全 文 ：收稿日期:2009-09-03;　修订日期:2010-04-23
基金项目:广东省科技计划项目资助(No.2007B020712004);
广东省梅州市科技计划项目资助(No.2006B21;2007B81)
作者简介:刘志伟(1969-),男(汉族),广东大埔人 ,现任嘉应学院生命科
学学院教授 ,博士学位 ,主要从事生物技术研究工作.
＊通讯作者简介:张　晨(1971-), 女(汉族),浙江杭州人 , 现任嘉应学院
生命科学学院教授 ,硕士学位 ,主要从事生物工程研究工作.
微生物发酵对溪黄草抑菌效果的影响
刘志伟 , 卢彩焕 , 张　晨＊
(嘉应学院生命科学学院 ,广东 梅州　514015)
摘要:目的 用不同菌种发酵和用纤维素酶预处理溪黄草 , 初步探讨发酵对溪黄草抑菌效果影响的机制 , 为开发廉价的食
品添加剂 , 抑菌药物和节约药材资源提供新的研究途径。方法 对溪黄草进行发酵等处理后 , 检测其醇提物的抑菌作用。
结果 微生物发酵对溪黄草抑菌效果存在一定的影响 , 酵母发酵能明显提高抑菌效果 , 与用纤维素酶处理的效果相似。
结论 利用合适菌种发酵提高药材有效成分的利用率是可行的。
关键词:发酵;　溪黄草;　抑菌效果DOI标识:doi:10.3969 /j.issn.1008-0805.2010.09.032
中图分类号:R285.5　　文献标识码:B　　文章编号:1008-0805(2010)09-2200-02
　　溪黄草系唇形科香茶菜属植物 Rabdosiaserra(Maxim.)Ha-
ra, 由于和中药大辞典上所收录的中药溪黄草的原植物线纹香茶
菜 Rabdosiastriatus(Benth.)Kodo外形相似而常作溪黄草入药 ,
而且是广东药材市场上中药溪黄草的主流品种之一 ,用于清热利
湿 、凉血散瘀 ,治疗急性黄疸性肝炎 、急性胆囊炎等 [ 1] 。
目前关于溪黄草抑菌效果方面的研究 ,主要考虑将溪黄草的
提取物作为一种健康的食品添加剂。姚勇芳 [ 2]研究了溪黄草中
抑菌物质的最佳提取条件 ,并验证了溪黄草的乙醇提取物对大肠
杆菌具有抑制作用 , 对霉菌抑制效果不明显;战宇等 [ 3]研究了溪
黄草提取物的抑菌效果;梁盛年等 [ 4]测定了溪黄草乙醇提取物
的体外抗菌活性;段志芳等 [ 5]还证实溪黄草水提物对杨桃果实
具有一定的保鲜作用 。
发酵法一直是中药炮制方法之一 , 随着科学技术的发展 ,发
酵法应用范围更加广泛。这种方法借助微生物的作用 ,改变中药
原有药性 , 提高疗效 ,降低毒副作用 , 扩大适应症 [ 6, 7] 。本研究以
枯草杆菌 、乳酸菌和酵母菌为发酵菌种 , 研究发酵后的溪黄草醇
提物对细菌和霉菌生长的抑制效果 ,为高效提取溪黄草抑菌有效
成分 , 大规模生产高效 、低毒 、广谱而经济实用的食品防腐剂 、抑
菌药物以及对于循环利用和处理每年药厂大量废弃的药渣提供
了新的途径和方法。
1　材料
溪黄草购自梅州市温记百草堂 ,经嘉应学院生命科学学院廖
富林教授鉴定为 Rabdosiaserra(Maxim.)Hara。美乐多购自梅州
市太平洋商场。干酵母粉 , 广东丹宝利酵母有限公司 。枯草杆
菌 、JY-LZ乳酸芽孢杆菌 、大肠杆菌 、白葡萄球菌 、黑曲霉 、青霉
菌保藏于嘉应学院生命科学学院实验室。 纤维素酶(绿色木
酶),酶活力 >15μ/mg,上海伯奥生物科技有限公司。
