全 文 ：林燕如． 金毛狗叶总黄酮的提取及抗氧化性［J］． 江苏农业科学，2012，40(11) :322 － 325．
金毛狗叶总黄酮的提取及抗氧化性
林燕如
(韩山师范学院化学系，广东潮州 521041)
摘要:考察影响微波辅助水浴浸提法提取金毛狗叶总黄酮的主要因素，用正交试验确定最优提取工艺，并初步探
讨金毛狗叶黄酮清除羟自由基能力、清除超氧阴离子能力和还原能力测定。结果表明:微波辅助提取金毛狗叶总黄酮
的最优工艺为微波功率 160 W、微波时间 1 min、料液比 1 g ∶ 45 mL、乙醇浓度 40%、水浴温度 90 ℃、水浴时间 0． 5 h，
此时提取率高达 11． 96%;金毛狗叶黄酮提取物抗氧化性较好。
关键词:金毛狗叶;总黄酮;微波;抗氧化性
中图分类号:R284． 2 文献标志码:A 文章编号:1002 － 1302(2012)11 － 0322 － 03
收稿日期:2012 － 04 － 06
基金项目:韩山师范学院青年基金(编号:LQ200812)。
作者简介:林燕如(1982—) ，女，广东揭阳人，硕士，实验师，主要从事
基础化学实验研究与食品分析工作。Tel: (0768)2318515;
E － mail:lyrhuaxue@ 163． com。
金毛狗［Cibotium barometz(L)J． Sm．］为蚌壳蕨科(Dick-
soniaceae)金毛狗属植物。该属植物约有 20 种，我国仅有 1
种，历版《中华人民共和国药典》收载其根茎为常用中药狗
脊，其根茎的化学成分研究及其黄酮含量测定已有报道［1 － 2］。
据前人研究，金毛狗嫩叶具有清热凉血、利尿通淋等功效，可
治疗肠炎、痢疾等［3］。但现实中金毛狗叶常作为废物处理，
极大地造成了浪费。本试验通过对金毛狗叶总黄酮的提取，
并对其抗氧化活性进行研究，以期更好地开发金毛狗叶的实
用价值，为金毛狗资源的综合开发利用提供科学依据。
1 材料与方法
1． 1 材料与仪器
金毛狗叶采自潮州市西湖公园，洗净，自然晾干，60 ℃烘
干，粉碎，备用。芸香苷对照品购自国药集团化学试剂有限公
司，其他试剂均为分析纯。
格兰仕电脑型烧烤微波炉(顺德市格兰仕电器实业有限
公司) ，FA2004N电子天平(上海精密科学仪器有限公司) ，
Spectrumlab752s紫外可见分光光度计(上海棱光技术有限公
司)。
1． 2 方法
1． 2． 1 总黄酮的提取与测定
1． 2． 1． 1 总黄酮的提取 称取金毛狗叶 1． 000 0 g，按料液
比加入一定浓度的乙醇溶液，分别在不同微波功率、微波时
间、水浴温度条件下进行提取，抽滤，滤液定容至 100 mL，离
心 10 min后精确吸取提取液 1 mL 于 10 mL 比色管中，用亚
硝酸钠 － 硝酸铝 － 氢氧化钠显色［4 － 6］，用 60%乙醇定容至
10 mL，摇匀后静置 15 min待测。
1． 2． 1． 2 总黄酮含量的测定［4 － 6］ 标准曲线的制备:以芸香
苷为标准样品绘制标准曲线(测定时的最大吸收波长为
510 nm，标准曲线方程为 y = 8． 454 1x + 0． 009 5，式中 x 为芸
香苷的质量浓度，y为吸光度，r2 = 0． 998 8)。总黄酮含量的
测定:吸取一定量的总黄酮提取液于 10 mL比色管中，各加入
1 mL 60%乙醇，摇匀;用亚硝酸钠 －硝酸铝 －氢氧化钠显色，
用 60%乙醇定容至 10 mL，摇匀后静置 15 min，以空白液作对
照，于波长 510 nm处测定吸光度(D)。根据标准曲线方程计
算黄酮含量。
1． 2． 2 回收率试验 采用加标回收率试验法，准确量取金毛
狗叶总黄酮提取液样品 1 mL于 10 mL比色管中，共 4份，其中
3份加 0． 4 mg /mL芸香苷标准溶液 1 mL［6 －7］，按“1． 2． 1． 2”节
