全 文 ：(1马 90 年 6 月) 微生物学杂志 (第0 1卷 第 1、2 期)
· 研究报告 ·
庐 山 石韦杭 I 型单纯疙疹病孚的实验研究 ,
郑 民 实
(江西医学院微生物学教研室 , 南昌)
李 文
〔江西省南昌市第三医院 )
摘要 我们使用原代人胚肌皮单层细胞培养技术对庐山石韦抗 I 型单纯疤疹病毒进行了 实 验
研究 . 由结果知 , 同时给药途径 与治疗给药途径的最低有效剂量均为 2 5 o u g / m 1( 抑制病毒对数分 别
为 2 . 5 5士 0 . 2 1和 2 . 5 4士 0 . 2 。 ) , 预防给药途径为 S Oo u g / m l (抑制病毒对 数 为 2 . 0 0士0 . 2 5 ) , 管外
给药途径无 效。
自从细胞培养技术创建以来已日益受 净 , 加入无离子水后隔水煎煮 2 次 , 再经
到普遍重视 〔卜 3〕。 病毒疫苗的接种 , 虽能 过滤 、 除渣和浓缩夕 然后分别配 成 2 5 0 、
预防某些疾病 , 但许多治疗问题 尚 难 解 5 0 0 、 1 0 0 0 、 2 5 0 0 、 5 0 0 0与 l 0 0 0 o u g /m l 的
决 。 鉴于单纯疤疹病毒性角膜炎是一种常 剂量 , 调至 p H 7 . 0 , 经煮沸灭菌 30 分钟 ,
见的传染性眼病 , 病毒在三叉神经内可终 置于冰箱内保存备用 。
身潜伏 , 易导致反复发作 , 甚而致盲间 。
目前有效药物为数过少 〔5〕, 故寻找有效药
物实属必要 。 我们使用细胞培养法对 3 6 6 6
种中草药进行 了实验研究 , 其中发现庐山
石韦具有高效 , 现将结果报告如下 :
材料和方法
1
、 原代人胚肌皮 单 层细胞 人 胚 组
织采自江西省妇产医院 。 取孕妇施行人工
流产术后胎儿的肌肉和皮肤 , 按本室常规
方法 〔“ 〕进行 。
2
、病毒株 I型单纯疤疹 病 毒 ( H S V
一 l) 来自中国药品生 物 制 品 检 定 所 ,
毒株编号 05 21 。 取上述细胞传种与同型抗
血清鉴定无误后 一 40 ℃保存备用 。
3
、药物 从龙骨科 ( P o l y p o d i a e e a e )
植 物 庐 IJ 石 韦 〔 P y r r o s i a s h e a r e r i
( B a k
.
) 〕 的树叶中提取 , 先 将 药 材 洗
朴国家自然科学基金资助项目 掩 : 386 07 21
4
、 药物对细胞无毒界限 的 测定 取
上述各剂量药物 0 . l m l , 分别加入含维持
液 ( 2 %小牛血清一 1 9 培 养液和常用抗
生素 夕 p H 7 . 4 ) 。 . 9二 1的原代人 胚 肌皮单
层细胞培养瓶内 (每个剂量接种 6 管 , 重
复 4 次) , 置于 3 ℃孵育 , 第 7 天观察结
果 , 凡最高剂量不出现细胞破坏则为该药
物的无毒界限 。
与、 药效检浏方式
( 1 ) 药物在病毒感染同时加入 细胞
培养瓶内 (同时给药途径 ) 药物 (。 . l m l)
与病毒 ( o . l m l) 一维持液 (含 2 肠小牛
血清 、 D i f c o 1 9 培养液和常用 抗生素 ,
p H 7
.
