全 文 ：ＤＯＩ：ＣＮＫＩ：４６－１０４９／Ｒ．２０１１０６１７．１１１２．０１１
网络出版地址：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｋｃｍｓ／ｄｅｔａｉｌ／４６．１０４９．Ｒ．２０１１０６１７．１１１２．０１１．ｈｔｍｌ
［收稿日期］２０１１－０６－０７　　［修回日期］２０１１－０６－１３　　网络出版时间：２０１１－６－１７　１１：１２
［基金项目］海南省科技项目（０８１０１２）
［作者简介］李洪福（１９８３－），男，辽宁朝阳人，助理实验师，硕士，电话：０８９８－３１３５０７７３，电子信箱：ｌｉｈｏｎｇｆｕ６６８８＠１６３．ｃｏｍ。
［通讯作者］黄剑（１９６２－），男，广西柳州人，副教授，电话：０８９８－６６８９４４２９，电子信箱：ｈｕａｎｇｊｉａｎ８５２＠ｈｏｔｍａｉｌ．ｃｏｍ。
正交试验法优选海南九节叶中总黄酮成分提取工艺
李洪福，刘明生，张小坡，黄　剑＊
（海南医学院药学院，海南 海口　５７１１０１）
　　［摘要］目的：优选海南九节叶中总黄酮成分提取工艺。方法：采用Ｌ９（３４）正交试验，以海南九节叶中
总黄酮的提取率为考察指标，考察乙醇浓度、提取时间、提取次数和药材／溶剂比例４个因素对总黄酮提
取率的影响。结果：海南九节叶中总黄酮最佳醇提工艺为２０倍量７５％乙醇提取３次，每次２ｈ。结论：
应用该工艺提取海南九节叶中总黄酮，总黄酮获得率高，方便可行，为海南九节叶中总黄酮提取工艺的
确定提供实验依据。
［关键词］海南九节；总黄酮；正交试验
［中图分类号］Ｑ９４９．７５１．８　［文献标识码］Ａ　［文章编号］１００７－１２３７（２０１１）０８－１０１２－０３
Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｏｐｔｉｍａｌ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ　ｆｏｒ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｏｔａｌ　ｆｌａｖｏｎｉｏｄｓ　ｆｒｏｍ　Ｐｓｙｃｈｏｔｒｉａ　ｈａｉｎａｎｅｎｓｉｓ
ｂｙ　ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ　ｔｅｓｔ
ＬＩ　Ｈｏｎｇ－ｆｕ，ＬＩＵ　Ｍｉｎｇ－ｓｈｅｎｇ，ＺＨＡＮＧ　Ｘｉａｏ－ｐｏ，ＨＵＡＮＧ　Ｊｉａｎ＊
（Ｓｃｈｏｏｌ　ｏｆ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｈａｉｎａｎ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｈａｉｋｏｕ５７１１０１，Ｃｈｉｎａ）
［Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ　Ｐｒｏｊｅｃｔ］：Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ｐｒｏｊｅｃｔｓ　ｏｆ　Ｈａｉｎａｎ　ｐｒｏｖｉｎｃｅ（ｇｒａｎｔ　Ｎｏ．０８１０１２）
［Ａｕｔｈｏｒ］：ＬＩ　Ｈｏｎｇ－ｆｕ （１９８３－），Ｍａｌｅ，Ｃｈａｏｙａｎｇ　Ｌｉａｏｎｉｎｇ，Ａｓｓｉｓｔａｎｔ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｉｓｔ，Ｍ．Ｍ．，Ｔｅｌ
：０８９８－３１３５０７７３，Ｅｍａｉｌ：ｌｉｈｏｎｇｆｕ６６８８＠１６３．ｃｏｍ．
［Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ　ｔｏ］：ＨＵＡＮＧ　Ｊｉａｎ （１９６２－），Ｍａｌｅ，Ｌｉｕｚｈｏｕ　Ｇｕａｎｇｘｉ，Ａｓｓｏｃｉａｔｅ　ｐｒｏｆｅｓｓｏｒ，Ｔｅｌ：