2　方法
2.1　工艺流程 溪黄草※粉碎※称取 5 g※加入水或培养基※高
压灭菌(121℃, 20 min)※按 10%接种量接种发酵菌种※于培养
箱中静止 10d※提取※测定抑菌活性。
2.2　发酵
2.2.1　种子培养基 枯草杆菌种子培养基:蛋白胨 1%;牛肉膏
0.3%;氯化钠 0.15%;pH 7.0;蒸馏水配制;121℃湿热灭菌 20
min。
乳酸芽孢杆菌培养基:酵母膏 1.0%;蛋白胨 1.0% ;葡萄糖
1%;磷酸氢二钾 0.05%;硫酸镁 0.1%;硫酸锰 0.05%;pH7.0;
121℃湿热灭菌 20 min。
酵母菌培养基:去皮马铃薯 20%, 葡萄糖 2%, 蒸馏水配制 ,
121℃湿热灭菌 30 min。
2.2.2　发酵培养基 枯草杆菌发酵培养基:蛋白胨 1%;葡萄糖
1%;牛肉膏 0.3%;氯化钠 0.5%;pH7.0;蒸馏水配制;121℃湿
热灭菌 20min。
乳酸芽孢杆菌培养基:酵母膏 1.0%;蛋白胨 1.0% ;葡萄糖
2.5%;磷酸氢二钾 0.05%;硫酸镁 0.1%;硫酸锰 0.05%;pH
7.0;121℃湿热灭菌 20min。
美乐多乳酸菌培养基:雀巢脱脂奶粉 2%;葡萄糖 1%;蒸馏
水配制;121℃湿热灭菌 15 min。
酵母菌培养基:去皮马铃薯 20%, 葡萄糖 2%, 蒸馏水配制 ,
121℃湿热灭菌 30 min。
2.2.3　种子培养 将活化后的斜面枯草杆菌 、乳酸芽孢杆菌分别
挑取两接种环于相应的液体培养基中 , 接种后分别置于 37℃培
养箱中培养 24 h。
2.2.4　发酵培养 称取 5 g粉碎的溪黄草于 100 ml的三角瓶内 ,
加入 30ml蒸馏水 , 121℃灭菌 20 min。每瓶加入种子菌液 3ml,
于适宜的温度下静止培养。同时做 4种对照 ,即有 5组实验:Ⅰ :
溪黄草 +水 +菌;Ⅱ:溪黄草 +水;Ⅲ:溪黄草 +培养基 +菌;Ⅳ:
溪黄草 +培养基;Ⅴ:培养基 +菌。
发酵:将枯草杆菌系列 , 乳酸芽孢杆菌系列 ,美乐多乳酸菌系
列置于(36±1)℃的恒温培养箱中静置 10d,干酵母菌系列于(28
±1)℃的恒温培养箱中静置 10d。
2.2.5　发酵前后菌数量的检测 平板计数法 , 3个重复。
2.3　抑菌物质的提取 称取 5 g的溪黄草置于 3角瓶中 ,加入 30
ml95%的乙醇 , 于 70℃的恒温水浴锅中水浴 2 h后 , 滤纸过滤 ,
取滤液 , 将其于同温度的水浴锅中挥干浓缩至稠膏状 , 再加入
95%的乙醇溶解并定容至 10ml。定容后放入冰箱中保藏备用。
发酵后的 4个系列 4 800 r/min离心 20 min, 固形物按上法
处理。
纤维素酶处理及抑菌物质提取:分别称取纤维素酶 0.010 8
g和 0.031 0g, 加入含 5g溪黄草和 30ml蒸馏水的三角瓶中 , 加
入后放入 55℃的恒温水浴锅中 ,水浴 2 h后取出 ,滤纸过滤 , 滤渣
按上法处理。
2.4　抑菌活性的检测 指示菌种活化后用无菌生理盐水制成
106 ～ 107 cfu/ml菌悬液。
取 0.2 ml菌悬液涂布于牛肉膏蛋白胨或 PDA培养基上 , 静
置 10min。
待测样品用无菌毛细吸管吸取管长的 1/3后 ,滴于直径为 5
mm的无菌滤纸片上 , 每个平板上贴 3片 , 分别做两个平行。