的方法用亚硝酸钠 －硝酸铝 －氢氧化钠显色后测定吸光度，每
个样品平行测定 3次，根据“1． 2． 1． 2”节的方程计算黄酮含量，
再根据下式计算回收率。
回收率 =
V1C1 － V2C2
V0C0
× 100%
式中:V0 为加入芸香苷标准溶液的体积(mL) ;C0 为芸香苷标
准溶液的浓度(mg /mL) ;V1 为加芸香苷的样品溶液的体积
(mL) ;C1 为加芸香苷的样品溶液的浓度(mg /mL) ;V2 为未加
芸香苷的样品溶液的体积(mL) ;C2 为未加芸香苷的样品溶
液的浓度(mg /mL)。
1． 2． 3 金毛狗叶黄酮的抗氧化性试验
1． 2． 3． 1 金毛狗叶黄酮类化合物还原能力的测定［6，8 － 9］ 在
6根 25 mL比色管中各加入 2． 5 mL pH值 6． 6 的磷酸盐缓冲
液，再各加入样品液(浓度 0． 080 mg /mL)0、0． 50、1． 00、1． 50、
2． 00、2． 50 mL;用蒸馏水定容到 5 mL，加入 1%铁氰化钾溶液
2． 5 mL，混合物在 50 ℃恒温 20 min 后，快速冷却，再加入
2． 5 mL 10%三氯乙酸溶液，然后以 3 000 r /min 离心分离
10 min;取上层清液 5 mL加蒸馏水 5 mL和 0． 1%三氯化铁溶
液 1 mL，在 700 nm处测定吸光度。
1． 2． 3． 2 金毛狗叶黄酮对羟自由基(· OH)的清除试
验［5 － 6，10 － 11］ 在 7 根 10 mL 比色管中依次加入 2 mmoL /L
FeSO4 溶液 3 mL、1 mmoL /L H2O2 溶液 3 mL，摇匀，接着加入
6 mmoL /L水杨酸溶液 3 mL，摇匀，放入 37 ℃精密恒温水浴槽
中恒温 15 min 后取出，在 510 nm 处测其吸光度 D0。(1)为
探讨不同添加量金毛狗叶黄酮提取物对羟自由基的清除效
果，加入 2 mg /mL金毛狗叶提取物各 0． 20、0． 40、0． 60、0． 80、
1． 00 mL，用蒸馏水定容至 10 mL，摇匀，37 ℃水浴中继续恒温
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DOI:10.15889/j.issn.1002-1302.2012.11.053
15 min，取出测其吸光度 Dx。(2)为探讨不同抗氧化剂对羟自
由基的清除效率，分别取 2 mg /mL 柠檬酸溶液和金毛狗叶提
取物 0． 20 mL，用蒸馏水定容至 10 mL，摇匀，37 ℃水浴中继续
恒温 15 min，取出测其吸光度 Dx。以柠檬酸对·OH清除率作
对比进行分析，则待测液对·OH的清除率计算公式为:
·OH清除率 =
D0 － Dx
D0
× 100%
1． 2． 3． 3 金毛狗叶总黄酮对超氧阴离子(O －·2 )的清除
试验［5 － 6，12］
1． 2． 3． 3． 1 不同添加量金毛狗叶黄酮提取物对超氧阴离子
的清除效果 在室温下往 6 根 25 mL 比色管中加入 pH 值
8. 34、浓度 66． 7 mmol /L 的 PBS 缓冲液 5． 0 mL，再各加入
2 mg /mL 金毛狗叶提取物 0、0． 20、0． 40、0． 60、0． 80、1． 00 mL
(不加金毛狗叶提取物的为空白对照) ，各加入 2 mmol /mL邻
苯三酚 1 mL，再加入一定量缓冲溶液使体系总体积达到
9 mL，然后立即混匀，再以二次蒸馏水作参比，在 322 nm下测
定吸光度 D322 nm(每隔 30 s测 1 次直至反应启动后 6 min) ，以
时间为横坐标，D322 nm为纵坐标进行线性回归，得到的直线斜
率为反应速率 v空 和 v样。