2一 7 . 4 ) ( o . s nr l ) 同时加入 细胞培
养瓶内 , 3 ℃吸附 3 小时 ,弃除瓶内液体 ,
经 H a n k s 氏液洗涤 4 次 (每次 2 m l ) 后 再
更换维持液 ( 1 m l) 和橡皮塞 。
( 2 ) 先感染病毒后给 药物 (治疗给药
途径 ) 细胞培养瓶内先感染病毒 (。 . l m l)
微生物学杂志 10卷
一维持液 ( o . gm l ) , 3 3℃吸附 l小时夕 按
上法洗涤 , 再加入药物 ( 0 . l m l) 一维 持
液 (。 . g m l) 后换橡皮塞 。 有些学 者 使用
治疗给药途径检测药效时 , 感染病毒后加
入药物亦可不经洗涤卜 1” 〕。
( 3 ) 先给药物后 感染病毒 (预防给
药途径 ) 细胞培养瓶内先给药物 (。 . l m l)
一维持液 ( o . g m l) , 3 ℃作用48 小时后弃
去药 液 , 用 H a n ks 氏液洗涤 4 次 , 再感染
病毒 ( o . l m l ) 一维持液 ( o . g m l ) , 3 3 cC
吸附 1小时 , 经洗涤再加入维持液 1 m l ,
更换橡皮塞 。
( 4 ) 试管内药物直接作 用 于 病 毒
(管外给药途径 ) 药物 (。 . l m l) 与病
毒 ( o . l m l) 一维持液 ( 。 . 80 1) 先在试管
内 3 3℃作用 2小时 ,再加入细胞培养瓶内,
经吸附 1小时与洗涤后 , 更换维持 液 ( l m l)
和橡皮塞 。
上述各实验使用的病毒是将原液按对
数法稀释 1丁 ’一 1丁 ` , 各稀 释 度 接 种 6
瓶 , 静置于 5 度倾斜的培养架上 , 3 3℃孵
育 7 天 , 隔 日观察特异性细胞病变 (如细
胞肿胀 , 似靶标状 ) , 7 天为终点 。 在细
胞一维持液 、 药物与病毒对照正确的情况
下夕 病毒对照组和药物组的最高稀释度出
现细胞病变对数差 , 即为药物抑制病毒的
对数闭 。 各项实验重复 6 次 , 取见 士 s D
统计结果 。
药效时 , 一般先做体外试验与动物实验 ,
然后再进入临床验证 。 抗病毒药效的实验
室筛选方法有用动物 、 鸡胚和组织培养法
者 , 后者优点是操作简便 、 结果迅速 、 经
济和受非特异性因素的影响较小 , 更适于
大批量药物的筛选 和 抗 病 毒 机 制 的研
究 〔工一 3 , 5〕。 许多细胞 (诸如 : 原代兔 肾 、
人胚肾 、 人胚肌皮 、 人羊膜细胞 ) 对单纯
疤疹病毒高度敏感 , 本实验采取来源丰富
结果与讨论
自从 K a o f m a n 等〔1 7〕首先使用碘昔局
部点眼治疗单纯疙疹病毒性角膜炎获得成
功以来 , 相继有亚磷酞 乙酸 、 环胞昔 、 病
毒哇与无环鸟昔问世 , 这些药物的毒性 、
溶解性和稳定性各有不足之处夕 有些易产
生耐药性 。 为了发掘我国药学遗产 , 寻找
来源广泛 、 毒性低 、 副作用小和 ·抗病毒效
果强的中草药已受到重视 。 在研究抗病毒
的原代人胚肌皮单层细胞 , 病毒经 3 3℃培
养繁殖后效价可高达 1 0 7 , 在低倍 ( < 10
倍 ) 普通光学显微镜下 , 直接观察有无特
异性细胞病变 。 抗病毒药效判定前 , 先作
药物对细胞无毒界限检测 , 因为高浓度药
物的本身毒性 (诸如 : 萎缩 、 脱落或 “ 固
定 ” ) 所致的非特异性细胞病变可使病毒
在细胞 内繁殖受阻 。 经检测庐山石韦的无
毒界限为毛 1 0 0妞 g /m l 。 检测抗 病毒药效
时 , 本实验采用病毒对照组与药物组平行
操作 , , 从而不受固定病毒滴度 波动 的影
响 ,病毒或 /和药物吸附后多次反复洗涤与
更换橡皮塞 , 以便尽量清除维持液内游离
病毒与残存的药液 , 故结果 比较可靠 , 二
者最高稀释度产生细胞病变对数差 ) 2 . 0
(即药物可抑制 10 倍量的病毒 ) 始为 有
效 , 对数越大 , 抗病毒药效则越强帅 。
由结果可见 , 同时给药途径与治疗给
药途径的最低有效剂量均为 25 叩 g / m l( 抑
制病毒对数分别 为 2 . 5 士 0 . 21 和 2 . 54 士
。 . 1的 以及预防给药 途 径 5 。。协g /m l (抑
制病毒对数为 2 . 0 士 0 . 1 5 ) , 庐山石韦对
管外给药途径无效 (见表 ) 。
若按 6 种不同剂 量 ( 25 、 50 、 1 0 、
2 5 0
、
5 0 0
、
1 0 0 0协g /m l ) 药物的均数 来初
步评价不同给药途径时 , 治疗 给 药 途 径
( 2
.