０８９８－６６８９４４２９，Ｅｍａｉｌ：ｈｕａｎｇｊｉａｎ８５２＠ｈｏｔｍａｉｌ．ｃｏｍ．
Ｒｅｃｅｉｖｅｄ：２０１１－０６－０７　　Ｒｅｖｉｓｅｄ：２０１１－０６－１３　 ＪＨＭＣ，２０１１；１７（８）：１０１２－１０１４
Ｖｉｅｗ　ｆｒｏｍ　ｓｐｅｃｉａｌｉｓｔ：Ｉｔ　ｉｓ　ｃｒｅａｔｉｖｅ，ａｎｄ　ｏｆ　ｃｅｒｔａｉｎ　ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　ａｎｄ　ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ　ｖａｌｕｅ．
［ＡＢＳＴＲＡＣＴ］Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ　ｅｘｐｌｏｒｅ　ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍｕｍ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ　ｔｏｔａｌ　ｆｌａｖｏｎｉｏｄｓ　ｆｒｏｍＰｓｙ－
ｃｈｏｔｒｉａ　ｈａｉｎａｎｅｎｓｉｓ　ｂｙ　ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ　ｔｅｓｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｂｙ　ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ　ｄｅｓｉｇｎ　Ｌ９（３４），ｗｅ　ｃｈａｎｇｅｄ　ｔｈｅ　ａｌｃｏｈｏｌ
ｄｅｎｓｉｔｙ，ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｄｕｒａｔｉｏｎ，ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｔｉｍｅｓ　ａｎｄ　ｒａｔｉｏ　ｏｆ　ｓｏｌｉｄ－ｔｏ－ｌｉｑｕｉｄ　ｉｎ　ｏｒｄｅｒ　ｔｏ　ｏｂｔａｉｎ　ｈｉｇｈｅｓｔ　ｅｘｔｒａｃ－
ｔｉｏｎ　ｒａｔｅ　ｏｆ　ｔｏｔａｌ　ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍｕｍ　ｐｒｏｃｅｓｓ　ｗａｓ　ａｓ　ｆｏｌｏｗｓ：ｔｈｅ　ｃｒｕｄｅ　ｄｒｕｇ　ｗａｓ　ｅｘｔｒａｃｔｅｄ
ｔｈｒｅｅ　ｔｉｍｅｓ（２ｈｅａｃｈ）ｗｉｔｈ　７５％ｏｆ　ａｌｃｏｈｏｌ　ｄｅｎｓｉｔｙ　ａｎｄ　ｓｏｌｉｄ－ｔｏ－ｌｉｑｕｉｄ　ｒａｔｉｏ　ｏｆ　１：２０．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ：Ｗｉｔｈ
ｈｉｇｈ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｒａｔｅ　ｏｆ　ｔｏｔａｌ　ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ，ｔｈｉｓ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ｉｓ　ｓｉｍｐｌｅ　ａｎｄ　ｆｅａｓｉｂｌｅ．Ｔｈｉｓ　ｓｔｕｄｙ　ｐｒｏｖｉｄｅｓ　ｅｘｐｅｒｉ－
ｍｅｎｔａｌ　ｂａｓｉｓ　ｆｏｒ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｏｔａｌ　ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ　ｆｒｏｍ　Ｐｓｙｃｈｏｔｒｉａ　ｈａｉｎａｎｅｎｓｉｓ．