1． 2． 3． 3． 2 不同抗氧化剂对超氧阴离子的清除效果 在室温
下往 2根 25 mL比色管中加入 pH值 8． 34、浓度 66． 7 mmol /L
的 PBS缓冲液 5． 0 mL，再分别加入 2 mg /mL柠檬酸溶液和金
毛狗叶提取物 0． 20 mL，各加入 2 mmol /mL邻苯三酚 1 mL，再
加入一定量缓冲溶液使体系总体积达到 9 mL，然后立即混
匀，以二次蒸馏水作参比，在 322 nm下测定吸光值 D322 nm(每
隔 30 s 测 1 次直至反应启动后 6 min) ，以时间为横坐标，
D322 nm为纵坐标进行线性回归，得到的直线斜率为反应速率
v空 和 v样。以柠檬酸对 O
－·2 的清除率作对比进行分析，超氧阴
离子(O －·2 )的清除率计算公式为:
O －·2 清除率 =
v空 － v样
v空
× 100%
2 结果与分析
2． 1 各因素对金毛狗叶黄酮类化合物提取率的影响
2． 1． 1 乙醇浓度 由图 1 可知，在乙醇浓度不同、其他条件
相同(微波时间 5 min、微波功率 160 W、60 ℃ 恒温水浴
0． 5 h、料液比 1 g ∶ 40 mL)的情况下，开始时金毛狗叶总黄酮
提取率随着乙醇浓度的增大逐渐提高，但当乙醇浓度大于
50%时，提取率却降低。这可能是因为高浓度乙醇使细胞内
蛋白质凝固，黄酮不易溶出［13］，同时一些非黄酮类干扰物质
增多，造成总黄酮提取率下降。故选择乙醇浓度 40%、50%、
60%进行正交试验。
2． 1． 2 料液比 由图 1 可知，在料液比不同、其他条件相同
(微波时间 5 min、微波功率 160 W、60 ℃恒温水浴 0． 5 h、乙
醇浓度 50%)的情况下，溶剂相对用量太少，则浓度差太小，
不利于黄酮类化合物的浸出。黄酮提取率随料液比的增大而
提高，当料液比为 1 g ∶ 45 mL时金毛狗叶总黄酮提取率达到
最大，再增加溶剂的用量，总黄酮提取率反而降低，这可能是
由过量的溶剂能吸收微波的原因造成［14］。考虑提取效果和
减少溶剂用量等方面，将料液比确定为 1 g ∶ 45 mL，料液比不
作为影响因素考察。
2． 1． 3 微波时间 由图 1 可知，在微波时间不同、其他条件
相同(微波功率 160 W、60 ℃水浴恒温 0． 5 h、乙醇浓度 50%、
料液比 1 g ∶ 40 mL)的情况下，微波时间过短，则目标成分未
能充分溶出;微波时间过长，则可能导致目标成分的热分解及
溶剂的损失。随着微波处理时间的延长，金毛狗叶总黄酮提
取率在 2 min时达到最大;当微波时间大于 2 min 时，微波处
理时间过长，黄酮类物质易于分解，且时间过长、温度过高使
细胞内蛋白凝固，黄酮类物质不易溶出［14］。故选择微波时间
1、2、3 min进行正交试验。
2． 1． 4 微波功率 由图 1可知，在微波功率不同、其他条件相
同(微波时间 5 min、60 ℃水浴恒温 0． 5 h、乙醇浓度 50%、料液
比 1 g ∶ 40 mL)的情况下，随着微波功率的增大，产生的热量增
多，环境温度提高，一方面高温破坏提取物中的有效成分，另一
方面高温使蛋白质凝固，黄酮不易溶出［15］，使得总黄酮提取率
降低。因此，选择微波功率 160、320、480 W进行正交试验。
—323—林燕如:金毛狗叶总黄酮的提取及抗氧化性
2． 1． 5 水浴温度 由图 1 可知，在水浴温度不同、其他条件
相同(微波时间 5 min、微波功率 160 W、水浴恒温 0． 5 h、乙醇
浓度 50%、料液比 1 g ∶ 40 mL)的情况下，随水浴温度的升
高，总黄酮提取率呈增大趋势，但温度过高易造成溶剂的损
失，浸提效果反而下降。考虑到黄酮的热稳定性及溶剂的损
失问题，选择提取温度 70、80、90 ℃进行正交试验。
2． 1． 6 正交试验 由于总黄酮提取率受乙醇浓度、微波功
