全 文 ：193　
王桃云 1 ,陈　娟 2 ,彭志任 3 ,吴　琼 1 ,陈　鹏 4, ＊
(1.苏州科技学院 ,江苏苏州 215009;2.萍乡市林科所 ,江西萍乡 337000;
3.湘东区林业局 ,江西萍乡 337016;4.扬州大学 ,江苏扬州 225001)
摘　要:目的:研究海金沙黄酮(FlavonesfromLygodiumjaponicum, FLJ)的制备与体外抗氧化活性 。方法:通过回流法
萃取和大孔吸附树脂纯化 ,得到纯化的 FLJ。以 VC、BHT、芦丁和槲皮素为阳性对照 ,对羟基自由基 、超氧阴离子自由
基 、烷基自由基的清除率以及抑制油脂过氧化的能力进行研究 。结果:FLJ对上述自由基均有一定的清除作用 ,对羟基
自由基 、超氧阴离子自由基清除能力弱于 VC、芦丁和槲皮素;对油脂抗氧化作用强于 BHT和 VC。浓度为 1.04mg/mL
的 FLJ和 VC对烷基自由基的清除能力相当 。 FLJ的添加量在实验范围内与其抗氧化活性呈正相关 。结论:FLJ具有
明显的体外抗氧化活性 。
关键词:海金沙 ,黄酮 ,抗氧化活性 ,清除自由基 ,体外
Studyonantioxidantactivityofflavones
fromLygodiumjaponicuminvitro
WANGTao-yun1 , CHENJuan2 , PENGZhi-ren3 , WUQiong1 , CHENPeng4 , ＊
(1.SuzhouScienceandTechnologyUniversity, Suzhou215009, China;
2.TheForestryResearchInstituteofPingxiang, Pingxiang337000, China;
3.ForestryBureauofXiangdongCounty, Pingxiang337016 , China;
4.YangzhouUniversity, Yangzhou225001 , China)
Abstract:Objective:TostudytheantioxidantactivitiesofFLJinvitro.Methods:TheFLJwasextractedbymethodof
refluxextractionandpurifiedbymacroporousadsorptionresin.Thescavengingcapacitiesonhydroxylfreeradical,
superoxideanionradicalandalkylradicalaswelasinhibitionofPOVvalueoftheFLJweredetectedwhiletheVC,
BHT, quercetinandrutinflavonoidswereusedaspositivecontrol.Results:TheFLJhadsomescavengingabilityon
alradicalhadbeenstudiedinthisexperiment.Thescavengingactivityonhydroxylfreeradical, superoxideanion
radicalwasweakerthanVC, quercetinandrutinflavonoids.Whentheconcentrationwas1.04mg/mLtheFLJandVC
hadequivalentefectsonthealkylradical.ButtheFLJhadstrongerantioxidantactivitiesoninhibitionofPOVvalue
thanBHTandVC.TheamountofFLJusedwasindirectproportiontotheantioxidation.Conclusion:TheFLJhad
remarkableinvitroantioxidantactivity.
