一。罗忠圣等 [8]研究水提醇沉淀对中药复方二岩虎果
汤的提取工艺，显示最佳提取条件为 10 倍量水，提取
1次，1 h/次，表明该方法稳定可行,且不影响药效。 该
研究通过对榄绿粗叶木粗多糖提取工艺进行优化，可
较大程度提高粗粗多糖提取率。其中正交试验最佳提
取率（A2B3C3）粗多糖提取率达 1.77%，比最低提取
率（A1B1C1）粗多糖提取率达 1.15%提高了 53.91%。
肿瘤已成为导致人类死亡的主要疾病之一，随着
癌症诊断和治疗技术的改善和癌症患者成活率不断
提高[9]。并由于现代人们不良生活习惯，环境污染因素
影响以及人口增长及老龄化等原因，全球癌症幸存者
的数量越来越多 [10]。 在肿瘤的治疗和预防中，药物占
有不可替代的地位。天然抗肿瘤活性成分也是合成化
学类抗肿瘤药物的先导化合物。天然药物一直是人类
获得药物的主要途径，时至今日天然药物仍是活性成
分或先导化合物发现的重要途径[11]。 植物多糖可通过
增强机体免疫活性、诱导肿瘤细胞分化与等发挥抗肿
瘤作用。从香菇分离的多糖已应用到抗肿瘤的临床治
疗，香菇多糖能极显著增高 NK 细胞活性，提高血清
中 IL-2、 IL-4、 IL-10、 IFN-γ 的含量，并通过调节免
疫系统而达到良好抗肿瘤效果[12]。 朱坤杰等[13]从库拉
索芦荟多糖和木立芦荟中提取多糖，显示不同剂量的
库拉索芦荟多糖和木立芦荟多糖均具有一定肿瘤抑
制活性， 其中高剂量组抑制率达 45.45%和 46.89%。
另外，还能恢复荷瘤机体免疫功能紊乱，特别是增加
脾脏的免疫功能而发挥抗肿瘤作用。此外，肖佩玉等[14]
研究表明枸杞多糖也改善荷瘤小鼠免疫活性而抑制
小鼠 H22肝癌细胞生长。给药 10 d后可见肿瘤减小，
AFP、 CEA、 TNF-α 含量降低，而 NK 细胞活性增强。
实验表明，榄绿粗叶木提取物具有抗氧化、抗菌、抑制
食管癌细胞等活性。 显示榄绿粗叶木多糖对 H22 肝
癌细胞具有较强体外抑制活性，细胞培养 48 h 后，不
同浓度粗多糖对 H22 肝癌细胞增殖均具有一定抑制
作用，且抑制率随粗多糖浓度增加而增大。
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（收稿日期：2016-08-15）
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