06 ) > (优于 , 下同 ) 同时给药途径
( 1
.
97 ) > 预防给药途径 ( 1 . 0 ) > 管外
给药途径 ( 0 . 06 ) 。 我们从庐山石韦分出
1
、
2 期 郑民实等 :庐山石韦抗 I型单纯疮疹病毒的实验研究 5 7
表 不同给药途径和 剂量 的 庐 山石 韦提取物时 I型单纯 疙疹病毒的抑制对数
X士S D
药物剂量 (林 g/ ml)
给 药 途 径 _ _ __ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _
_ _ _ _ _ _ _
_
_ _ _ _
2 5 5 0 10 0 之5 0 5 00 10 0 0
1
.
0 0士 〕 . 1 4 1 .5 0士户 . 19 2 .5 5士0 .2 13 . 10士 ) .2 8 3 .6 8士0 .2 6嗣
厅 O 1 .乏5土厂 .J 3 1 .8 9士0 . 1习 卫 .5 4士 ) . 19 3 。 16士0 .2 8 3 .5 0士0 , 17
于页 l泛i
管 外
O 0
.
5 0士 0 . 0 3 1 . 2 6士 0 . 0 9 2 . 0 0士0 . 1 5 2 . 2 5士0 . 1 5
0 0 0 0 0 0
.
3 8士0 . 0 5
的一个单体 , 经化学结构鉴定表明为异芒
果贰 ( I s o m a g o i f e r i 。 ) , 治疗给药 途径
的最低有效剂量 5 0件g / m l (抑制病毒对数
为2 . 1 9士 0 . 2 4 ) 、 同时给药途径 2 5卜g / m l
(抑制病毒对数为 2 . 93 士 。 . 1 8 ) 、 预防给
药途径 2 5郎 g / m l (抑制病毒对数 为 2 . 98
土 0 . 4 9 ) , 管外给药途径无效 。
此外 , 我们使用 1 肠庐山石韦滴眼剂
在四家医院收治 10 5例单 纯疤疹病毒性角
膜炎患者 , 其中痊愈 65 例 ( 6 1 . 9肠 ) , 好
转 2 9例 ( 2 7 . 6肠 (和无效 1 1例 ( 10 . 5呱 ) 。
详细的临床疗效观察与研究 ,将继续进行 。
参 考 文
( 1 〕郑民实 : 生物科学动态 ,
〔2 〕 Z h e n g M i n s h i (郑民实 )
献
( 3 )
:
1
,
1 9 6 6
C h 10 M e d
,
s 〔3〕 : 2 0 3
J
.
T
r a d i t i o n a l
I n t e r n a t i o n a l
S y m p
o s i u m o u iy
r a l D j
s o . s e s
S t
r a 士e g 了
a n
d T h
e r a p y
,
I n t e r n a t i o n a l C
o m p a r a 士iv e
V i
r o
l
o g y O
r g a 扛 i z a 亡io n , S e P . 9一 1 4: M o 皿 -
t r e l
,
C
a n a
d
a
,
P E一 6 9 (A b s t r )
f 3 〕 郑民实 : l扣医杂志 , 2 9 ( 8 ) : 6 2 2
1 n t e r n a t i o n a l S y m P
o s 王u m
1 9 8 8
。
今飞比r一粤主
o n
V i
r a
l
D 1
s e a s e s
S t
r a t e g y a n d T h
e r a p了 , I 赶 t e r -
n a * i o n a l C
o
m P
a r at i v e V i r o l o g y o r g a n i z卜
t i o n S
e p
.
9一 1 4 , M o n t r e l , C a n a d a , P E一
6 5 (A b
s t r ) 2 98 5
。
〔 4 〕 金秀英 : 眼科研究 , 3 ( 2 ) : 1 1续 19 5 5。
〔 5 ) 郑民实等: 化学合成药物抑制单 纯疙疹 病毒的
实验研究 , 实用眼科杂志 6 ( 5 ) : 2 70 一 2 71
A b s t r ; 1 9 8 8
.
