全 文 ：收稿日期:2007-12-14;　修订日期:2008-03-18
作者简介:王德才(1962-),男(汉族),山东枣庄人 ,现任泰山医学院生物
科学系教授 , 硕士学位 ,主要从事天然产物有效成分分离与活性研究
工作.
杭白芷多糖体外抗氧化活性的研究
王德才 , 高丽君 , 高艳霞
(泰山医学院 ,山东 泰安　271016)
摘要:目的 观察杭白芷多糖(PAD)体外抗氧化作用。方法 羟自由基(· OH)由 Fenton反应体系产生 ,超氧阴离子自由
基(O2 -· )由邻苯三酚自氧化法产生 , 硫代巴比妥酸法测定肝匀浆丙二醛(MDA)相对含量来反映 PAD对脂质过氧化
(LPO)的影响。结果 PAD能清除· OH和 O2 -· ,并抑制 LPO, 达到 50%清除率或抑制率所需药物浓度(EC50)分别为
250.9, 2541.7和 670.0mg/ml;维生素 C清除· OH和 O2 -· 以及抑制 LPO的 EC50分别为 113.2, 45.8和 321.8 mg/ml。
结论 PAD具有体外抗氧化作用 ,但其活性较维生素 C弱。
关键词:杭白芷;　多糖;　羟自由基;　超氧阴离子自由基;　脂质过氧化
中图分类号:R285.5　　文献标识码:A　　文章编号:1008-0805(2009)01-0173-02
AntioxidativeEffectsofPolysaccharidefromRadixAngelicaeDahuricainVitro
WANGDe-cai, GAOLi-jun, GAOYan-xia
(Dept.ofBiologicalScience, TaishanMedicalColege, Taian271016 , China)
Abstract:ObjectiveToinvestigatetheantioxidativeeffectsofpolysaccharidefromRadixAngelicaeDahurica(PAD)invitro.
MethodsHydroxylfreeradical(· OH)wasproducedbyFentonreactionandsuperoxideanionfreeradical(O2 -· )waspro-ducedbytheoxidationofpyrogalol.Theinhibitiononlipidperoxidationwasdeterminedbycolorimetryfortestingtherelative
contentofMDAinlivertissue.ResultsPADcouldscavenge· OHandO2 -· , andinhibitlipidperoxidationinlivertissue.
Theconcentrationofscavengingorinhibiting50%(EC50)· OH, O2-· andlipidperoxidationofPADwere250.9, 2541.7
and670.0mg/mlrespectively;EC50 ofvitaminCwere113.2, 45.8 and321.8mg/mlfor· OH, O2 -· andlipidperoxidationrespectively.ConclusionPADhasantioxidativeeffectsinvitro, andtheeffectsarenotsoobviousasthoseofvitaminC.
Keywords:RadixAngelicaeDahurica;　Polysaccharide;　Hydoxylfreeradical;　Superoxideanionfreeradical;　
Lipidperoxidation
　　杭白芷是常用中药白芷的品种之一 ,气芳香 , 味辛苦 ,具有散
风除湿 、通窍止痛 、消肿排脓之功效。对杭白芷的现代研究多集
中在其所含有的香豆素类和挥发油上 ,具有解热镇痛 、抗菌消炎 、
解痉平喘 、降低血压等药理作用 [ 1, 2] , 而对其中含量丰富的多糖
却研究甚少。本实验提取分离杭白芷多糖(polysaccharidefrom
RadixAngelicaeDahurica, PAD)并对其体外抗氧化活性进行了
研究。
1　器材
1.1　药材 杭白芷购自安徽亳州药材市场 , 经本院生药学教研室
周红英教授鉴定为伞形科植物杭白芷 Angelicadahurica(Fisch.
