全 文 ：第 28卷第 2期
2010年 6月
湖北民族学院学报(自然科学版)
JournalofHubeiUniversityforNationalities(NaturalScienceEdition)
Vol.28　No.2
Jun.2010
收稿日期:2010-04-30.
基金项目:湖北省自然科学基金计划创新群体项目(2009);湖北省教育厅高校产学研合作资助项目(CXY2009B037).
作者简介:江巍(1987-),男 ,硕士研究生 ,主要从事新型肿瘤导向治疗的研究;＊通讯作者:郑小江(1958-),男 ,教授 ,主要从事野生植物资
源的保护与利用的研究.
海金沙总黄酮提取工艺研究
江　巍1, 2, 3 ,郑小江 1, 2＊
(1.生物资源保护与利用湖北省重点实验室 ,湖北 恩施 445000;
2.湖北民族学院 生物科学与技术学院 ,湖北 恩施 445000;
3.华东师范大学 生命医学研究所 ,上海 200062)
摘要:采用乙醇回流提取法 , 以海金沙总黄酮特征吸光度值为指标 , 通过单因素试验和正交试验 , 对海金沙总
黄酮提取工艺条件进行了研究 , 研究结果表明 , 用乙醇回流提取法提取海金沙总黄酮的最佳工艺条件为:以 60%乙
醇做提取剂 , 料液比(g/ml)为 1∶40, 75℃水浴 75min条件下提取 2次 , 海金沙总黄酮得率为 2.91%;此法简便易
行 , 成本低 ,是工业化提取海金沙总黄酮的有效工艺之一.
关键词:海金沙;总黄酮;提取工艺;单因素试验;正交试验
中图分类号:O629 文献标识码:A 文章编号:1008-8423(2010)02-0222-04
StudyonExtractionofTotalFlavonefromLygodium
JIANGWei1, 2, 3 , ZHENGXiao-jiang1, 2＊
(1.TheKeyLaboratoryofHubeiProvinceforBiologicalResourcesProtectionand
Utilization, HubeiUniversityforNationalities, Enshi445000, China;
2.SchoolofBiologicalScienceandTechnology, HubeiUniversityforNationalities, Enshi445000, China;
3.InstituteofBiomedicalSciences, EastChinaNormalUniversity, Shanghai200062, China)
Abstract:ThispaperresearchesLygodiumtotalflavoneextractionconditionsinanindexoftotalflavone
characteristicabsorbancevaluewithethanolextractionmethod, throughthesinglefactorandorthogonal
tests.Theresultsshowedthattheoptimumextractionconditionswere:60%ethanolasextractionsolvent,
liquidratio(g/ml)1∶40, 75℃ waterbathfor75mintwice.Undertheconditionsofextraction, theextrac-
tionrateoftotalflavonefromLygodiumcanreach2.91%.Thismethodissimpleandlow-cost, anditis
oneoftheefectiveprocessestotheindustrialextractionofLygodiumtotalflavone.
Keywords:Lygodium;totalflavone;extractionprocess;singlefactortest;orthogonal
海金沙 [ Lygodiumjaponicum(Thunb).Sw.]为蕨类植物门(Pteridophyta)、薄囊蕨纲(Letosporangiatidae)、
直蕨目(Eufilicales)、海金沙科(Lygodiaceae)、海金沙属(LygodiumSw)多年生草质藤本植物 [ 1] .广布于我国
暖温带及亚热带 ,北至陕西及河南南部 ,西达四川 、云南和贵州 ,朝鲜 ,越南 ,日本 ,澳大利亚也有;生路边或山
坡疏灌丛中 ,在海拔达 1000m高处亦可找到 [ 2] .海金沙科仅有海金沙属 ,全世界共有 45种 ,我国有 10种 ,其
中 5种供药用.据李时珍本草纲目记载 ,本种 “甘寒无毒 ,通利小肠 ,疗伤寒热狂 ,解热毒气 ,治湿热肿毒 、小
便热淋膏淋石淋及经痛”;其孢子为利尿药 ,并作医药上的撒布剂及药丸包衣;茎叶捣烂加水浸泡 ,可作为植
物源农药 ,防治棉蚜虫 、红蜘蛛 [ 1, 2] .