〔 8 〕蒋毅 、 罗思齐、 郑民实 : 荔枝草活性成分的研究
医药工业 1 5 ( 8 〕: 3 4 5一 3 5 2 , 29 5 5 。
〔了〕 郑民实 : 5。。 种中草药抗 I 型单纯疤疹病毒的实
验研究 , 中医杂志 2 9 ( 8 ) : 6 2 2一 6 2 3 ,
I
n t e r n a t io n a l S y m P
o s i u m o n V i r a l
D i s e a s e s S t r a t e g y a n d T h e r a p y ( Sh
a n g h a i
I n s t i t u 亡e B io l o g y e a l P r o d u e t s & I n t e r n a -
t io n a l C
o m p a r a t i v e V i r o l o g y O r g a n i z a -
t io n )
.
S
e p
.
9一 1 2 , Sh a n g h a l , C h in a P E一 6 5
1 95 8 : 中医杂志 (日本语版 ) 2 9 8 5 : ( 一1 ) : 6 3一
6 6 ; J
.
T r a d i t i o n a l C h i n M e d 。 ( 2 ) : 2 1 5 -
1 1 6
.
1 98 9
.
〔 8 〕 郑民实等: 芒果式与异芒果试的抗 单纯 疙疹 病
毒作用 , 中国药理学报1 0 ( 1 ) : 5 5一 9 0 , 1 9 5 9 ,
I n t e r n a t i o n a l S y m p
o s i u m o n V i r a l
D 1
s e a s e s
s 亡r a t e g y a n d 孔 e r a p y ( S五a n g h a i
I n s t i t u t e B i o l o g i e a l P r o d u e t s
,
& I
n t e r n , -
t i o n a 丈 C o m p a r a t i v e V i r o l o q y o r a n g i z护
t i o n 〕, S e p , 9一 1 2 , S h a n g h a i , C h i n a ,
W
: 一 3 : 1 98 8 · 户华医学杂志 10 ( 1 ) 8 5一 9 〕 ,
1 98 9 ; 。 : 1 9 ( 3 ) : 15 2 ; C h i n M e d J
.
1 0 3
( 2 )
: 1 60一 I c三, 19 0 0 .
( g ) 郑民实等 : 4 72 种中草药抗单纯危疹病毒的实验
研究中西医结合杂志10 ( 1 ) : 6 、 39 一 40 , 1 9 0 .
7 6 微生物学杂志
0 23一 0 6 2
10卷
J
.
T r a d i ti o n a l C li i n M e ds ( 3 〕:
1 0 8 8 ; I n te r n a ti o n a l S y m ps o i u m o n Vi r a l
D is es a es S tr a te g y a n d T h e r a p y ( S h
a n g h a i
I
ns ti t
u te o f B i o l o g i e a l Pr o d u e ts & I n te r -
n a ti o n a l C o m p a r a ti 丫 e Vi r o l o g y o r g a n i z a -
ti o n )
,
S
e p
. 。一 12 , S h a n g h a i , C h i n a , P E一
6 9 1 9 8 8
.
以 。) 罗兴中、 谢程阳 、 郑民实等: 1书金樱子滴眼剂
抗单疙病毒的初步报告一实验研究与临床治疗 (摘
要) 中西医结合 眼 科 ( 3 ) : ` 了一` s , 1 0 5 5 ; 眼
科研究 , 7 ( 1 ) : 4 7一通s , 1 9 5 9 。
( 1 〕 郑民实等 ; 单纯疙疹 病毒斑形 成影响因素的研
究 , 病毒学杂志 ( s ) 2 2一 2 7 , 1 0 5 7 。
( 1 2〕 郑民实等; 中草药抗单纯 疙疹病毒 的研究 , 微
生物学杂志 7 ( 4 ) : i一 5 , 1 95 7题目误印 “ 中草
药抗H B s A g 的实验研究 ” 更正刊于微生物学杂
志 8 ( 1 ) i o B s 。
〔13 〕 Z h e n g M a n s h i e t a l . : E x p e r i m e n t a l
r e s e a r e h o 红 t h e a n t i v 三r a l e f f e o t o f a v i一
e u t a r i n o n t了p e l h e r p e s s i m p t e x v i r u s
( A b s t r )
。
I
n t e r n a t i o 公 a l S y m p o s i u m o f
V i r
u s D i s e a s e s S t r a t e g了 a 公 d T h e r a p了
(S h
a n g h a i I n s t i t u t e o f B i o l o g i e a l P r o -
〔1谧〕
〔15 〕
d u e * s & I
n t e r n a t i o n a l C o m P a r a t i 下 e V i -
r o
l
o g y O
r g a n i z a t i o n )
, g一 1 2 , Sh n g h a i ,
C h 1
n a ,
P E一了。 , 1 0 8 5 。
郑民实等 ; 4叨 种中草药抗单纯疙 疹 病毒的研
究 , 中国医药学杂志 9 ( 1 1) : 5 2 9一 5 3 1 , 1 98 9 。
I n t e r n a t i o n a l S v m p o s i u m o f N a t u r a l
I
o x i n s ( A
e a
d
e m i a S i n i e a
,
C h i n e s e B i 。 -
e
h
e位 i e a l S o e i e t y , G u a n g x i A s s o e i a t i o n
f o r s 。 i e n e e a 几 d T e e h n o l o g y )
,
M a y 2 2一
2 5 , G u i l i n
,
C h i 皿 a , 5 6
,
1 9 8 9
.