exHofm.)Benth.etHook.f.var.formosana(Boiss.)Shanet
Yuan.的干燥根 , 粉碎成粗粉备用。
1.2　试剂与仪器 维生素 C,天津市凯通化学试剂有限公司 ,批
号 060108;硫酸亚铁 ,天津市巴斯夫化工有限公司 ,批号 040814;
水杨酸 , 天津市凯通化学试剂有限公司 , 批号 061108;30%过氧
化氢(H2O2)溶液 ,天津市巴斯夫化工有限公司 ,批号 061222;Tris
碱 , 夏斯生物有限公司 ,批号 060517;邻苯三酚 , 天津市巴斯夫化
工有限公司 , 批号 050816;三氯乙酸 , 天津市永大化学试剂开发
中心 , 批号 051024;2-硫代巴比妥酸 , 国药集团化学试剂有限公
司 , 批号 041216。所用试剂均为分析纯。
752型紫外可见分光光度计 ,上海光谱仪器有限公司;LD-6
型离心机 , 上海安亨科学仪器厂;DK-8D型电热恒温水槽 ,上海
精密实验设备有限公司;DY89-1电动匀浆机 , 宁波新芝生物科
技股份有限公司。
1.3　动物 昆明种小鼠 , 雄性 , 体重 18 ～ 25 g。山东省生物制品
研究所提供 ,实验动物质量合格证:鲁动质字 20030011。
2　方法与结果
2.1　杭白芷多糖的提取与精制 参考文献方法 [ 3]称取杭白芷粗
粉 150 g,加 4倍量石油醚回流脱脂 2次 , 2 h/次;滤渣加 4倍量
80%乙醇回流提取 2次 , 2 h/次。经脱脂 、醇提后的滤渣在 60℃
烘干 , 分别加 6倍量 、5倍量 、4倍量蒸馏水在 95℃水浴中浸提 3
次 , 2h/次 , 合并滤液 , 减压浓缩至 200 ml左右。以每 100 ml浓
缩液加 20ml氯仿正丁醇(4∶1)液 ,剧烈振荡 30 min, 以 4 000 r
· min-1离心 15 min,去除下层氯仿及中层变性蛋白 ,取上部水层
再重复去蛋白操作 ,至无明显中层为止。收集去蛋白后的上部水
层 , 加无水乙醇至溶液含醇量达 80%, 静置过夜 , 以 4000 r·
min-1离心 15min,收集沉淀物 , 再依次用无水乙醇 、乙醚 、丙酮洗
涤各两次 ,得多糖粗品。再以水 -乙醇重复沉淀纯化两次 , 60℃
烘干 , 得白色粉末状 PAD提取物 9.68 g, 得率 6.45%。以葡萄糖
为对照品 ,用苯酚 -硫酸法 [ 4]测得提取物中总糖含量为 89.6%。
实验前用重蒸水溶解至所需浓度。
2.2　PAD对羟自由基的清除作用 采用 Fenton反应体系。 Fe2+
催化 H
2
O
2
产生羟自由基(· OH),加入水杨酸捕捉· OH并产生
有色物质 , 该物质在 510nm处有最大吸收 [ 5] 。 4 ml反应体系中
含 8.8 mmol· L-1H2O2溶液 1 ml, 9mmol· L-1FeSO4溶液 1 ml,
9 mmol· L-1水杨酸 -乙醇溶液 1 ml, 不同浓度的供试液 1 ml。
最后加 8.8 mmol· L-1 H2O2启动反应 , 37℃水浴反应 30 min后 ,
以蒸馏水调零点 ,在 510nm波长处测定吸光度(Ax)。模型对照
组(Ao)用重蒸水代替供试液。为消除供试液本身的吸光值 , 用
重蒸水代替 8.8 mmol· L-1H2O2溶液作为样本对照组(Axo)。
每个浓度组平行测定 5份 。测定结果以清除率(E)表示 , EC
50
表
示清除率为 50%时体系中的药物浓度。 按 E% =〔Ao-(Ax-
Axo)〕/Ao×100%进行计算;以 E为纵坐标 , 多糖或维生素 C对
数浓度为横坐标作图 ,建立回归方程 , 计算 EC50。结果见表 1。
2.3　PAD对超氧阴离子自由基的清除作用 采用邻苯三酚自氧
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LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH 2009VOL.20NO.1 时珍国医国药 2009年第 20卷第 1期
化法。邻苯三酚在弱碱性环境中自身氧化分解产生超氧阴离子
自由基(O2 -· ), 随着自发反应的进行 , O2 -· 在体系中不断积
累 , 并生成有色中间产物 , 导致反应液在 325 nm处吸光度的变
化 [ 6] 。取 0.05 mol· L-1 pH为 8.2的 Tris-HCl缓冲液 4.6 ml
于试管中 , 置 25℃水浴预热 20 min后 , 加不同浓度的供试液 1
ml, 10mmol· L-1邻苯三酚 0.4 ml, 混匀后 25℃水浴 4 min, 立即
用 8 mol· L-1 HCl0.1ml终止反应 ,以 pH8.2的 Tris-HCl缓冲
液调零点 , 并在 325 nm测定吸光度(Ax)。模型对照组(Ao)用重
蒸水 1 ml代替供试液 , 样本对照组(Axo)用重蒸水 0.4 ml代替
10 mmol· L-1邻苯三酚。每个浓度组平行测定 5份。 清除率 E
和 EC50的计算方法同上。结果见表 2。
表 1　PAD对· OH的清除作用 ( x±s)
供试品 体系浓度C/mg· ml-1
E
(%)
EC
50
C/mg· ml-1
