全 文 ：收稿日期:2003-05-13;修回日期:2004-02-20
基金项目:国家自然科学基金资助项目(3987099)
作者简介:邓亦峰(1960-), 男 , 江西上饶人, 高级工程师 .
液质联用对半边旗二萜类活性成分
分离富集方法的研究
邓亦峰 , 兰柳波 , 梁念慈
(广东医学院 广东省天然药物研究与开发重点实验室 , 广东 湛江 524023)
摘 要:运用高效液相色谱-质谱联用技术研究了以大孔吸附树脂富集分离 , 并以 AgNO3-硅胶柱分离纯化
半边旗二萜类活性成分的方法 。采用[ M-H] -为选择监测离子 , 以色谱保留时间和选择监测离子流峰面积
跟踪监测目标成分 , 探讨最佳分离条件;以萃取产物的总离子流图(TIC)和质谱图评价提取产物的纯度 。 研
究表明 , 大孔吸附树脂对 5F和 4F具有一定的分离富集作用;AgNO3-硅胶柱可以分离纯化 5F。 本实验对复
杂基体中化学结构上仅相差 1个双键 、相对分子质量相差 2的 5F和 4F(无紫外吸收)进行了分析鉴定 , 获得
满意结果 。
关键词:高效液相色谱-质谱;半边旗;二萜类;分离;鉴定;富集
中图分类号:O657.63;Q949.365 文献标识码:A 文章编号:1004-4957(2004)03-0097-03
Separation and Enrichment of the Active Diterpenoid Constituent from Pteris
Semipinnata L by HPLC-MS
DENG Yi_feng , LAN Liu_bo , LIANG Nian_ci
(Guangdong Key Laboratory for the Research and Development of Natural Drugs , Guangdong Medical College ,
Zhanjiang 524023 , China)
Abstract:A method for the separation and enrichment of the active constituent 5F(ent_11α_hydroxy_15_
oxo_16_kauren_19_oic acid)from pteris semipinnata L using HPLC-MS is described.Macro_porous ad-
sorption resin and step_gradient elution with alcohol were employed to separate and partially collect the ac-
tive component.Silica gel impregnated with AgNO3 solution was used for further purification of 5F.A
quadrupole mass spectrometer coupled with an atmospheric-pressure chemical_ionization interface served
as the HPLC detector for the detection and identification of the separated constituents.The retentive time
of the SIM ion [M-H] -was monitored for constituent identification , whereas the peak area of the SIM
ion was measured for its quantitative determination.Both measures were employed to track the target con-
stituent and to find the optimal separation conditions.Total ion chromatograms and mass spectra were mea-
sured to estimate the purity of the extracted product.The successful identification and determination of
two similar compounds 5F and 4F(ent_11α_hydroxy_15_oxo_kaur_19_oic acid), of which the latter com-
pound has no absorption bands in the UV range and differs from the former only by 2 units in molecular
mass and by one double bond in chemical structure , has fully demonstrated the superior resolving power
and sensitivity of the HPLC-MS technique.