Keywords:Lygodiumjaponicum;flavones;antioxidantactivity;scavengingcapacitytoradical;invitro
中图分类号:TS201.2　　　　文献标识码:A　　　　文 章 编 号:1002-0306(2010)03-0193-04
收稿日期:2009-06-01　＊通讯联系人
作者简介:王桃云(1973-),男 , 讲师 ,在读博士研究生 ,研究方向:生
物化学技术与天然产物研究与开发。
　　海金沙 (Lygodium japonicum)系海金沙科
(Lygodiaceae)多年生蕨类植物 ,海金沙草是海金沙
植物的地上部分。资料报道 ,海金沙中含有黄酮类
化合物 ,而黄酮类化合物是人体所必需的营养素之
一 ,但人体自身不能合成 ,只能从食物中摄取 ,黄酮
类化合物具有抗氧化 、清除体内自由基 、抗衰老抗心
律失常 、降血糖 、降血脂等功效 。近年来 ,研究自由基
及其抑制剂 、清除剂和动力学机制逐渐成为生物及
医学研究中的一个新方向 ,越来越受到人们关注 ,并
取得了一定的研究成果 。本实验利用回流法萃取的
海金沙黄酮 ,对其体外抗氧化活性进行研究 ,旨在为
海金沙综合开发利用提供理论依据。
1　材料与方法
1.1　材料与设备
芦丁 、槲皮素 、亚油酸 　Sigma公司 , 色谱纯;三
氯化铝 、邻苯三酚 、甲醇 、乙醇 、水杨酸 、三氯乙酸 、硫
代巴比妥酸 、氯仿 、乙酸 、碘化钾 、硫代硫酸钠 、VC、
BHT、FeSO4等　均为国产分析纯;猪油　市售 ,肥猪
板油煎制;海金沙　10月中旬采自苏州市上方山森
林公园。
UV-2450紫外-可见分光光度计　岛津仪器(苏
州)有限公司;RE52-A旋转蒸发仪　上海亚荣玻璃
仪器厂;101-1-BS型电热恒温鼓风干燥箱　上海跃
进医学器械厂;FA2004N型电子天平　上海恒平科
DOI :10.13386/j.issn1002-0306.2010.03.002
194　
学仪器有限公司;GL-12B型台式离心机　上海飞鸽
离心机厂。
1.2　实验方法
1.2.1　FLJ样品液的制备　将海金沙洗净 ,烘干 ,粉
碎后过 100目筛 ,粉末于烘箱中干燥至恒重 ,称取
10.00g海金沙干粉 ,加入 200mL75%乙醇 , 85℃下恒
温回流提取 4h,提取液在 5000r/min下离心 20min,
得上清液 ,重复提取两次 ,将两次离心上清液合并 ,
旋转蒸发浓缩至原体积的 1/4;加入等体积的石油
醚 ,在分液漏斗中分层 ,弃上相 ,取下相。将下相液
倒入烧杯中 ,用保鲜膜封口 ,于 4℃下静置 24h后 ,在
5000r/min下离心 20min,得上清液 ,将上清液浓缩至
原体积的 1/5,待用 。
1.2.2　样液中 FLJ的纯化　选用 AB-8型大孔吸附
树脂对所得 FLJ溶液进行纯化 ,称取适量树脂 ,预处
理后。以 70%乙醇装层析柱 、平衡 ,用去离子水洗脱
后 ,调 pH至 6.0。缓慢上样 ,用 3～ 4倍体积的去离子
水洗去多糖 、蛋白质等杂质。依次用 50%、 60%、
70%、80%、95%乙醇进行梯度洗脱 ,每次更换乙醇
浓度前应检验终点。收集所有含 FLJ的洗脱液 ,旋
转蒸发至所需的浓度 。
1.2.3　标准曲线的绘制 　精密吸取在 120℃干燥至
恒重的芦丁对照品 0.2193g, 置于 100mL的容量瓶
中 ,加 10%的甲醇 70mL,置于水浴上微热至溶解 ,放
冷 ,加 10%的甲醇稀释至刻度 , 摇匀。精确吸取
10.0mL,置于 100mL容量瓶中 ,加蒸馏水稀释至刻
