全 文 ：现代食品科技 Modern Food Science and Technology 2009, Vol.25, No.10
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超声波辅助提取海金沙黄酮及其抑菌效果研究

丁利君，孙俊，周送霞
（广东工业大学轻工化工学院，广东广州 510006）
摘要：为了进一步研究和开发蕨类植物海金沙资源，以海金沙地上部分为原料，确定海金沙总黄酮的最佳提取剂，并通过单因
素试验和三元二次回归设计实验，用 SPSS 软件对数据进行分析处理，得出海金沙黄酮最佳提取条件。结果表明采用 NaOH-乙醇作
为提取剂，超声波辅助提取海金沙黄酮的最佳工艺条件是：NaOH-乙醇做提取剂（NaOH 浓度 0.22%，乙醇浓度 60%），料液比 1 30∶
（g/mL），室温浸提 2 h，超声波功率 338 W 处理 130 s；此条件下，海金沙黄酮的提取率为 8.4%。同时对海金沙总黄酮提取液的抑
菌效果进行了分析，结果表明，海金沙黄酮提取液对不同微生物的抑菌效果不同，对细菌（金黄色葡萄球菌、大肠杆菌）有良好的
抑制作用，对霉菌（黑曲霉、黄曲霉）无抑制作用。
关键词：海金沙，黄酮，超声波，抑菌
中图分类号：TS229；文献标识码：A；文章篇号:1673-9078(2009)10-1212-04
Ultrasound-assisted Extraction of Flavonoids from Lygodium and Its
Bacteriostasis Properties
DING Li-jun, SUN Jun, ZHOU Song-xia
(College of Chemical Engineering and Light Industry, Guangdong University of Technology, Guangzhou510006, China)
Abstract: The flavonoids from Lygodium was extracted with ultrasound-assisted method and the best technological conditions were
determined by single-factor and orthogonal experiments. The results showed that the best extraction agent, ratio of liquid to materials,
temperature, extraction time, ultrasonic power and treatment time were mixture of 0.22% NaOH and 60% ethanol, 1:30(g/mL),
room-temperature(28 )℃ , 3 h, 338 W, and 130 s, respectively. Investigation of the antimicrobial activity of the extract showed that extract
could effectively inhibit the growth of the bacteria, such as Staphylococcus aureus and E. coli., but have little effect on fungus.
Key words: Lygodium, flavonoids, ultrasonic, antimicrobial

海金沙（Lygodium japonicum（Thunb.）Sw.），别
名罗网藤、铁线藤等，海金沙科海金沙属，全草可入
药。现代医学表明，海金沙中含有黄酮等多种生物活
性物质。本文采用超声波辅助提取海金沙总黄酮，并
对提取的技术参数及提取物的抑菌活性进行研究，为
其进一步开发利用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与设备
海金沙，采自广州大学城，干燥制成粉状，备用。
芦丁（上海润捷化学试剂有限公司），生化试剂。
主要设备：JY92-IIN 超声波细胞粉碎机（宁波新
收稿日期:2009-06-08
基金项目:广东省自然基金项目（8185009001000029）；广东省科技厅计划
项目(2008B021100013)
作者简介:丁利君(1965-)，女，教授，主要从事食品化学、食品加工等方面
的教学与研究工作
芝生物科技股份有限公司），VIS-7220N 可见分光光度
计（北京瑞利分析仪器公司）。
1.2 实验方法
1.2.1 总黄酮的测定[1]
采用芦丁作为标准品，在波长 510nm 处绘制芦丁
标准曲线，并作线性回归，得芦丁标注曲线的回归方
程式为：y=0.952x-0.0052，R2=0.9993。其中 x 是吸光
度值，y 芦丁含量。
样品的测定：海金沙干燥粉末，浸泡，室温浸提，
过滤，定容。吸取样液到比色管中进行测定。样品总
黄酮提取率计算公式如下：
100
10
% 3
1 ×××
×=
Vm
Vyp