［ＫＥＹ　ＷＯＲＤＳ］Ｐｓｙｃｈｏｔｒｉａ　ｈａｉｎａｎｅｎｓｉｓ；Ｔｏｔａｌ　ｆｌａｖｏｎｉｏｄｓ；Ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ　ｔｅｓｔ
　　海南九节（Ｐｓｙｃｈｏｔｒｉａ　ｈａｉｎａｎｅｎｓｉｓ）为茜草科植
物，又名山大刀、青龙吐珠，为长绿灌木，耐阴性极
强，喜温暖多湿阳光的环境。根叶药用，有清热解
毒、消肿拔毒、祛风除湿之效，治感冒、白喉、痢疾、跌
２１０１ 　
海南医学院学报　２０１１，１７（８）
Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｈａｉｎａｎ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
DOI:10.13210/j.cnki.jhmu.2011.08.003
打损伤和无名肿痛等［１］。黄酮类化合物广泛存在于
植物中，具有多种多样的生理活性，如防治心脑血管
疾病、降低血清胆固醇、防癌抗癌、调节免疫、抗衰
老、抗菌抗病毒、抗炎抗过敏、止血镇痛等［２］。黄酮
类化合物是海南九节叶中的主要有效成分之一，本
实验采用正交试验法对海南九节叶中总黄酮的提取
工艺进行研究，为海南九节叶中有效成分的提取提
供参考。
１　材料与方法
１．１　材料
ＦＷ－１７７型中草药粉碎机 （天津市泰斯特仪器
有限公司），２０２ＡＲ－１型电热干燥箱（上海申光仪器
仪表有限公司），ＨＨ－Ｓ型恒温水浴锅（巩义市予华
仪器责任有限公司），Ｒ－２０５型旋转蒸发器 （上海申
胜生物技术有限公司），精密电子天平（北京赛多利
斯天平有限公司），ＵＶ－１６００型紫外可见分光光度
计（北京瑞利分析仪器公司）。芦丁对照品（中国药
品生物制品检定所），硝酸铝、亚硝酸钠、氢氧化钠、
乙醇为分析纯。
药材由中国医学科学院药用植物研究所海南分
所提供，经陈伟平研究员鉴定为茜草科植物海南九
节。
１．２　标准曲线的制备
精密称取在１２０℃减压干燥至恒重的芦丁对照品
５０ｍｇ，置５０ｍＬ容量瓶中，加７０％乙醇适量，置水浴上
微热溶解，放冷，加７０％乙醇稀释至刻度，摇匀。精密
量取１０ｍＬ置１００ｍＬ容量瓶中，加７０％乙醇至刻度，
摇匀，即得对照品溶液（含芦丁０．１ｍｇ／ｍＬ）。准确量
取对照品溶液０．０、１．０、２．０、３．０、４．０、５．０ｍＬ分别置于
１０ｍＬ容量瓶中，补充７０％的乙醇至５ｍＬ，各依次加入
５％亚硝酸钠溶液０．３ｍＬ，振摇后放置５ｍｉｎ；加入１０％
硝酸铝溶液０．３ｍＬ摇匀后放置６ｍｉｎ；加入１．０ｍｏｌ／Ｌ
氢氧化钠溶液２．０ｍＬ，最后用７０％乙醇定容至刻度，
以７０％的乙醇为空白，在５１０ｎｍ处测定吸光度，以芦
丁溶液浓度（Ｃ）为横坐标，吸光度（Ａ）为纵坐标，得回归
方程为：Ｙ＝１１．６２Ｘ－０．０１４７，Ｒ２＝０．９９９　８。表明芦丁
浓度在０．１～０．５ｍｇ／ｍＬ时浓度与吸光度之间线性关
系良好。
１．３　海南叶总黄酮的提取与测定
取一定量干燥的海南叶进行粉碎，过６０目筛，
精确称取１０．０ｇ置于烧瓶内，加浓度为９５％的乙醇
２５０ｍＬ　７５℃条件下回流提取１ｈ，抽滤，滤渣加
９５％的乙醇２５０ｍＬ继续提取４次，合并５次滤液，
减压回收乙醇，然后转移到１００ｍＬ容量瓶中用
９５％的乙醇定容。精确量取１．０ｍＬ提取液共３
份，按标准曲线方法测定吸光度，计算得每克海南九
节叶药材中总黄酮含量为９．６８５ｍｇ。
１．４　单因素实验和多因素正交试验
根据影响海南九节叶黄酮类成分提取效果的因
素，分别考察了乙醇浓度（６０％、６５％、７５％、８５％、
９５％）、提取时间（１、１．５、２、２．５、３ｈ）、提取次数（１、