度 ,摇匀 ,即得对照品溶液 。
精密吸取已制备的对照品溶液 0、1.0、2.0、3.0、
4.0、5.0mL,分别置于 25mL容量瓶中 ,各加 30%乙醇
至 12.5mL,加 5%亚硝酸钠 0.7mL,混匀 ,静置 5min,
加 10%硝酸铝 0.7mL, 混匀 ,静置 6min, 加 1mol/L
NaOH5mL,再加 30%乙醇至刻度 ,混匀 ,静置 10min,
用紫外分光光度计在 510nm处测定吸光度 ,绘制浓
度 Y与吸光度 X的标准曲线 。
1.2.4　FLJ最佳吸收波长的确定　精密量取已制备
的对照品溶液 1.0mL,置于 25mL容量瓶中 ,加 30%
乙醇至 12.5mL,加 5%亚硝酸钠 0.7mL,混匀 ,静置
5min,加 10%硝酸铝 0.7mL, 混匀 , 静置 6min, 加
1mol/LNaOH5mL,再加 30%乙醇至刻度 ,摇匀 ,静
置 10min,用紫外分光光度计在 200～ 800nm范围内
进行扫描 ,得扫描图。
1.2.5　FLJ对羟基自由基(·OH)清除率的测定 [ 1] 　
利用 H2O2 对 Fe2 +混合产生 · OH,在体系内加入水
杨酸捕捉· OH并产生有色物质 ,该物质在 510nm下
有最大吸收 。各试管中分别加入不同浓度的 FLJ溶
液 2mL, 9mmol/L水杨酸-乙醇 2mL, 9mmol/LFeSO4
2mL,最后加入 8.8mmol/LH2O2 启动反应 , 37℃反应
0.5h,以蒸馏水为空白对照 ,在 510nm下测量各待测
液的吸光度 。考虑到本身的吸光值 ,以 9mmol/L水
杨酸 -乙醇 2mL, 9mmol/LFeSO4 2mL, 不同浓度的
FLJ溶液 2mL为黄酮的本底吸收。清除率的计算公
式为:
· OH清除率 =[ A0 -(Ax-Ax0)] /A0 ×100%
式中:A0为空白对照液的吸光度;Ax为加入黄
酮溶液后的吸光度;Ax0为不加黄酮溶液本底的吸
光度 。
1.2.6　FLJ对超氧阴离子自由基(O-2 · )清除率的测
定 [2 ] 　邻苯三酚用 10mmol/LHCl溶液配制成
60mmol/L的溶液 , Tris-HCl缓冲溶液为 50mmol/L,
pH为 8.2,各样品浓度分别为 0.08、0.32、0.56、0.80、
1.04mg/mL。取 2.7mLpH8.2 , 50mmol/LTris-HCl缓
冲液 ,加入 0.2mL蒸馏水 ,在 25℃保温 10min后 ,再
加入 0.1mL25℃预温的 60mmol/L邻苯三酚溶液 ,得
空白液 。另取 2.7mLpH8.2, 50mmol/LTris-HCl缓
冲溶液 ,加入 0.2mL样品溶液 ,在 25℃保温 10min后
再加入 0.1mL25℃预温的 60mmol/L邻苯三酚溶液 ,
得样品待测液 。将以上两种溶液分别加样于具塞比
色皿中 ,迅速摇匀后每隔 10s用紫外分光光度计于
320nm处测定相应吸光度值 ,至稳定为止(10mmol/L
HCl溶液为参比)。取 3次实验的平均值 ,计算清除
率。用同浓度的 VC和芦丁作为对照。清除率计算
公式为:
O-2 ·清除率 =(A0 -A1)/A0 ×100%
式中:A0为空白对照液的吸光度;A1 为加入黄
酮溶液后的吸光度 。
1.2.7　FLJ对烷基自由基清除率的测定 [ 3-4] 　取
2.5mL95%乙醇 、2.5mL0.1mol/LpH8磷酸缓冲液 、
0.05mL亚油酸和 0.5mLFLJ样品液 , 充分混合 ,用
10W紫外灯照射 60min, 然后加入 2mL三氯乙酸