率、水浴温度、微波时间这 4个因素的交叉影响，为了考察各因
素的作用，选用 L9(3
4)正交表进行 4因素 3水平正交试验。
表 1 L9(34)正交试验设计及结果
试验号
A:乙醇
浓度(%)
B:微波
功率(W)
C:水浴
温度(℃)
D:微波
时间(min)
总黄酮提
取率(%)
1 40 160 70 1 9． 309
2 40 320 80 2 9． 287
3 40 480 90 3 11． 058
4 50 160 80 3 9． 118
5 50 320 90 1 11． 485
6 50 480 70 2 8． 168
7 60 160 90 2 11． 118
8 60 320 70 3 8． 072
9 60 480 80 1 7． 898
k1 9． 885 9． 848 8． 516 9． 564
k2 9． 590 9． 615 8． 768 9． 524
k3 9． 029 9． 041 11． 220 9． 416
R 0． 856 0． 807 2． 704 0． 148
由表 1 可知，影响金毛狗叶总黄酮提取率的因素主次顺
序为 C ＞ A ＞ B ＞ D，即水浴温度影响最大，其次是乙醇浓度和
微波功率，微波时间影响最小。综合以上因素，确定金毛狗叶
总黄酮微波辅助水浴浸提的最佳工艺条件为 A1B1C3D1，即微
波功率 160 W、微波时间 1 min、料液比 1 g ∶ 45 mL、乙醇浓度
40%、水浴温度 90 ℃、水浴时间 0． 5 h时，金毛狗叶总黄酮提
取率达 11． 96%。
2． 2 回收率
由表 2 可知，提取液中的黄酮类化合物的加样回收率较
高，平均为 111． 08%;相对标准偏差为 0． 79%，较小。因此该
方法准确度较高。
表 2 金毛狗叶总黄酮的回收率
叶中黄酮
含量(mg /mL)
芸香苷加入量
(mg /mL)
测出量
(mg /mL)
回收率
(%)
RSD
(%)
0． 034 2 0． 4 0． 078 6 111． 00
0． 033 9 0． 4 0． 078 0 110． 25
0． 034 0 0． 4 0． 078 8 112． 00
平均 111． 08 0． 79
2． 3 金毛狗叶黄酮的抗氧化活性
2． 3． 1 还原能力 由图 2 可以看出，试样具有较好的还原能
力，是良好的电子供应者。在添加量 0． 50 ～ 2． 50 mL范围内，
随着添加量的增加，样品的还原能力增强;在添加量 2． 00 ～
2． 50 mL范围内，黄酮提取物的还原能力趋于稳定。
2． 3． 2 对羟自由基的清除能力 由图 3 可看出，在黄酮提取
物添加量 0． 20 ～ 1． 00 mL 范围内，其清除羟自由基的能力随
着添加量的增加逐渐增强;当添加量为 1． 00 mL时，其清除率
为 13． 37%，说明适当增加金毛狗叶黄酮提取物的量有利于
提高其对羟自由基的清除效果。由图4可知，在其他条件相
同的情况下，金毛狗叶黄酮提取物对羟自由基的清除率为
5. 48%，柠檬酸对羟自由基的清除率为 57． 36%，表明柠檬酸
对羟自由基的清除效果大于金毛狗叶黄酮提取物。
2． 3． 3 对超氧阴离子的清除能力 由图 3 还可以看出，在黄
酮提取物添加量 0． 20 ～ 1． 00 mL 范围内，其清除超氧阴离子
的作用随着添加量的增加逐渐增强;当添加量为 1． 00 mL时，
其清除率为 36． 81%，说明适当增加金毛狗叶黄酮提取物的
量有利于提高其对超氧阴离子的清除效果。由图 4 可知，在
其他条件相同的情况下，金毛狗叶黄酮提取物对超氧阴离子
的清除率为 2． 39%，柠檬酸对超氧阴离子的清除率为
34. 13%，表明柠檬酸对超氧阴离子的清除效果大于金毛狗叶
黄酮提取物。
(下转第 325 页)
