全 文 ：收稿　2002-09-23　　　　修定　2003-05-12
资助　福建省自然科学基金项目(B0210007)。
　＊　E-mai l:sliu9985@sina.com , Tel:0591-3465486
狗脊蕨凝集素的分离纯化与部分性质
刘艳如1 , ＊　余　萍2 　郑　怡1(福建师范大学1 生物工程学院 , 2高分子研究所 , 福州 350007)
Purification and Characterization of Woodwardia jatonica Lectin
LIU Yan-Ru1 , ＊, YU Ping2 , ZHENG Yi1(1College of Bioengineering , 2 Institute of Polymer Science , Fujian Teachers Universi-
ty , Fuzhou 350007)
提要　狗脊蕨叶组织经磷酸缓冲液抽提 , 硫酸铵分级沉淀 , DEAE-Sepharose(fast flow)离子交换层析和 Sephadex G-100 分子
筛层析 ,获得具有凝集活性的狗脊蕨凝集素。用 PAGE 和 SDS-PAGE 检测均显示 1 条蛋白带 , 提示狗脊蕨凝集素分子只有
一个亚基。 Sephadex G-100 层析和 SDS-PAGE 测得其相对分子质量在 20 kD左右。该凝集素对红细胞有种属专一性 ,其凝
集活性可被木糖 、卵粘蛋白所抑制。狗脊蕨凝集素对热相当稳定 ,以 100℃温度加热 10 min 仍保存部分凝集活性。凝集活
性不依赖于金属离子 Mg2+、Ca2+、Mn2+。它的中性糖含量为 3.1%, Phe含量较高 , His含量较低 , 不含 Tyr 和 Pro。
关键词　狗脊蕨　凝集素　分离纯化
　　凝集素是一类与糖基结合的 、非免疫原的蛋白
质或糖蛋白[ 1] 。它能选择性地与细胞表面的糖链
结合而导致细胞凝聚 。由于凝集素具有与糖结合
的专一性 、促进细胞有丝分裂 、凝集恶变细胞 、细胞
毒作用等生物学活性及防御病原体入侵等生理功
能[ 1] ,因此 ,在生物化学 、免疫学 、组织化学 、临床
诊断与治疗中得到广泛的应用 。
蕨类植物有许多药用价值及抗菌 、抗病毒等生
理活性物质[ 2] ,但有关其血凝活性组分的研究报
道较少。本文以狗脊蕨植物为材料 ,从中分离提纯
了具有血凝活性的狗脊蕨凝集素(Woodwardia ja-
tonica Lectin , WJL),并对它的部分性质进行了研
究。
材料与方法
1　材料
　　狗脊蕨(Woodwardia jatonica)叶子采自福州
鼓山 。人的 A 、B 、O 型血由福建师范大学医院提
供 ,兔血采自新西兰大白兔 ,其它供试动物血从相
应的动物体取得 。活性炭(26 ～ 35目)为气相色谱
级 ,为上海试剂公司产品;DEAE-Sepharose(fast
flow)、Sehpadex G-100为 Pharmacia产品;N-乙酰
葡萄糖胺(G LCNAC)、岩藻糖(L-Fuc)、十二烷基磺
酸钠(SDS)及牛血清白蛋白(BSA)为 Fluka-
Garantie产品;SDS-PAGE 蛋白标准品及其他糖类
为国产试剂;其余试剂均为分析纯 。
2　方法
2.1　狗脊蕨凝集素的提取纯化　取新鲜成熟期无
孢子囊的狗脊蕨营养叶(去掉大叶脉)100 g 用蒸
馏水洗净 、凉干并剪碎后 ,按 1∶3(W/ V)加 pH 7.2 、
0.05 mol·L -1磷酸缓冲液(含 0.14 mol·L-1 NaCl ,
称 PBS)于 4℃冰箱浸泡过夜 ,经高速组织捣碎机
捣成匀浆 ,纱布过滤;滤液于 4℃下 、以2 688×g 离
心 25 min ,取上清液加固体(NH4)2SO4 达 20%饱