(20%)和 0.5mL硫代巴比妥酸(3%, W/V), 95℃水
浴反应 90min,冰浴冷却 , 5000r/min离心 20min,于
532nm波长处测定吸光度。空白组以等体积双脱氧
水代替 FLJ样品液 , 以同浓度的芦丁和 VC作为对
照。烷基自由基清除率的计算公式为:
烷基自由基清除率 =(A0 -Ai)/A0 ×100%
式中:A0 为空白组吸光度;Ai为加样品液组的
吸光度。
1.2.8　FLJ抑制油脂氧化效果测定 [ 5-6] 　称取已测定
POV的猪油 4份 ,每份 40.0g置于 250mL的锥形瓶
中 ,第 1份加入 6mL乙醇作为空白对照 ,第 2份加入
6mL0.5mg/mLVC,第 3份加入 6mL0.5mg/mLBHT,
第 4份加入 6mL0.5mg/mLFLJ,充分振摇后 ,置 65℃
恒温干燥箱中 ,每隔 24h取 2.0g油样测定 POV值。
每次取样后充分振摇锥形瓶 ,以混入足够的空气。
油脂过氧化值 (POV)测定方法:按照 GB/T5538-
1995的方法测定。
称取试样 2.0g,加入到 250mL锥形瓶中。在装
有试样的锥形瓶中加入 10mL氯仿溶解试样 ,加入
15mL乙酸和 1mL碘化钾饱和溶液 ,迅速盖好瓶塞 ,
混匀溶液 1min,在 25℃避光静置 5min。加入约 75mL
蒸馏水 ,以 0.5%淀粉溶液为指示剂 ,用硫代硫酸钠
标准溶液滴定析出的碘 ,滴定过程要用力振摇。过
氧化值计算公式为:
X=(V1 -V2)×C×1000M
式中:V1是用于测定的硫代硫酸钠标准溶液的
体积 , mL;V2是用于测定猪油的硫代硫酸钠标准溶
195　
液的体积 , mL;C是硫代硫酸钠标定浓度 , mol/L;M
是试样的质量 , g。
2　结果与分析
2.1　芦丁标准曲线的制作
按 1.2.3所述方法 ,得标准曲线如图 1所示。
图 1　芦丁标准曲线
由图 2可得回归方程为:Y=10.148x+0.0069,
R2 =0.9998 ,该标准曲线在 0.022～ 0.11mg/mL范围内
有良好的线性关系。
2.2　FLJ最佳吸收波长的确定
由 1.2.4所述方法对 FLJ进行测定 ,所得光谱扫
描结果如图 2所示。
图 2　海金沙黄酮吸收光谱图
由图 2可知 ,在 200～ 600nm波长范围内 , FLJ的
吸收峰对应波长为 355nm,此波长即为 FLJ的最佳吸
收波长 。
2.3　FLJ对· OH的清除率
按 1.2.5所述方法 ,得不同浓度下 FLJ、VC和槲皮
素对· OH的清除率 ,如图 3所示。
图 3　FLJ、VC、槲皮素对· OH的清除率
从图 3可知 ,随着三种物质在反应液中浓度的
增加 ,对 · OH的清除率呈上升趋势 ,当 VC浓度为
0.11mg/mL时 ,其 · OH清除率趋近于 100%, 此时
FLJ和槲皮素的 ·OH清除率分别是 10%和 22%,因
此 , FLJ对 · OH具有一定的清除力 ,但作用效果比
VC和槲皮素差。
2.4　FLJ对 O-2 ·的清除率
按 1.2.6所述方法 ,得不同浓度下 FLJ、VC和芦丁
对 O-2 ·的清除率 ,如图 4所示。
图 4　FLJ、芦丁 、VC对 O-2 ·的清除率
由图 4可知 , FLJ、VC和芦丁对 O-2 ·均有不同程
度的清除作用 ,而且这三种抗氧化剂对 O-2 ·的清除
作用与其浓度呈量效关系 ,清除率随着其浓度的提
高而增大。当抗氧化剂浓度为 1.04mg/mL时 , FLJ、
芦丁和 VC对 O-2 ·的清除率分别为:59.5%、82.6%和
98.8%,芦丁和 VC的清除作用都强于 FLJ。同时 ,随