95%乙醇作对照。
将贴了滤纸片的平板放入恒温培养箱中 , 静置 30 min后倒
置培养 ,大肠杆菌和白葡萄球菌培养 24h取出 ,黑曲霉和青霉培
养 48h后取出 , 用游标卡尺测量其抑菌圈直径。
·2200·
时珍国医国药 2010年第 21卷第 9期 LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH2010VOL.21NO.9
3　结果
3.1　微生物发酵对溪黄草抑制细菌生长的影响 从表 1可知溪
黄草对白葡萄球菌的抑制作用比对大肠杆菌的抑制作用明显。
经枯草杆菌发酵和未经枯草杆菌发酵的溪黄草醇提物对细
菌都具有一定的抑制作用 ,其中经枯草杆菌发酵后溪黄草的抑菌
效果反而降低。表 2结果发现发酵过程中枯草杆菌的生长会受
到溪黄草的抑制 ,另外用溪黄草提取物直接进行平板试验 , 对枯
草杆菌的抑菌直径为 5.50mm, 也证实溪黄草对枯草杆菌生长的
抑制。但不添加其他营养(I)时枯草杆菌仍然生长 , 证明枯草杆
菌能利用溪黄草成分。枯草杆菌发酵会降低溪黄草的抑菌效果 ,
可能是由于枯草杆菌在发酵过程中分解利用了抑菌有效成分或
使抑菌有效成分降解。
表 1　发酵溪黄草的抑菌效果 mm
实验组 对大肠杆菌抑菌直径枯草杆菌 JY-LZ乳酸菌 美乐多乳酸菌 干酵母
对白葡萄球菌抑菌直径
枯草杆菌 JY-LZ乳酸菌 美乐多乳酸菌 干酵母
Ⅰ 5.29 — — 7.52 6.22 — — 7.61
Ⅱ 5.59 5.21 5.15 5.37 6.61 6.19 6.15 6.08
Ⅲ 5.46 6.64 6.44 7.26 6.20 6.50 6.48 8.04
Ⅳ 5.57 5.20 5.23 5.47 6.65 6.18 6.21 6.07
Ⅴ — 7.51 6.78 — — 7.04 6.84 —
　　表中 “— ”表示无抑菌圈 ,表中抑菌圈直径含滤纸直径 5mm
　　采用 JY-LZ乳酸芽孢杆菌和美乐多乳酸菌对溪黄草进行
发酵 , 由于同属于产乳酸菌 ,其结果相似。不含溪黄草的 V具有
很强的抑菌作用 , 说明乳酸菌本身含有大量抑菌物质 , 其中 JY-
LZ乳酸芽孢杆菌的抑菌作用更强。从发酵过程两种乳酸菌的生
长看(见表 2),无培养基(I)几乎不增长 , 有培养基又有溪黄草的
生长也较慢 , 平板试验证实溪黄草对 JY-LZ乳酸芽孢杆菌和美
乐多乳酸菌有一定抑制作用(抑菌直径分别为 5.10 mm和 5.21
mm), 结合发酵后的抑菌效果 , 认为发酵中乳酸菌难以利用溪黄
草成分生长 , 但溪黄草抑菌成分可被乳酸菌分解或与其代谢产物
反应成为无抑菌效果的物质 ,因此乳酸菌发酵使溪黄草的抑菌效
果减弱。
表 2　微生物发酵后的菌落数 cfu· ml-1
实验组 枯草杆菌 JY-LZ乳酸芽孢杆菌美乐多乳酸菌 酵母菌
Ⅰ 6.47×107 3.68×107 4.72×107 2.70×1010Ⅲ 7.00×107 5.82×107 1.01×108 2.83×1010Ⅴ 8.28×107 1.08×108 1.08×108 3.55×1010
发酵前 2.63×107 2.00×107 3.87×107 2.63×1010
从表 1可以看出 , 酵母菌发酵后溪黄草的抑菌效果大大加
强 , 但与乳酸菌不同 ,酵母菌本身不含抑菌物质 ,因此发酵后其抑