维生素 C 19.5 4.37±2.10 E=66.360 3　lgC-86.300 4
39.1 16.12±3.69 r=0.988 4
78.1 32.54±5.24 EC50=113.2
156.3 62.25±6.02
312.5 81.23±5.83
PAD 39.1 9.86±2.32 E=57.321 8lgC-87.548 5
78.1 18.16±4.43 r=0.978 1
156.3 29.96±5.06 EC50=250.9
312.5 55.67±6.27
625.0 77.36±7.52
　　n=5
表 2　PAD对 O2 -·的清除作用 ( x±s)
供试品 体系浓度C/mg· ml-1
E
(%)
EC
50
C/mg· ml-1
维生素 C 13.0 14.25±5.56 E=64.056 0lgC-56.387 7
26.0 37.37±8.61 r=0.995 4
52.1 52.27±10.36 EC50=45.8
104.2 69.01±9.59
208.3 94.92±3.14
PAD 52.1 14.21±3.36 E=22.632 5lgC-27.066 4
104.2 18.31±4.22 r=0.964 8
208.3 22.26±3.38 EC50=2 541.7
416.7 29.73±5.21
833.3 42.56±7.75
　　n=5
2.4　PAD对肝匀浆脂质过氧化的影响 昆明种小鼠断颈处死 ,
迅速取肝脏 , 置冰冷生理盐水中洗净表面残血 , 去除胆囊 ,用滤纸
吸干水分 , 称重。以 4℃生理盐水在冰浴条件下制成 10%小鼠肝
组织匀浆 , 4℃ 4 000 r· min-1 ,离心 15min,取上清液供实验用。
取 10%肝匀浆 1.0 ml于试管中 , 加入不同浓度供试液 1.0
ml混匀 ,于 37℃水浴温孵 1.5 h后 , 加入 10%三氯乙酸 2 ml,
0.67%硫代巴比妥酸 2 ml混匀 ,沸水浴中反应 15min后取出 ,流
水冷却 , 4 000r· min-1离心 15 min, 取上清液 , 以生理盐水调零
点 , 并在 532 nm处测定吸光度(Ax)[ 7] 。模型对照组(Ao)用生
理盐水 1 ml代替供试液 ,样本对照组(Axo)用生理盐水 1 ml代
替 10%肝匀浆。每个浓度组平行测定 5份。测定结果以脂质过
氧化抑制率(E)表示 , E和 EC50的计算方法同上。结果见表 3。
3　讨论
氧自由基的产生与机体许多功能障碍和疾病的发生有密切
关系 , 尤其心脑血管疾病 、糖尿病 、中枢神经系统慢性退行性疾病
等。所以 , 抗自由基的药物研究近年来备受人们重视。机体在代
谢过程中产生的氧自由基在某些病理条件下因代谢产物过量 , 对
机体生物大分子如核酸 、蛋白质 、脂质等造成氧化性损伤。其中
O2 -·产生最早 , · OH对细胞的危害最大 ,可直接作用于生物膜
上的不饱和脂肪酸 , 使其发生脂质过氧化反应 , 损伤生物膜。 丙
二醛(MDA)是脂质过氧化反应的终产物之一 , 氧化损伤可引起
MDA生成增加 , 肝脏是反映脂质过氧化较为敏感的器官 , 所以肝
脏中 MDA的含量间接反映细胞脂质过氧化程度 [ 6] 。在本实验
中 , PAD显著抑制小鼠肝匀浆 MDA的产生 , 提示 PAD能有效抑
制脂质过氧化反应。
表 3　PAD对脂质过氧化的抑制作用 ( x±s)
供试品 体系浓度C/mg· ml-1
E
(%)
EC50
C/mg· ml-1
维生素C 78.1 6.73±2.35 E=78.349 7lgC-146.466 8
156.3 24.12±4.33 r=0.978 1
312.5 36.78±3.49 EC50=321.8
625.0 81.33±6.14
1 250.0 96.06±3.75
PAD 156.3 23.15±6.62 E=35.706 7lgC-50.910 7
312.5 42.23±4.58 r=0.974 5
625.0 49.76±5.73 EC50=670.0
1 250.0 62.93±7.03
2 500.0 66.54±6.77
　　n=5
本实验结果显示 , PAD体外可清除 Fenton反应体系产生的
· OH和邻苯三酚自氧化法产生的 O
2
-· , 并可抑制小鼠肝匀浆
脂质过氧化反应 ,显示出较好的抗氧化活性 ,并呈一定的量效关
系。由 EC
50
可知 , PAD清除· OH的作用大约是清除 O
2
-·的 10
倍 , 但· OH和 O
2
-·清除作用以及脂质过氧化抑制作用均较维
生素 C弱 。PAD清除氧自由基的机制可能与多糖链结构及其羟
基有关 ,抗脂质过氧化可能与其清除自由基效应有关。有资料表
明 , 白芷多糖主要由鼠李糖 、阿拉伯糖 、木糖 、甘露糖 、葡萄糖和半
乳糖等单糖通过糖苷键联结而成 [ 8] 。本实验在多糖提取分离过
程中尽管包括去除杂蛋白 、单糖 、寡糖及其他小分子物质等步骤 ,
但所得 PAD仍是一类高分子多糖的混合物 , 所以 PAD的分级纯
化以及各种组分理化性质和生物学活性的差异还有待于进一步
研究。
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