Key words:HPLC-MS;Pteris semipinnata L;Diterpenoid;Separation;Identification;Enrichment
半边旗(Pteris semipinnata L , PsL)为凤尾蕨科植物 , 收载于《中药大词典》 , 民间认为有解毒 、消肿
及治疗蛇伤的功效 , 国外文献报道其含二萜和倍半萜等化合物 [ 1]。 梁念慈等人首先研究发现半边旗
中具有 α、 β_亚甲基环戊酮基团结构的贝壳衫烷型二萜类化合物具有强抗癌作用 , 并对它们作了分
离鉴定 [ 2]。 半边旗中二萜类化合物主要以 5F(ent_11α_hydroxy_15_oxo_16_kauren_19_oic acid)和 4F(ent_
11α_hydroxy_15_oxo_kaur_19_oic acid)形式存在 , 生药中二者的比例因产地和季节差异变化大 。 5F和 4F
仅相差一个双键 , 5F有抗肿瘤活性 , 4F无抗肿瘤活性 , 也无紫外吸收 , 提取物中二者较难分离 , 采用
通常的 HPLC-UV(紫外检测器)不能评价分离效果 。 它们的结构式如图 1。
第 23卷第 3期 分析测试学报 Vol.23 No.3
2004年 5月 FENXI CESHI XUEBAO(Journal of Instrumental Analysis) 97～ 99
图 1 5F和 4F的结构式
Fig.1 Structures of 5F and 4F
本文利用高效液相色谱(HPLC)-质谱(MS)联
用技术研究了大孔吸附树脂富集分离和 AgNO3-硅
胶分离纯化 5F和 4F 的方法 , 对分离产物作了分析
鉴定。 该法为半边旗抗肿瘤药物的开发和提取工
艺的制定提供了高效 、可靠的分析手段。
1 实验部分
1.1 仪器与试剂
岛津 LCMS-8000α型高效液相色谱-质谱联
用仪(含在线脱气机 , 两台 LC-10AVP高压输液泵 , SPD-10AVP紫外检测器 , 柱温箱 , APCI源接口 ,
四极杆质谱检测器)。
CH 3CN(HPLC级 , 美国 Fisher公司)、乙酸铵(分析纯)、三重蒸馏水 、高纯氮气 , 用于液质联用分
析;乙醇 、甲醇 、氯仿 、硝酸银等均为分析纯 , 用于提取分离。 D101大孔吸附树脂(天津农药股份有
限公司), 硅胶 GF 254 , 粒度≤30μm(青岛海洋化工厂)。
5F 、4F对照品(本课题组分离纯化 , 由日本东京理科大学药学部和广东医学院医用生化研究所鉴
定);半边旗生药材采集于广州市郊 , 由湛江海洋大学杨燕君副教授鉴定。
1.2 5F和 4F的 HPLC-MS分析鉴定方法
参照文献[ 3] , 色谱条件为:色谱柱为 Diamonsil C18, 5μm(4.6mm×150mm);流动相 A为CH3CN ,
流动相 B为 2 mmol·L -1NH4AcO水溶液 , V(A)∶V(B)=35∶65;流速 1mL·min-1 , 进样 5μL。
质谱条件:APCI离子源 , 电极温度 400 ℃, 电晕(Corona)电压-4.0 kV , 离子传输电压+55 V , 温
度 250 ℃, 偏转电压-40V , 检测器电压 1.6 kV , 喷雾氮气流速 2.5 L·min-1。 以色谱保留时间 4.5
min、 m/z 331和色谱保留时间 5.5 min、 m/z 333分别为 5F和 4F的选择监测离子峰。 采用选择监测
离子流(MIC)峰面积进行定量;以总离子流图(TIC)和质谱图鉴定化合物的纯度 , 质量范围 m/z 50 ～
500 , 扫描间隔 1 s。
该法对 5F的检测线性范围为 0.05 ～ 2.5μg , 相关系数大于 0.999 , 检出限达 0.4 ng(进样 5μL)。
5F的加标回收率为 97.8%(n=3)。
1.3 半边旗有效成分的提取与分离
1.3.1 提 取 取半边旗地上部分 , 晾干 , 打成 0.614 ～ 0.27 mm的粉状。 将药粉投入超临界二氧
化碳萃取釜中 , 以超临界二氧化碳和乙醇组成的复合流体萃取(萃取条件另文探讨), 收集 、浓缩萃
取液 , 得提取物浸膏。
1.3.2 大孔吸附树脂富集分离 将提取物浸膏制成 20%(φ)乙醇水混悬液 , 以每小时 1倍柱床体积
的流速流过预先处理好并以 20%(φ)乙醇平衡的 D101大孔吸附树脂柱(4 cm×80 cm), 至有色层约
1/4柱体积 。 用 20%～ 30%(φ)乙醇以每小时 1倍柱床体积的流速洗脱 3倍柱体积;然后用 35%、
45%、 55%、 75%(φ)乙醇以每小时 1倍柱床体积的流速依序阶梯洗脱 3倍柱体积 , 洗脱液每 500 mL
分部收集 , 依序收集备测 。 合并含有5F、且 5F浓度大于 4F浓度的洗脱液 , 减压脱醇 、除去水分 , 然
后以乙醇重结晶 , 得半边旗总二萜提取物 。
1.3.3 AgNO3-硅胶柱纯化分离 将半边旗总二萜提取物以常规硅胶柱层析方法预分离 , 得到的 5F
和 4F混合组分在避光条件下加入到浸渍了 AgNO3的硅胶柱(2 cm×40 cm)上 , 以氯仿-甲醇梯度洗
脱 , 从 99.5∶0.5洗至 98∶2(氯仿-甲醇的体积比), 分部收集流分 , 备测。 分取纯化的 5F流分 , 重