和度 ,置 4℃冰箱中过夜后 ,离心(同前),取上清液
加固体(NH4)2SO4 达 75%饱和度 ,离心(同前);收
集沉淀溶于 PBS 溶液 ,并对同一缓冲液透析至透
析液测不出 SO2-4 ,得到凝集素粗品 ,将此粗品液风
干浓缩至 20 mL(蛋白含量 940 μg·mL-1)。
取上述粗制品浓缩液 8 mL 过活性炭柱(1.5
cm×10 cm),用 2倍于柱体积的 PBS 液洗脱 ,流速
为 5 mL·min-1 。收集洗脱液 ,浓缩至 6 mL(蛋白
含量 908μg·mL-1)后加到 DEAE-Sepharose (fast
flow)层析柱(1.6 cm ×20 cm)上 ,以 PBS 洗脱 ,分
部收集 ,流速 40 mL·h-1 ,4 mL·管-1;当流出液在
280 nm 处吸收值低于 0.02 后 ,改用含 0.5 mol·
L-1 NaCl的 PBS进行线性离子梯度洗脱 ,分部收
集同前 ,经 280 nm 紫外和血凝活性检测 ,收集有
血凝活性的洗脱峰;蒸馏水透析除盐 , PBS 液平衡
透析后风干浓缩至 8 mL(蛋白含量 425 μg ·
mL -1),即为离子交换层析后的样品 。
取上述样品 6 mL 加到 Sephadex G-100柱(1.
2 cm×56 cm)上 ,以 PBS 洗脱 ,分部收集 ,流速 24
mL·h-1 ,收集液为 4 mL·管-1 。经紫外和血凝活
性检测后 ,收集活性峰 ,蒸馏水透析除盐后风干浓
缩至 9.4 mL(蛋白含量 160 μg·mL-1),即为纯化
的狗脊蕨凝集素样品。
647植物生理学通讯　第 39 卷 第 6 期 , 2003 年 12 月
DOI :10.13592/j.cnki.ppj.2003.06.040
2.2　红细胞的采集与处理　人的 A 、B 、O 型血及
兔 、鸡 、鸭 、鸽均为静脉采血 ,小白鼠从眼眶取血 ,泥
鳅 、龟 、鲫鱼均为头部取血 。用阿氏液作抗凝剂 ,经
离心除去血浆后 ,用 0.14 mol·L-1 NaCl溶液离心
洗涤 3次(300×g , 10 min),最后用相应溶液配成
2%的红细胞悬液。
2.3　蛋白含量测定　采用 CBB-G250法[ 3] ,以牛
血清白蛋白为标准。
2.4　纯度检测　取纯化的样品 100 μL(160 μg·
mL-1蛋白)进行不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳[ 4] 。
用pH 8.9 T ris-HCl为电泳缓冲液 ,分离胶浓度为
7.5%,电压为 100 ～ 160 V ,电泳 3.5 h 。用考马斯
亮兰 R250染色 ,7%乙酸脱色后保存 。
2.5 　分子量和亚基分子量测定 　在 Sephadex
G-100分子筛层析柱(1.2 cm×56 cm)上测定狗脊
蕨凝集素的分子量[ 5] ,以牛血清白蛋白 、鸡卵清蛋
白 、核糖核酸酶 、碳酸酐酶为标准蛋白 。将 1 mL
标准蛋白混合液(各 2 mg·mL-1)上柱 ,用 0.025
mol·L -1 KCl-0.2 mol·L-1HAc 溶液洗脱 ,分部收
集 ,流速 24 mL·h-1 ,收集液为 4 mL·管-1 。检测
每管 A280值 ,作出洗脱曲线后 ,以标准蛋白分子量
的对数对有效分配系数(K av)作出标准曲线。纯
化的样品 4 mL(160 μg·mL-1蛋白)按照标准曲线
的条件操作 ,计算狗脊蕨凝集素的分子量。
亚基分子量采用 SDS-PAGE 法测定[ 6] 。用
pH 8.9的 Tris-HCl为电泳缓冲液 ,分离胶浓度为
13%,电压为 100 ～ 160 V ,电泳 2.5 h 。用兔磷酸
化酶 B 、牛血清白蛋白 、兔肌动蛋白 、牛碳酸酐酶 、