２、３、４、５次）、药材／溶剂比例（Ｗ／Ｖ：１／５、１／１０、
１／１５、１／２０、１／２５）等单因素条件下海南九节叶总黄
酮的提取率。为了系统考察海南九节叶总黄酮的乙
醇提取法的工艺参数，根据单因素实验各因素对提
取率影响的大小、提取因素的变化范围和各因素的
最佳值，选取乙醇浓度、提取时间、提取次数和药材
与溶剂的比例４个因素，每个因素取３个水平，以提
取物中总黄酮得率为考察指标，总黄酮得率＝（提取
液中总黄酮含量／药材质量）×１００％，进行Ｌ９（３４）
正交试验。
２　结果
试验因素与水平见表１，正交试验结果及数据
分析见表２、表３。
表１　正交试验因素水平表
水平
Ａ
（乙醇浓度）
Ｂ
（提取时间）
Ｃ
（提取次数）
Ｄ
（物料比）
１　 ７５％ １ｈ １　 １∶１０
２　 ８５％ １．５ｈ ２　 １∶１５
３　 ９５％ ２ｈ ３　 １∶２０
表２　Ｌ９（３４）正交试验结果及数据分析
试验号 Ａ　 Ｂ　 Ｃ　 Ｄ
黄酮得率
（％）
１　 １　 １　 １　 １　 ０．１２９６
２　 １　 ２　 ２　 ２　 ０．３２６３
３　 １　 ３　 ３　 ３　 ０．６５４６
４　 ２　 １　 ２　 ３　 ０．３８９６
５　 ２　 ２　 ３　 １　 ０．３５２４
６　 ２　 ３　 １　 ２　 ０．２９２０
７　 ３　 １　 ３　 ２　 ０．５５５２
８　 ３　 ２　 １　 ３　 ０．５３８８
９　 ３　 ３　 ２　 １　 ０．１３３５
Ｋ１ ０．３７０　 ０．３５８　 ０．３２０　 ０．２０５ －
Ｋ２ ０．３４５　 ０．４０６　 ０．２８３　 ０．３９１ －
Ｋ３ ０．４０９　 ０．３６０　 ０．５２１　 ０．５２８ －
Ｒ　 ０．０６４　 ０．０４８　 ０．２３８　 ０．３２３ －
　　由表２正交试验结果及结果的直观分析可知，
乙醇浓度影响Ａ３＞Ａ１＞Ａ２，提取时间影响Ｂ２＞Ｂ３
＞Ｂ１，提取次数影响Ｃ３＞Ｃ１＞Ｃ２，Ｄ３＞Ｄ２＞Ｄ１，由
Ｒ值可知 ，各因素对试验结果的重要次序为 Ｄ＞Ｃ
＞Ａ＞Ｂ，综合各种因素，选定海南九节叶总黄酮提
取工艺为 Ａ１Ｂ３Ｃ３Ｄ３，即２０倍量７５％乙醇提取３
次，每次２ｈ，总黄酮得率为０．６５４６％。
３１０１李洪福等．正交试验法优选海南九节叶中总黄酮成分提取工艺　
表３　Ｌ９（３４）正交试验数据方差分析
因素 偏差平方和 自由度 Ｆ比 Ｆ临界值显著性
乙醇浓度 ０．００６　 ２　 １．５００　１９．０００
提取时间 ０．００４　 ２　 １．０００　１９．０００
提取次数 ０．０９８　 ２　 ２４．５００　１９．０００ ＊
物料比 ０．１５７　 ２　 ３９．２５０　１９．０００ ＊
误差 ０．０００　 ２
　　由表３正交试验数据方差分析可知，因素Ａ（乙
醇浓度）、因素Ｂ（提取时间）不具有显著性，因素Ｃ
（提取次数）、因素Ｄ（物料比）具有显著性，说明在海
南九节叶总黄酮的提取工艺中，乙醇与药材的物料
比和提取时间是影响总黄酮得率的主要因素，在工
艺优化中应该重点考虑，而乙醇浓度和提取时间两
个因素不具有显著性，从节约成本和降低消耗角度
出发，应该选择较低浓度的乙醇作为提取溶剂，并尽
可能缩短提取时间。
３　讨论
在海南岛，黎族人民应用九节的茎和叶治疗骨
折、跌打损伤等症，目前对海南九节的研究报道还比
较少，本实验应用正交试验的方法对海南九节叶中
总黄酮成分的提取工艺进行了优化研究，为海南九
节的开发利用奠定基础。黄酮类化合物广泛存在于
植物体内，绝大多数以苷的形式存在，少数以游离的
苷元形式存在。因结构及存在状态不同其溶解度有
很大差异，提取方法也不尽相同［３－５］。尽管以甲醇－
水为溶剂提取黄酮类化合物较为理想，但甲醇有一
定的毒性，而且沸点低，易挥发，因此本实验选择乙
醇－水为提取溶剂。结果显示，应用７５％乙醇溶液，
按药材－乙醇１∶２０的比例进行回流提取３次，每次