式中：p 为总黄酮类物质提取率（%），y 为从回归方程计
算求得样品中黄酮类物质量（mg），V1为样液定容总体积（mL），
V 为测定取样体积（mL）， m 为海金沙样品投料量（g）。
1.2.2 超声波辅助提取海金沙黄酮的工艺参数的确定
DOI:10.13982/j.mfst.1673-9078.2009.10.004
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分别以影响海金沙黄酮提取的各因素进行单因
素实验研究，确定最佳的工艺条件。
考虑到多种因素及因素之间对海金沙黄酮提取
率的影响，在单因素实验的基础上，以超声波处理时
间、超声波功率、NaOH 浓度三个因素进行三元二次
回归设计，以获得最优化的提取工艺参数。
1.2.3 海金沙黄酮提取液的抑菌实验[2]
供试菌株的制备：将所有供测试的菌种移接入相
对应的试管斜面培养基上，每种接多支重复。细菌置
于 37 ℃恒温培养箱内培养 24 h，霉菌、酵母菌于 28 ℃
培养 48 h。每种菌取 2 支供测试用，其余置 0~4 ℃冷
藏备用。
菌悬液的制备：用接种环挑取一环菌体或孢子放
入50 mL生理盐水（已湿热灭菌）里，充分振摇10 min，
制成菌体悬液备用。
抑菌活性测定（滤纸片法）：将平板底皿以“十”
字形划分成 4 等份（以便对称放 4 个滤纸片），每一等
分都标明代码。再将已灭菌并冷却至 50℃左右的营养
琼脂培养基倒入无菌平皿中，水平放置待凝固用无菌
吸管吸取 0.2 mL 培养的菌液加入到上述平板中，用无
菌三角涂布棒涂布均匀。将已涂布好的，每一等份内
标明一种实验材料液的代码。
用无菌镊子将已在121 ℃干热灭菌20 min后的小
圆滤纸片(直径 6 mm)浸入装有海金沙黄酮的醇提取
液（总黄酮含量 1 mg/mL）的无菌小瓶中，浸泡 15 min
以上。无菌操作将 3 片滤纸片间隔一定距离贴在平板
相应区域，剩余的一个空位贴上浸有无菌生理盐水的
滤纸片作为阴性对照。每菌种做三次平行(注意取出滤
纸片时保证滤纸片所含材料液量基本一致，并在瓶内
壁沥去多余溶液)。
将上述贴好滤纸片的含菌平板倒置放于恒温培养
箱中，细菌在 37 ℃下培养 24 h；酵母菌及霉菌在 28 ℃
下培养 48 h。取出观察并测定抑菌圈的直径，比较抑
菌作用的大小。
2 结果与讨论
2.1 海金沙黄酮提取的单因素实验研究
2.1.1 乙醇浓度对海金沙黄酮提取效果的影响
根据黄酮类化合物特点，选取纯水、不同浓度的
乙醇溶剂来提取海金沙中的黄酮，以选择合适的提取
剂。称取 1.00 g 海金沙样品，加入等体积的不同浓度
的乙醇溶液，室温浸提 3 h，超声处理时间 120 s（超
声波处理功率为 400 W），测定黄酮提取率。图 1 表明，
60%乙醇对海金沙总黄酮的提取率比较高。

图1 乙醇浓度对海金沙黄酮提取效果的影响
Fig.1 Effect of alcohol concentration on extraction of the
flavonoids from Lygodium
2.1.2 料液比对海金沙总黄酮提取率的影响
称取 1.00 g 海金沙样品，分别加入不同体积的
60%乙醇溶液，并于室温浸提 3 h，超声处理时间 120
s（超声波处理功率为 400 W），测定其吸光度，根据
标准曲线计算求得提取率。图 2 可看出，随着料液比
的增大，海金沙总黄酮提取率变大，但从 1∶30 之后
增加缓慢，效果不明显，并且随着料液比的增大叶绿
素干扰影响变大，所以选择料液比为 1∶30。