现代医学表明 ,海金沙富含黄酮类化合物 、二萜类化合物(赤霉素)、三萜类化合物 、有机酸类化合物(香
第 2期 江　巍等:海金沙总黄酮提取工艺研究
豆酸 、咖啡酸等)及脂肪族类成分(挥发油)等多种化学成分 ,使得其具有抗菌 、抗病毒 、抗雄性激素和促生
发 、利胆溶石 、利尿 、保肝及植物激素等生理活性 ,其中黄酮类化合物的抗肿瘤等药用价值正日益成为研究的
焦点[ 3] .目前对黄酮类化合物的提取 、分离和含量测定方法较多[ 4] ,而有关海金沙总黄酮提取方法的报道较
少 ,如:贲永光等 [ 5]和余希成等[ 6]分别利用双频超声强化提取和超临界 CO2萃取等方法对海金沙总黄酮的
提取工艺进行了研究 ,但这些方法所需设备要求高 ,耗时长 ,方法复杂 ,成本较高.本文从规模化生产 、医学 、
食品及安全性等方面综合考虑 ,采用传统的乙醇热回流提取法 ,对海金沙中总黄酮最佳提取工艺进行了研
究 ,旨在为海金沙总黄酮工厂化生产及开发利用提供依据.
表 1　芦丁标准曲线测量数据
Tab.1　Rutinstandardcurvedata
0 1 2 3 4 5
芦丁标准液 /ml 0 1.000 0 2.000 0 3.000 0 4.0000 5.000 0
标准芦丁量 /mg 0 0.100 0 0.200 0 0.300 0 0.4000 0.500 0
吸光度 A 0 0.130 0 0.253 2 0.361 0 0.4813 0.5817
1　材料与方法
1.1　材料与设备
材料:海金沙全草(地上茎叶).采自湖北省恩施市金子坝 ,洗净后自然晾干 ,将茎叶分开 , 70℃烘干 ,粉
碎后过 60目筛置于干燥箱中备用.主要试剂:芦丁标准品(含结晶水), 95%乙醇(分析纯), 5%NaNO2 , 10%
A1(NO3)3 , 1mol/LNaOH等.设备:TU-1810型 UV-VIS分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)、
HH-4刑数显恒温水浴锅(金坛市晓阳电子仪器厂)、冷凝回流装置 、AnkeLXJ-B低速大容量多管离心机
(上海安亭科学仪器厂)、DFY-500摇摆式高速中药粉碎机(温岭市林大机械有限公司)、BT224电子天平
(北京赛多利斯仪器系统有限公司)等.
1.2　方法
1.2.1　工艺流程　海金沙叶※干燥※粉碎※溶剂回流提取※固液分离※提取液※总黄酮含量测定
1.2.2　标准曲线制作 　标准液制备:准确称取芦丁标准品 5.0mg(含结晶水),用 30%微热乙醇溶解 ,并完
全移入 50mL容量瓶中 ,用 30%乙醇定容摇匀得浓度为 0.1mg/ml的标准应用液.
标准曲线制作:准确吸取标准应用液 0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml于 6只具塞试管中 ,加 30%乙醇使成 5
ml,加 5% NaNO2溶液 0.3ml,摇匀 ,放置 6min.加 10%A1(NO3)3溶液 0.3ml,摇匀后放置 6min.加 1mol/L
NaOH溶液 4ml,加 30%乙醇 0.4ml,摇匀 ,放置 10 ～ 15min,试剂为空白参比 ,于 510nm波长处测定吸光度.
1.2.3　总黄酮含量测定　采用亚硝酸钠 -硝酸铝 -氢氧化钠比色法[ 7]测定总黄酮含量.精确吸取 3份 5ml
样液于 3支具塞试管中 ,各加 5%NaNO2溶液 0.3ml,摇匀 ,放置 6min.加 10%A1(NO3)3溶液 0.3ml,摇匀 ,
放置 6min.加 1mol/LNaOH溶液 4ml,加对应浓度乙醇 0.4ml,摇匀 ,放置 10 ～ 15min.同时作试剂空白 ,以试
剂空白作对照 ,于 510nm波长处测定吸收度 ,求出 3组平均值 ,查标准曲线 ,计算出样液中总黄酮含量.