结晶 , 得到 5F纯化产物。
2 结果与讨论
2.1 大孔吸附树脂富集分离
采用 HPLC-MS且以选择离子监测(SIM)方式对以 35%～ 75%(φ)乙醇水溶液阶梯洗脱得到的洗
98 分析测试学报 第 23卷
图 3 5F和 4F的选择监测离子流(MIC)图
Fig.3 MIC of 5F and 4F
a.On startup of 55%alcohol elution;b.At the end
of 55% alcohol elution;1.5F;2.4F
图 4 纯化产物的总离子流图(TIC)(A)
和质谱图(B)
Fig.4 Total ion chromatogram and mass
spectrum of the purified product
1.5F;m/z=331 [ M-H] -;m/z=313[ M-
H2O-H] -
图 2 5F与 4F的含量比-洗脱体积曲线
Fig.2 Ratio of 5F to 4F versus eluent volume
1.Mass ratio of 5F to 4F;2.Eluent volume
脱流分中的 5F和 4F进行含量测定 , 计算各流分中 5F与 4F的含量比 。 结果表明 , 35%(φ)乙醇洗不
出 5F和 4F;45%(φ)乙醇起 , 5F伴着 4F被洗脱 , 随着乙醇浓度增大 , 5F与 4F的含量比逐渐变小 。
以 5F与 4F的含量比对阶梯洗脱体积作图(如图 2), 可以观察到在 45%～ 55%(φ)乙醇 、洗脱体积约
10 000 mL时 5F 与 4F的含量比变化最大 。 55%(φ)乙醇初始与最终时 5F 与 4F 的含量比相差近 4
倍 , 它们的 HPLC-MS谱图如 3。
实验表明 , 可以采用 35%(φ)乙醇洗脱吸附了样品的大孔吸附树脂 、除去极性部分杂质 , 再以
45%～ 55%(φ)乙醇洗脱 , 收集 5F与 4F 含量比较高的流分浓缩 、结晶 , 可达到富集分离 5F 的目的。
结晶产物中有效成分 5F的含量达 57%, 符合新药报
批规定的有效成分含量要求 。
2.2 AgNO3-硅胶柱纯化分离
采用 HPLC-MS 且以扫描(SCAN)方式得到Ag-
NO 3 -硅胶柱纯化产物的总离子流图和质谱图 , 如
图 4。 以选择离子峰面积计算 5F 与 4F 的含量比 ,
分析得到的质谱图并与对照品质谱图比较 , 鉴定纯
化产物的纯度 。 结果表明 , 得到的 5F纯化产物中 5F
的含量达 95%, 该法可用于 5F的纯化制备。
2.3 5F和 4F的分离方法
利用 AgNO3-硅胶的 Ag +与 π电子的相互作用从
5F和 4F的混合物中纯化出 5F被证明是有效的 , 但其
受处理容量 、实验条件和溶剂使用的限制 , 难以用于
生产工艺中 。 利用大孔吸附树脂的吸附和分子筛作
用 , 以乙醇梯度洗脱的提取工艺 , 可提高活性成分 5F
在半边旗二萜类提取物中的比例 , 达到一定的富集分
离效果。 该法简便 、处理量大 、溶剂无毒 , 有利于克
服生药中 5F与 4F的含量比因产地和季节变化对提取
产物的影响 , 实现提取工艺的质量控制。
3 结 论
高效液相色谱-质谱联用方法分析天然产物组
分 , 具有选择性好 、灵敏度高和响应广泛的优点 [ 4]。
采用该法以扫描方式获得的萃取产物总离子流图
(TIC)包含提取产物总量(纯度)及其极性分布信息 ,
以选择离子监测方式可以检测 、跟踪复杂样品中的目
标成分 , 这对提取工艺的优化 、评价分离效果非常有
效 。 本实验利用这些特性对提取物中化学结构上仅
相差一个双键 、相对分子质量相差 2的 5F和 4F(无紫
外吸收)进行分离检测 , 充分展示了 HPLC-MS的优
越性 。
参考文献:
[ 1] MAURAKAMI T , TANAKA N.Occurrence , structure and taxonomic implications of fern constituents[ J] .Prog ChemOrganic
Nat Prod , 1988 , 54:1-310.
[ 2] 梁念慈 , 崔 燎 , 张 晓 , 等.半边旗提取物及其医药组合物[P] .中国专利:ZL 95 1 19380.5.
[ 3] 邓亦峰 , 梁念慈 , 梁 统.HPLC-APCI-MS分析半边旗中二萜类化合物[ J] .药学学报 , 2002 , 37(6):444-446.
[ 4] ZHOU S L , HAMBURGER M.Application of liquid chromatograph-atmospheric pressure ionization mass spectrometry in
natural product analysis:Evaluation and optimization of electrospray and heated nebulizer interfaces[ J] .J Chromatogr , A ,
1996 , 755:189-204.
第 3期 邓亦峰等:液质联用对半边旗二萜类活性成分分离富集方法的研究 99