胰蛋白酶抑制剂 、鸡蛋清溶菌酶作标准蛋白 ,标准
蛋白混合液(各 0.1 μg·μL-1)20 μL 上样 ,纯化的
样品上样量为 100 μL(160 μg·mL-1蛋白)。以分
子量的对数对相对迁移率(R f)作图 ,计算狗脊蕨
凝集素的亚基分子量 。
2.6　糖含量测定　用酚-硫酸法[ 7] ,以葡萄糖为标
准样品。
2.7　血凝活性测定　在“V”型血凝板上用 25 μL
凝集素纯化样品(160 μg·mL -1蛋白)与等量的
0.14 mol·L-1 NaCl进行倍比稀释后 ,加入 25 μL
动物红细胞悬液 ,振摇 10 min ,室温放置 2 h ,以显
微镜检查凝集结果。血凝活力以兔红细胞产生凝
集现象时的最小凝集素浓度的倒数 ,即每 mg 蛋白
所含有的活力单位 U 表示 。
2.8　糖抑制实验　凝集素按血凝活性测定法倍比
稀释后 ,于每孔中加入 25 μL 80 mmol·L-1的糖溶
液或 1.5%糖蛋白溶液(用生理盐水配制),振摇 10
min后 ,再加入 25 μL 兔红细胞悬液 ,振摇 、放置 ,
镜检同前 。空白对照为:样品+生理盐水+兔红细
胞悬液。
2.9　热稳定性实验　将浓度为 160μg·mL-1的凝
集素纯品分装于小指管中 , 在恒温水浴里 40 ～
100℃温度范围内 ,每隔 10℃作为一个样品。保温
处理 10 min 之后 ,立即用流水冷却至室温 ,按 2.7
节方法测其凝集活性 ,并与室温(25℃)下的对照样
品作比较 。
2.10　二价金属阳离子对凝集活性的影响　凝集
素纯化样品(160μg·mL-1蛋白)对 EDTANa2溶液
(20 mmol·L-1)充分透析后 ,再对生理盐水透析以
除去过量的EDTANa2 , 取 25μL 10 mmol·L-1 Ca-
Cl2 、MnCl2 或 MgCl2 在“V”型血凝板上倍比稀释
(用生理盐水作稀释液)后 , 向每孔加入 25 μL 经
EDTANa2 处理的凝集素 。振荡后分别加入 25 μL
兔红细胞 ,于 25℃下放置 2 h 后 ,镜检凝集结果 。
设 2个对照组:(1)以未经处理的凝集素代替经处
理的凝集素;(2)加经过处理的凝集素。2 个对照
组都不加金属离子 。
2.11　氨基酸组成分析　纯化的凝集素在含巯基
乙醇的恒沸点盐酸中 105℃水解 24 h ,然后以日立
835-50型氨基酸自动分析仪测定。
实验结果
1　狗脊蕨凝集素的纯化
　　硫酸铵分级沉淀所得的狗脊蕨凝集素粗品 ,经
活性碳柱后 ,上DEAE-Sepharose(fast flow)柱进行
离子交换层析 , PBS 洗脱去除杂蛋白 ,经梯度洗脱
后出现 4个蛋白峰 ,结果见图 1。其中第 1峰有强
凝血活性;第 2 、3 、4 峰只有弱凝集活性 ,其量也少
于第1峰 ,故收集第1峰样品 。该样品经蒸馏水透
图 1　WJL 在 DEAE-Sepharose(fast flow)柱上的线性
离子梯度洗脱曲线
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析 ,风干浓缩至适当浓度后 ,再经 Sephadex G-100
分子筛层析 ,得到 2个洗脱峰(图 2)。其中仅第 1
峰有凝集活性 ,即纯化的狗脊蕨凝集素;第 2 峰无
凝集活性。纯化的样品经 PAGE得到 1条蛋白带
(图 3A)。纯化流程见表 1。
图 2　WJL在 Sephadex G-100 柱上的洗脱曲线
图 3　WJL 的电泳图谱
　　A:PAGE , a.纯化的样品 , b.粗品;B:SDS-PAGE , c.标准蛋白
(兔磷酸化酶 97 kD ,牛血清白蛋白 67 kD ,兔肌动蛋白 43 kD ,牛碳
酸酐酶 31 kD ,胰蛋白酶抑制剂 20 kD ,鸡蛋清溶菌酶 14.4 kD), d.