—423— 江苏农业科学 2012 年第 40 卷第 11 期
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(上接第 324 页)
3 结论
试验结果表明，采用微波辅助水浴浸提法提取金毛狗叶
总黄酮的最优提取条件为微波功率 160 W、微波时间 1 min、
料液比 1 g ∶ 45 mL、乙醇浓度 40%、水浴温度 90 ℃、水浴时间
0． 5 h，在该条件下黄酮提取率高达 11． 96%。金毛狗叶黄酮
提取物对羟基自由基和超氧阴离子的清除作用较好。
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马美华，李小华，杨爱萍，等． 催化动力学光度法测定对蔬菜中痕量铅的测定［J］． 江苏农业科学，2012，40(11) :325 － 328．
催化动力学光度法对蔬菜中痕量铅的测定
马美华，李小华，杨爱萍，吴晓红，蒋彩云
(江苏经贸职业技术学院工程技术学院 /江苏省食品安全工程技术研究开发中心，江苏南京 210007)
摘要:为了提高食品安全意识，重视蔬菜中重金属铅污染的情况，本研究阐明铅在蔬菜中的存在所带来的危害，
探讨了利用催化动力学光度法测定蔬菜中痕量铅的最佳试验条件，建立了一种测定痕量铅的新方法。该方法线性范
围为 8． 0 ～ 40． 0 μg /mL，检出限为 3． 6 × 10 －4 μg /mL，灵敏度高、选择性强、操作简便、快速。可用于茄子、南瓜、黄瓜、
芹菜、甘蓝、马铃薯中痕量铅的测定，结果可靠。
关键词:催化动力学光度法;蔬菜;铅;测定
中图分类号:O657 文献标志码:A 文章编号:1002 － 1302(2012)11 － 00325 － 04
收稿日期:2012 － 06 － 04
基金项目:江苏经贸职业技术学院重大项目(编号:JSJM2010001)。
作者简介:马美华(1958—) ，女，教授，研究方向为食品营养与检测。
E － mail:mmh － 58@ 163． com。
通信作者:李小华，教授，研究方向为食品安全。E － mail:xiaohuali57
@ 163． com。
食品安全关系到人们的健康乃至生命，关系到我国经济
的良性发展和政治的稳定。随着现代工业的发展与工业污染
物的排放，空气、土壤、水质等分别被重金属不同程度地污
染［1 － 4］。重金属对人体的危害很大，不同的重金属对人体危
害也不一样，如铅进入人体后，除部分通过粪便、汗液排泄外，
其余在数小时后溶入血液中，阻碍血液的合成，导致人体贫
血，出现头痛、眩晕、乏力、困倦、便秘与肢体酸痛等，有的还会
导致动脉硬化、消化道溃疡与眼底出血等。小孩铅中毒则出
现发育迟缓、食欲不振、行走不便与便秘、失眠，若是小学生，
还伴有多动、听觉障碍、注意不集中、智力低下等现象。这是
因为铅进入人体后通过血液侵入大脑神经组织，使营养物质
与氧气供应不足，造成脑组织损伤，严重者可能导致终身残
废。特别是儿童处于生长发育阶段，对铅比成年人更敏感，进
入体内的铅对神经系统有很强的亲和力，故儿童对铅的吸收
量比成年人高好几倍，受害尤为严重。铅进入孕妇体内则会
通过胎盘影响胎儿发育，造成畸形等。铅及其化合物对人体
各组织均有毒性，中毒途径可由呼吸道吸入含铅蒸气或粉尘，
然后呼吸道中吞噬细胞将其迅速带至血液，或经消化道吸收，
进入血液循环而发生中毒［5］。因此，准确测定蔬菜中重金属
铅的含量具有非常重要的意义。
到目前为止，铅测定的方法有石墨炉原子吸收光谱法、氢
化物原子荧光光谱法、火焰原子吸收光谱法等［6 －8］，这些方法
各有特色。催化动力学分析法可根据待测物质对某些反应的
催化作用，利用反应速率与催化剂浓度之间的定量关系，通过
—523—江苏农业科学 2012 年第 40 卷第 11 期