图2 料液比对提取效果的影响
Fig.2 Effect of liquid-solid ratio on extraction of the flavonoids
from Lygodium
2.1.3 超声波功率对海金沙黄酮提取率的影响
称取 1.00 g 海金沙样品，加 30 mL 的 60﹪乙醇溶
液室温浸提 3 h，分别在不同超声波功率下处理 120 s，
测定黄酮得率。
从图 3 可看出，超声波功率在 300 W 时，增幅明
显，而后提取率没有明显提高，继而有下降趋势。主
要是由于超声波对植物细胞的破碎作用，加速了有效
成分的溶解，但是当随着超声波功率不断增大，对细
胞的破碎作用相应增大，溶解杂质也增加，有效成分
溶解量减少。
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图3 超声波功率对提取效果的影响
Fig.3 Effect of ultrasonic power on extraction of the flavonoids
from Lygodium
2.1.4 超声波处理时间对海金沙黄酮提取率的影响
称取 1.00 g 海金沙样品，加 20 mL 的 60%乙醇溶
液室温浸提 3 h，在 300 W 的超声功率下超声波处理
0~140 s，提取测定其吸光度，计算黄酮得率。从图 4
可知，超声波处理时间在 80~100 s 时，黄酮得率较高。

图4 超声波处理时间对黄酮提取率的影响
Fig.4 Effect of ultrasonic treatment time on extraction of the
flavonoids from Lygodium
2.1.5 粉碎粒度对海金沙黄酮提取率的影响

图5 粉碎度对黄酮提取效果的影响
Fig.5 Effect of crush treatment on extraction of the flavonoids
from Lygodium
称取不同粉碎粒度的样品各 1.00 g，分别加入 30
mL 60﹪乙醇室温浸提 3 h，超声功率 300 W 处理 120
s，研究粉碎粒度对海金沙黄酮提取率的影响。图 5
表明，不同的粉碎度对黄酮的提取率的影响是明显的。
粉碎的粒度越小即目数越大，其黄酮的提取率就越大。
但随着粒度的减小，过滤将变得困难、耗时，滤饼中
残留的滤液过多也会造成有效成分损失，所以海金沙
颗粒的粉碎程度不宜太大，所以，下面的实验选取
60~80 目比较适宜。
2.1.6 浸提时间对海金沙黄酮提取率的影响
称取 1.00 g 海金沙样品（60~80 目），加 30 mL
的 60%乙醇，分别于室温浸提 1~5 h，超声处理 120 s
（功率为 300 W），测定黄酮提取率。图 6 结果表明，
初始 2 h 内，随着浸提时间的延长，黄酮浸出率逐渐
提高，而后，延长时间对浸提的海金沙黄酮提取率影
响变小，差异不显著，故提取时间以 2 h 为宜。