Z h
e n g M i n s h i e t a l
.
: E x p e r i m e n t a l i 。 -
v e s t i g a t i o n o f a 红 t i v i r a l a e t i o n o f P r u -
n e
l l
a v u t g a r i s o 么 t y p e 1 h e r p e : 5 1扭 p l e x
v i r u s (A b
s t r 〕、 I 红 t e r n a t i o n a l S y m p o s i u m
0 f N
a t u r a l T
o x i o s
C h i
n e s e B i o e h a m i e a l
( A
e a
d
e 也 i a
S o e i e t y
,
5 i
n i e a
,
G
u a n g x i
A
s s o e i a t i o n
M a y 2 2一 2 5 ,
f
o r S e i e n e e a n d T e e h n l o g y )
,
1 08 。 : G u i l i n , C h i n a , 8 7 。
〔16 ) 胡盛珊 、 汪敬武 、 郑民实; 阿糖腺普眼膏 的研
制 、 现代应用药 学
〔1了〕 K a t f m a 几 H . E . e t
5 8 3
.
19 6 2
。
6 ( 8 )
: 2 6一 2 7 , 1 98 9 。
a
1
.
:
A
r e h O p h t l
l , s了:
E X P E R IM E N T A I
,
I N V E S T I G A T I O N I N T O AN T I V I R A L E F F E C T O F
P Y R R OS I A S H E A R E R I ( B A K
.
) ON T Y P E 1 H E R P E S
5 1M P LE X V IRU S带
Z h e n g M i n s h i
( D
e p a r t m e n t o f M i e r o b i o l o g y
,
J i
a n g x i M e d i e a l e o l l e g e
,
N
a n e
}
, a n g )
L 1 W
e n
(T h
e T h i
r d C i t y H o s p i t a l
,
N
a n e
h
a n g )
Ab ` t r a e t
U s i n g p r i m a r y 一 h u m a n 一 e m b r y o m u s e l e 一 s k i n m o n o l a y e r e e l l s , w e u n -
d e r t o o k a l a b o r a t o r y s t u d y t o a s s e s s t h e a n t i v i r a l e f f e e t o f P y r r o s i a
s h e a r e r i ( B
a k
.
)
o n t y p e 1 h e r p e s s i fn p l e x v i r o s
.
T il e r e s u l t s u n d e r o b -
s e r v a t i o n w e r e a r r a n g e d b e l o w
.
W i t h b
o t h t h e s i m u l t a n e o u s a n d t h e t h
-
e r a p e u t i e r o u t e s o f d r u g a d m i n i s t r a t i o n
,
t h e m i n i m a l e f f e e t i v e d o s a g e
( M E D ) w
a s d e t e r m i n e d t o r e a e h 2 5 0 u g / m l
, w h e r e a s t h e d r u g一 i n il i b i -
t 1n g一 v 1r u s l o g a r y t h m ( D I V L ) y i e l d e d ( 2
.
2 5士 0 . 2 1 a n d ( 2 . 5 4士 。一 9 r e s -
p e e t i v e l y
.
B e s i d e s , u t i l i z i n g t h e p r e v e n t i v e r o u t e t h e M E D y i e l d e d
5 0 0 u g / m l
a n d t h e D I V L g a ; e ( 2
.
0 0士 0 . 1 5 . O n e m p l o y i n g t h e e x t r a t u b e
r o u t e , h o w e v e r
, n o b e n e f i t w h a t e v e r e o u l d b e e x p e r i m e n t a l ly e f f e e t e d
.