总黄酮得率(%)=X×(V/V1)×100 /(W ×1000)
其中 X为根据标曲求得的总黄酮含量(g);V为样液总体积(ml);V1为测定时的取样体积(ml);W为样品重
量(g).
1.2.4　单因素试验　分别以不同的乙醇浓度(10%、30%、50%、70%、90%)、料液比(1∶10、1∶20、1∶30、
1∶40、1∶50)、提取温度(室温 、35℃、50℃、65℃、80℃)、提取时间(30min、45min、60min、75min、90min)及
提取次数(1、2、3次)作为单因素 ,考察各单因素对海金沙总黄酮得率的影响.
1.2.5　正交试验　在单因素试验基础上 ,确定正交设计的各变量 ,以总黄酮得率为考察指标 ,通过正交分析
对提取条件进行优化.
1.2.6　验证性试验　分别吸取海金沙提取液 5ml于 3个 25ml容量瓶中 ,按 1.2.3中操作处理 ,放置 10 ～
15min后 ,于波长 510nm处比色测定 ,用水作参比溶液 ,平行测定 3次.
2　结果与分析
2.1　芦丁标准工作曲线
根据表 1测量数据得出吸光值 A与芦丁浓度
x(mg/ml)的标准曲线回归方程为:
A=1.1629x+0.0105, R=0.9992,
以此方程绘制标准曲线 ,见图 1.
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湖北民族学院学报(自然科学版) 第 28卷
2.2　单因素试验结果
2.2.1　乙醇浓度对海金沙总黄酮得率的影响　如图 2所示 ,由于黄酮在乙醇中的溶解性不同 ,乙醇浓度为
10% ～ 50%时 ,海金沙总黄酮得率随乙醇浓度的升高而增大 ,当乙醇浓度为 50%时总黄酮得率最高 ,之后 ,
随着乙醇浓度升高 ,总黄酮得率降低.故选择 50%乙醇作为提取剂为宜.
2.2.2　料液比　以 50%乙醇为溶剂考查不同料液比对海金沙总黄酮得率的影响 ,结果如图 3所示 ,随着料
液比的增大 ,海金沙总黄酮得率变大 ,但从 1∶40之后增加缓慢 ,效果不明显 ,且随料液比的增大叶绿素干扰
影响变大[ 8] ,故选择料液比为 1∶40为宜.
2.2.3　提取温度对海金沙总黄酮得率的影响 以 50%乙醇为溶剂 , 1∶40料液比作为条件考查不同温度对
海金沙总黄酮得率的影响 ,如图 4所示 ,随温度升高 ,总黄酮得率随之升高 ,但超过 65℃后效果不明显甚至
有所减小 ,故选择 65℃作为提取温度为宜.
2.2.4　提取时间对海金沙总黄酮得率的影响 以 50%乙醇为溶剂 , 1∶40料液比 , 65℃水浴提取作为条件考
查不同提取时间对海金沙总黄酮得率的影响 ,如图 5所示 ,在初始 75min内 ,随着提取时间的延长 ,黄酮浸出
率逐渐提高 ,随后 ,延长时间对海金沙总黄酮得率影响变小 ,差异不显著 ,为节约时间和成本 ,故选择以 75
min作为提取时间为宜.
2.2.5　提取次数对海金沙总黄酮得率的影响　以 50%乙醇为溶剂 , 1∶40料液比 , 65℃水浴提取 75min作
为条件考查不同提取次数对海金沙总黄酮得率的影响 ,如图 6所示 ,以 3次提取总量合为 100%提取率 ,前 2
次的黄酮的提取率占总提取黄酮的 97.04%(其中第一次占 86.78%),考虑到节约成本等因素 ,在优化其他
因素之后 ,选择提取 2次为宜 ,既减少后期浓缩的困难 ,又节省能耗.