纯化的样品。
表 1　WJL 的纯化过程
纯化步骤 总蛋白质含量/mg
比活力/
U·mg -1
总活力/
U
纯化倍数
PBS浸提 565.8 2.2 1244.8 1.0
75%(NH4)2SO4 盐析 18.8 42.7 802.8 19.4
DEAE-Sepharose(fast flow)
层析 3.4 226.2 769.0 102.8
Sephadex G-100层析 1.5 400.0 600.0 181.8
2　狗脊蕨凝集素的分子量和亚基分子量
　　Sephadex G-100 凝胶过滤法测定得到狗脊蕨
凝集素的表观分子量为 20 kD(图 4)。在 SDS-
PAGE图谱(图 3B)中 ,纯化样品显示 1条染色带 ,
表明该凝集素分子只有一种亚基。通过 R f 计算
亚基分子量为 20.9 kD。这与用分子筛层析法测
得的结果基本一致 。
图 4　Sephadex G-100 凝胶过滤法测定WJL 的分子量
　　1.核糖核酸酶(14 kD);2.碳酸酐酶(30 kD);3.鸡卵清蛋白
(45 kD);4.牛血清白蛋白(67 kD)。
3　血凝作用
　　表 2表明 ,纯化的凝集素对人的 A 、B 、O 型血
细胞的凝集活性相差不大 ,而对其他种属来源的红
细胞的凝集活性有较大的差别 ,其中对鲫鱼红细胞
的凝集活性最大 ,对龟红细胞不发生凝集反应。说
明该凝集素对动物红细胞的凝集作用有种属专一
性。
表 2　狗脊蕨凝集素的血凝活性
红细胞来源 凝集素浓度/μg·mL
-1
160 80 40 20 10 5 2.5 1.25 0.6 0.3
泥鳅 + + + + + - - - - -
龟 - - - - - - - - - -
鲫鱼 + + + + + + + + + +
鸽 + + + + + - - - - -
鸡 + + + + + + + - - -
鸭 + + + + + + + - - -
小白鼠 + + + + + + + + - -
兔 + + + + + + + - - -
人 A型血 + + + + - - - - - -
人 B型血 + + + + + - - - - -
人 O型血 + + + + + - - - - -
　　+:凝集 , -:不凝集。表 3～ 5同此。
4　糖含量
　　按硫酸-酚法测得狗脊蕨凝集素的中性糖含量
为 5μg·mL-1(蛋白含量为 160 μg·mL-1),中性糖
占蛋白总量 3.1%。
5　糖和糖蛋白对狗脊蕨凝集素凝集活性的抑制作用
　　表 3表明 ,木糖对狗脊蕨凝集素的血凝反应的
抑制作用最强 ,山梨糖 、果糖次之 ,α-甲基-D-葡萄
糖苷和 N-乙酰-葡萄糖胺较弱。糖蛋白中的卵粘
蛋白具有较强的抑制作用。
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表 3　糖和糖蛋白对狗脊蕨凝集素凝集活性的抑制作用
糖/糖蛋白
(80 mmol·L -1)
凝集素浓度/μg·mL -1
160 80 40 20 10 5 2.5
对照 + + + + + + +
半乳糖(Gal) + + + + + + +
木糖(Xyl) + + + - - - -
阿拉伯糖(Ara) + + + + + + +
甘露糖(M an) + + + + + + +