图6 浸提时间对提取率的影响
Fig.6 Effect of extraction time on extraction of the flavonoids
from Lygodium
2.1.7 氢氧化钠浓度对海金沙黄酮提取率的影响
考虑到黄酮物质的性质，称取 1.00 g 海金沙样品
（60-80 目），分别加 30 mL 的不同浓度 NaOH-乙醇的
提取剂[3]（乙醇浓度 60%），于室温浸提 2 h，超声波
处理 120 s（功率为 300 W），测定黄酮提取率。表 1
结果表明，0.2%的氢氧化钠浓度提取效果较好。
表1 NaOH浓度对总黄酮提取效果的影响
Tab.1 Effect of NaOH concentration on extraction of the
flavonoids from Lygodium
NaOH 浓度/% 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5
黄酮得率/% 6.75 6.85 6.90 6.75 6.60 6.50
2.2 超声波辅助提取海金沙黄酮的最佳提取参数
考虑到多种因素对海金沙黄酮提取率的影响，在
乙醇浓度 60%下，料液比 1∶30（g/mL），室温（25-28
℃）浸提 2 h，以超声波处理时间、超声波功率、NaOH
浓度三个因素进行三元二次回归设计（见表 2），并运
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用 SPSS 统计分析软件对表 3 的实验数据进行处理。
表2 海金沙总黄酮提取工艺条件的三元二次回归设计因素水
平编码表
Tab.2 Codes and levels of a three-factor quadratic regression
equation to extraction of the flavonoids from Lygodium
编 码
X1 (NaOH
浓度/%)
X2(超声处理
时间/s)
X3(超声波功
率/W)
+γ 0.32 192.9 521.5
+1 0.3 180 500
0 0.2 120 400
-1 0.1 60 300
-γ 0.08 47.1 278.5
注: 此实验设计中，查表γ=1.215
表3 海金沙总黄酮提取工艺条件的三元二次回归设计及实验
结果
Tab.3 Codes and levels of a three-factor quadratic regression
equation to extraction of the flavonoids from Lygodium
试验号 X1 X2s X3 Y(黄酮含量/%)
1 1 1 1 1.38± 0.022
2 1 1 -1 1.27± 0.022
3 1 -1 1 1.28± 0.036
4 1 -1 -1 1.10± 0.044
5 -1 1 1 0.90± 0.030
6 -1 1 -1 1.00± 0.008
7 -1 -1 1 0.96± 0.008
8 -1 -1 -1 0.99± 0.006
9 1.215 0 0 1.36± 0.011
10 -1.215 0 0 1.02± 0.005
11 0 1.215 0 1.17± 0.015
12 0 -1.215 0 1.07± 0.006
13 0 0 1.215 1.15± 0.017
14 0 0 -1.215 1.25± 0.009
15 0 0 0 1.16± 0.101
结果表明，模型的相关系数 R 为 0.982，相关系
数的平方为 0.964，表明其方程的拟合优度好。方差分
析的 F 值的显著性概率为 0.004 小于 0.05，所以回归
达到显著水平，说明海金沙总黄酮提取率和其各因素
之间存在显著的回归关系，实验设计方案正确，回归
组合设计恰当，回归方程有意义[4]。回归方程为：
Y=1.067+0.145x1+0.03118x2+0.003515x3+0.04x1x2
+0.0525x1x3-0.0175x2x3-0.0144x12-0.0619x22-0.00766x32
分别对方程的 X1、X2、X3 求偏导并令其偏导值
为零，得出各因素的最优试验水平：NaOH浓度0.22%，
超声时间 130 s，超声功率 338 W。此条件下，海金沙
总黄酮提取液黄酮含量为 1.68%，即海金沙干粉末的
黄酮含量为 8.4%。
2.3 海金沙黄酮提取液的抑菌效果分析
分别吸取 0.2 mL 金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、黑
曲霉、黄曲霉稀释液，加入相应的培养皿中进行涂布。
做好平板后，将细菌平板倒置放于 37 ℃的恒温培养
箱中培养 24 h，霉菌则置于 28 ℃的恒温培养箱中恒温
培养 48 h。表 4 结果表明，涂布金黄色葡萄球菌和大
肠杆菌的培养皿中，浸有海金沙黄酮（提取液中总黄
酮含量 1 mg/mL）的滤纸片周围一定范围内不长菌，
即海金沙黄酮提取液对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌有
明显的抑菌作用，且对金黄色葡萄球菌（革兰氏阳性
菌）抑制作用强于对大肠杆菌（革兰氏阴性菌）的抑
制作用。而接种了霉菌的浸有海金沙黄酮提取液的滤
纸片周围也都长满了霉菌，不存在抑菌圈，表明海金
沙黄酮提取液对黑曲霉、黄曲霉等霉菌无抑菌作用。
表4 海金沙黄酮提取液的抑菌效果
Tab.4 Bacteriostasis properties of the extracts from Lygodium
抑菌圈直径 金黄色葡萄球菌 大肠杆菌 黑曲霉 黄曲霉
样品/mm 11.2 9.9 - -
对照/mm - - - -
注：“-”表示没有抑菌圈，没有抑菌效果。
3 结论
综上所述，超声波法辅助提取海金沙总黄酮最优
的工艺条件为：NaOH-乙醇做提取剂（NaOH 浓度
0.22%，乙醇浓度 60%），料液比 1 30∶ （g/mL），室
温浸提 3 h，以超声波功率 338 W 处理 130 s。此条件
下，海金沙黄酮的提取率为 8.4%。该提取液对细菌（金
黄色葡萄球菌、大肠杆菌）有抑菌作用，对霉菌无抑
菌作用。
参考文献
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