菌物质仍来源于溪黄草。 溪黄草对酵母菌生长的抑制作用也比
对大肠杆菌和白葡萄球菌的抑制作用强(d=6.29 mm), 因此不
论有没有添加培养基 ,酵母在含溪黄草中培养时基本不增长 ,但
发酵前后可以检测出活酵母菌 , 说明了在发酵过程中 ,酵母菌能
生长。根据上述结果 , 认为经酵母菌发酵后溪黄草的抑菌效果增
强的主要原因是由于酵母菌存在使溪黄草提取物中抑菌有效成
分增加。
3.2　微生物发酵对溪黄草抑制霉菌生长的影响 经枯草杆菌 、乳
酸菌和酵母菌发酵的溪黄草醇提物作用于黑曲霉和青霉菌都没
有产生明显的抑菌圈 ,这和其他文献报道的溪黄草的醇提物对霉
菌抑制效果不明显 [ 2]相一致。
经乳酸菌发酵(包括乳酸芽孢杆菌和美乐多乳酸菌)的溪黄
草醇提物对照组Ⅲ和 Ⅴ在平板培养后 , 霉菌的生长不铺过滤纸
片 , 而其他在平板培养后有少量的霉菌在滤纸片上生长 , 说明乳
酸菌醇提物对霉菌也有一定抑菌效果。
利用酵母菌发酵的Ⅴ在培养后霉菌铺过了滤纸片生长 , Ⅱ和
Ⅳ培养后有少量的霉菌在滤纸片上生长 ,而Ⅰ和Ⅲ培养后霉菌的
生长并不铺过滤纸片 ,这可能同样是酵母菌发酵过程使溪黄草提
取物抑菌有效成分浓度更高 ,使其抑制作用更强。
3.3　纤维素酶处理对溪黄草抑菌作用的影响 实验发现溪黄草
醇提前先经过纤维素酶处理 ,其抑制细菌作用较未经酶处理的溪
黄草醇提物有较大增强(表 3)。当纤维素酶用量增加 , 溪黄草的
醇提物的抑菌作用也随之增强。
实验发现经纤维素酶处理的溪黄草的醇提物对于霉菌(包
括黑曲酶和青霉菌)都无明显抑制作用 , 但是经纤维素酶处理后
的溪黄草醇提物 ,霉菌不覆盖滤纸片生长 , 而溪黄草的原药醇提
物则有少量的霉菌在滤纸片上生长。
添加纤维素酶对溪黄草进行预处理后 ,纤维素酶起到了破壁
作用使得溪黄草的抑菌有效成分能够更容易地溶于乙醇中 ,从而
增强了抑菌效果 ,这与其他应用纤维素酶提取中药时的效果一
致 [ 8, 9] 。根据结果 , 进一步推断上述酵母发酵溪黄草使其抑菌作
用大大增强是由于酵母起到了破壁作用 , 使抑菌成分含量增加 ,
同时酵母不会破坏抑菌成分。
纤维素酶是可以由真菌和细菌等微生物在特定的条件下产
生 , 那么利用微生物直接处理中药就可以起到破壁的作用 , 在大
生产中可以降低原料的成本和简化操作。
表 3　纤维素酶处理后溪黄草的抑菌效果
加酶量
m/g
抑菌圈直径 l/mm
大肠杆菌 白葡萄球菌
对照 5.31 6.65
0.010 8 6.40 7.20
0.031 0 6.99 7.75
4　结论
实验结果证实溪黄草对于细菌的抑制效果比较明显 ,对霉菌
有一定的抑制效果。实验结果显示枯草杆菌和乳酸菌不能提高
溪黄草抑菌效果 ,反而会使其抑菌效果下降;酵母菌发酵溪黄草
可使其抑菌作用得到明显提高 , 与用纤维素酶处理效果相似 , 证
明利用合适菌种发酵提高药材有效成分的利用率是可行的。 同
时 , 通过试验证实中药材可以为某些菌的生长提供必要的物质 ,
可用于开发利用药渣 ,充分利用药材资源。
参考文献:
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LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH2010VOL.21NO.9 时珍国医国药 2010年第 21卷第 9期