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第 2期 江　巍等:海金沙总黄酮提取工艺研究
表 7　正交试验设计因素
Tab.7　Orthogonaldesignfactors
项目 A乙醇浓度 /% B料液比/(g/(ml)-1 C温度 /℃ D时间 /min
1 40 1∶40 55 65
2 50 1∶50 65 75
3 60 1∶60 75 85
表 9　正交试验方差分析
Tab.9　Varianceanalysisoforthogonalexperiment
因素 偏差平方和 自由度 F比 显著性
乙醇浓度 0.382 2 0.985
料液比 0.173 2 0.446
温度 0.814 2 2.099 ＊
时间 0.182 2 0.469
误差 1.55 8
　　注:＊表明有显著性差异
表 10　验证性实验结果
Tab.10　Confirmatoryexperimentalresults
编号 乙醇浓度 /%料液比 /g·(ml)-1温度/℃ 时间/min吸光值/A 总黄酮得率(X)/%
1 60 1∶40 75 75 0.160 2.571
2 60 1∶40 75 75 0.163 2.623
3 60 1∶40 75 75 0.162 2.606
2.4　正交试验
在单因素实验结果基础上 ,选用 L9(34)正交设计 ,见表 7,以
总黄酮得率为考察指标 ,以影响得率的因素乙醇浓度(A)、料液比
(B)、温度(C)、时间(D)为试验因素 ,按照标准曲线的测定方法测
定提取液的吸光度 ,并以线性回归方程计算总黄酮得率以确定海
金沙总黄酮提取的最佳工艺条件.
表 8　L9(34)正交试验结果与分析Tab.8　L9(34)orthogonalexperhnentresultandanalysis
编号 因素A B C D
吸光值/A 总黄酮得率 /% 编号
因素
A B C D
吸光值/A 总黄酮得率 /%
1 1 1 1 1 0.109 1.694 2 1 2 2 2 0.120 1.883
3 1 3 3 3 0.147 2.348 4 2 1 2 3 0.142 2.262
5 2 2 3 1 0.155 2.485 6 2 3 1 2 0.146 2.330
7 3 1 3 2 0.162 2.606 8 3 2 1 3 0.084 1.264
9 3 3 2 1 0.114 1.780 k1 5.925 6.561 5.289 5.958
k2 7.078 5.631 5.925 6.820 k3 5.649 6.456 7.440 5.874
k1 1.975 2.187 1.763 1.986 k2 2.359 1.877 1.975 2.273
k3 1.883 2.153 2.480 1.958 R 0.476 0.310 0.717 0.315
　　正交试验及方差分析结果分别见表 8、表 9,在影响乙醇回流
提取总黄酮工艺的 4个因素(乙醇浓度 、料液比 、提取温度 、提取
时间)中 ,提取温度对总黄酮的得率影响最大 ,料液比的影响则
最小.影响海金沙总黄酮得率的大小次序先后为:C>A>D>B,
即提取温度 >乙醇浓度 >提取时间 >料液比;乙醇回流提海金沙
中总黄酮的优化工艺参数为:提取温度 75℃,乙醇浓度 60%, 提
取时间 75min,料液比 1∶40,即组合 A3B1C3D2.
2.5　验证性实验
选用正交试验得出的最优水平做 3次平行实验结果如表
10.此正交试验得出的最优组合符合实际.
2.6　海金沙总黄酮得率的计算
以验证性试验中总黄酮得率(X)的均值为依据 ,计算提
取 2次的海金沙总黄酮得率(%)=
(X1 +X2 +X3)×97.04%/3×86.78%=2.91%
3　结论
在提取海金沙总黄酮的工艺中 ,温度 、乙醇浓度 、时间和料液比是海金沙总黄酮得率的主要影响因素.其
影响大小依次为:温度 >乙醇浓度 >提取时间 >料液比.通过正交试验分析确定海金沙总黄酮较优的常规提
取条件为:以 60%乙醇做提取剂 ,料液比 1∶40, 75℃水浴 75min,一次提取总黄酮得率约为 2.6%,再提取一
次 ,两次提取率可达 97.04%,其总黄酮得率可提高到 2.91%.此法简便易行 ,要求设备易得 ,成本低 、工效
快 ,适合规模化生产.
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