２ｈ，总黄酮得率为０．６５４６％。
参考文献
１　刘明生．黎药学概论［Ｍ］．北京：人民卫生出版社，２００８：
８．
２　李楠，刘元，侯滨滨．黄酮类化合物的功能特性［Ｊ］．食品
研究与开发，２００５，２６（６）：１３９－１４１．
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４　张勇，李彩霞，李鹏，等．醇法提取锁阳中总黄酮的研究
［Ｊ］．甘肃科学学报，２００５，１７（３）：４１－４３．
５　吕亚玲．大孔树脂对大蓟总黄酮吸附的研究［Ｊ］．实用临
床医药杂志，２００８，（７）：５２－５３，５５．
（责任编辑　雷燕
檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪
）
（上接第１０１１页）
青霉的同源性均超过９９％ ，与非淡紫拟青霉菌株
亲缘关系较远，同源性低于９７％。通过形态学和
分子生物学各种指标鉴定菌株 ＷＣ１０１６为半知菌
纲、丝孢菌目、丝孢菌科、拟青霉属、淡紫拟青霉
（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ　ｌｉｌａｃｉｎｕｓ）。
目前研究发现，常见的产生新的次生代谢物的
真菌主要为青霉属（Ｐｅｎｉｃｉｌｉｕｍ）、拟青霉属（
Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）、曲霉属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｕｓ）等［１１］。本研
究的菌株 ＷＣ１０１６属于半知菌亚门拟青霉属，其发
酵液进行人外周血单个核细胞增殖实验，有明显的
免疫增强效果，目前，对该菌的免疫活性物质进行
分离纯化与结构鉴定的工作正在进行中。
致谢
衷心感谢海南医学院李影林教授在论文写作
方面给予的指导，感谢病原生物学教研室同仁在实
验过程中的大力协助。
参考文献
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１０　Ａｔｋｉｎｓ　ＳＤ，Ｃｌａｒｋ　ＩＭ，Ｐａｎｄｅ　Ｓ，ｅｔ　ａｌ．Ｔｈｅ　ｕｓｅ　ｏｆ　ｒｅａｌ－
ｔｉｍｅ　ＰＣＲ　ａｎｄ　ｓｐｅｃｉｅｓ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｐｒｉｍｅｒｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｉｄｅｎｔｉｆｉ－
ｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ　ｏｆ　ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ　ｌｉｌａｃｉｎｕｓ［Ｊ］．
ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　Ｅｃｏｌｏｇｙ．２００５，５１：２５７－２６４．
１１　Ｃｈｅｎ　Ｈ，Ｈｏｎｇ　Ｋ，Ｚｈｕａｎｇ　Ｌ，Ｚｈｏｎｇ　ＱＰ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ
ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ　ｆｒｏｍ
ｍａｎｇｒｏｖｅ　ｉｎ　Ｈａｉｎａｎ［Ｊ］．Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｔｒｏｐｉｃａｌ
Ｃｒｏｐｓ，２００６，２７（３）：６１－６３．
（责任编辑　唐娟）
４１０１ 　海南医学院学报 Ｖｏｌ．１７Ｎｏ．８Ａｕｇ．２０１１