着浓度的增大 , FLJ对 O-2 ·清除作用的增长趋势比
芦丁和 VC强。因此 , FLJ对 O-2 ·具有较好的清除
作用 。
2.5　FLJ对烷基自由基的清除率
按 1.2.7所述方法 ,分别对不同质量浓度的 FLJ、
VC和芦丁对亚油酸氧化体系的抑制能力进行实验 ,
结果如图 5所示。
图 5　FLJ、芦丁 、VC对烷基自由基的清除率
从图 5可知 , FLJ、芦丁和 VC对烷基自由基引发
的亚油酸氧化体系均有不同程度的抑制作用 ,在实
验浓度范围内 ,三种抗氧化剂在实验浓度范围内对
烷基自由基的清除率随各自浓度的提高而增大 ,且
在不同浓度范围内 ,清除率有显著差异 。当三种抗
氧化剂的浓度达到 1.04mg/mL时 , FLJ、芦丁和 VC对
烷基自由基的清除率分别达到 57.01%、67.72%和
58.84%, FLJ与芦丁和 VC对烷基自由基的清除效果
相当 。因此 , FLJ对烷基自由基具有较好的清除
作用 。
2.6　FLJ抑制油脂氧化效果
油脂暴露在空气中易氧化形成自由基 ,自由基
与空气中的氧反应生成自由基和过氧化物 ,可以用
油脂的 POV值来评价其氧化程度 , POV值越小 ,则
油脂被氧化的程度越小 。按 1.2.8所述方法 ,得不同
浓度下 VC、BHT和 FLJ抑制油脂氧化效果 ,结果如图
6所示 。
由图 6可知 ,空白样在没加抗氧化剂时 ,油脂的
POV随着时间的延长不断升高。加入抗氧化剂 FLJ、
VC和 BHT后 ,油脂的 POV在 7d后随时间的延长而
增加程度明显比空白要低 ,且经 FLJ处理的油脂的
　　　 (下转第 199页)
199　
和树皮提取物的抗氧化能力 ,是一种快速 、简便 、灵
敏可行的方法。杨梅叶 、枝和树皮提取物具有较好
的清除 DPPH·和 ABTS+·的作用 ,明显强于阳性对
照芦丁 , 且随着化合物浓度的增加 , 对 DPPH·和
ABTS+·的清除作用逐渐增强 ,表明提取物剂量与清
除自由基的能力间存在量效关系 。其中以杨梅枝提
取物清除 DPPH·能力最强 ,叶次之 ,皮最弱;杨梅叶
提取物清除 ABTS+·能力最强 ,枝次之 ,皮最弱。
杨梅叶 、枝和树皮提取物在山茶油中均有较强
的抗氧化活性 ,在一定添加剂量范围内 ,其抗氧化活
性与添加量存在量效关系 ,且 0.05%提取物的效果
优于 0.02%TBHQ;在 0.02%添加剂量下 ,各种提取物
对山茶油的抗氧化能力表现为 TBHQ>皮提取物 >
叶提取物 >枝提取物 >VE。在全血体系下的抗氧化
评价实验能更加真实反映提取物的抗氧化能力 ,结
果显示其抗氧化能力从强到弱的排序依次为 VC>枝
提取物 >叶提取物 >皮提取物 。
本研究结果表明 ,杨梅叶 、枝和树皮提取物含有
较好的清除自由基 ,抗山茶油氧化及全血抗氧化能
力 ,是一种极有潜力的天然抗氧化剂资源 , 其在食
品 、化妆品及药品方面的研究将成为今后的工作
重点。
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(上接第 195页)
图 6　FLJ、VC、BHT对油脂氧化的抑制作用
POV值明显比 BHT和 VC处理的油脂 POV值低 。因
此 , FLJ对抑制油脂氧化具有良好的效果 。
3　结论
体外抗氧化实验结果表明 , FLJ有一定的的清除
羟基自由基 、超氧阴离子自由基作用;具有较强的清
除烷基自由基以及抑制油脂过氧化的能力;FLJ作为
抗氧化功能因子在保健功能食品中的应用前景
　　　　　
广阔 。
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