山梨糖(S or) + + + + + - -
萄葡糖(Glc) + + + + + + +
果糖(Fru) + + + + + - -
岩藻糖(Fuc) + + + + + + +
麦芽糖(M al) + + + + + + +
α-甲基-甘露糖 + + + + + + +
α-甲基-D-葡萄糖苷 + + + + + + -
N-乙酰-葡萄糖胺 + + + + + + -
卵粘蛋白 + + + - - - -
猪甲状腺蛋白 + + + + + + +
猪胃粘蛋白 + + + + + + +
6　热稳定性
　　表 4表明 ,狗脊蕨凝集素的凝集活性在 90℃
以下稳定 ,温度升高到 100℃仍有部分凝集活性 ,
说明WJL是一种对热相当稳定的凝集素 。
表 4　温度对狗脊蕨凝集素凝集活性的影响
温度/ ℃ 凝集素浓度/μg·mL
-1
160 80 40 20 10 5 2.5
对照(25℃) + + + + + + +
40 + + + + + + +
50 + + + + + + +
60 + + + + + + +
70 + + + + + + -
80 + + + + + - -
90 + + + + + - -
100 + + + - - - -
表 5　金属离子对狗脊蕨凝集素凝集活性的影响
二价
金属离子
金属离子浓度/mmol·L -1
10 5 2.5 1.25 0.625 0.315 0.156
对照 1 + + + + + + +
对照 2 - - - - - - -
Ca2+ - - - - - - -
Mg2+ - - - - - - -
M n2+ - - - - - - -
　　对照 1:凝集素未经处理 ,对照 2:凝集素经过处理。
7　二价金属离子对凝集活性的影响
　　从表 5可以看出 ,该凝集素凝集兔红细胞的活
性不依赖于金属离子 Ca2+ 、Mg2+和 Mn2+。
8　氨基酸含量
　　从表 6可见 ,狗脊蕨凝集素中 Phe 含量最高 ,
His含量最低 ,不含 Ty r 和 Pro;碱性氨基酸(Lys 、
His和 Arg)含量高于酸性氨基酸(Asp和 Glu)。
表 6　狗脊蕨凝集素中的氨基酸含量
氨基酸 含量/μg·mL -1 氨基酸 含量/μg·mL -1
Asp 13.31 Ile 12.45
Thr 8.01 Leu 10.26
Ser 7.12 Tyr 0
Glu 12.59 Phe 45.81
Gly 7.32 Lys 35.63
Ala 6.57 His 4.22
Cys 26.06 Arg 36.38
Val 13.36 Pro 0
Met 30.12
讨　　论
　　细胞凝集作用是凝集素与细胞表面的糖分子
结合 ,在细胞表面形成许多相互交叉的“桥”的结
果。狗脊蕨凝集素对鲫鱼红细胞有很强的凝集活
性而不凝集龟红细胞。这可能与不同的细胞及细
胞表面的某些性质有关 ,如细胞表面的刚性 、细胞
表面携带的电荷 、凝集素受体在细胞膜上的分布和
流动性等[ 1] 。
凝集素与糖专一地结合是它最基本的特性 ,而
凝集素也常以它结合的糖类型进行分类。根据狗
脊蕨凝集素对木糖的专一性 ,可以将狗脊蕨凝集素
归入木糖凝集素类 。
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