全 文 ：收稿日期:2009-03-05基金项目:国家自然科学基金(3987099);香港特别行政区政府创新科技基金(GHP/022/06)作者简介:李立(1969-),男 ,助理研究员 ,博士 ,主要从事肿瘤分子病理及天然药物研究;Tel:13659719817, E-mail:LL524@yahoo.cn。＊通讯作者:梁念慈 , Tel:0759-2388501, E-mail:ncliang@gdmc.edu.cn。
半边旗提取物 5F对 HepG2细胞凋亡
的影响及其机制
李　立 1 ,刘　义1 ,吕应年 1 ,吴科锋 1 ,陈　功2 ,梁念慈 1, 3＊
(1.广东医学院广东天然药物研究与开发重点实验室 ,广东 湛江 524023;2.香港中文大学韦尔斯亲王医
院外科学系 ,香港;3.广东医学院生物化学与分子生物学研究所 ,广东 湛江 524023)
　　摘要　目的:研究半边旗(PsL)提取物 Ent-11α-hydroxy-15-oxo-kaur-16-en-19-oic-acid(5F)诱导的 HepG2细胞凋
亡及其可能机制。方法:通过 MTT法检测细胞活性以研究 HepG2细胞经不同浓度(5 ～ 80mg/L)5F处理 24 h所导
致的 5F细胞毒作用。采用 Hoechst/PI实验定性分析细胞凋亡。采用 Westernbloting实验检测经 5F处理的HepG2
细胞线粒体内 Bax水平及分析 cyto-c与 AIF在胞浆内的水平。结果:通过细胞活性分析证明 , 5F对 HepG2细胞的
细胞毒性随着 5F浓度的提高而增强。 HepG2经 5F处理后 ,可观察到以细胞核凝聚为特征的凋亡细胞。经 5F处
理的 HepG2细胞线粒体内 Bax水平提高 ,胞浆内 cyto-c及 AIF水平增强。结论:5F介导的细胞凋亡涉及线粒体依
赖途径 , 5F可能对人类癌细胞具有诱导凋亡作用 ,尤其是肝细胞癌(HCC)细胞。
关键词　半边旗;细胞凋亡;HepG2细胞;线粒体依赖途径
中图分类号:R285.5　　文献标识码:A　　文章编号:1001-4454(2010)01-0077-04
ApoptosisEffectandMechanismof5FfromPterissemipinnataonHepG2 Cels
LILi1 , LIUYi1 , LVYing-nian1 , WUKe-feng1 , CHENGong2 , LIANGNian-ci1 , 3
(1.GuangdongKeyLaboratoryforResearchandDevelopmentofNaturalDrugs, GuangdongMedicalCollege, Zhanjiang524023, China;
2.DepartmentofSurgery, PrinceofWalesHospital, TheChineseUniversityofHongKong, HongKong, China;3.InstituteofBiochem-
istryandMolecularBiology, GuangdongMedicalColege, Zhanjiang524023, China)
Abstract　Objective:ToinvestigatetheefectofPterissemipinnataL.(PsL)extractEnt-11α-hydroxy-15-oxo-kaur-16-en-19-oic-
acid(5F)-onHepG2celsandexploreitspotentialmechanism.Methods:Cytotoxicityof5FwasstudiedinHepG2celstreatedwithdif-
ferentdosesof5F(0 ～ 80 mg/L)for24 handcellviabilitywasdeterminedbyMTTassay.Toanalyzeapoptosisqualitatively, theHo-
echst/PIassaywasused.ThelevelofBaxinmitochondriafractionof5F-treatedHepG2 cellswasdeterminedbywesternblotting.The
levelsofcyto-candAIFinthecytosolwereanalyzedbywesternbloting.Results:Thecytotoxicityof5FonHepG2cellswaselevated
withtheincreasingof5Fconcentrations, asevidencedbythecelviabilityassay.Theapoptoticcellscharacterizedbycondensedneclei
wereobservedaftertheexposureofHepG2cellsto5F.ThelevelofBaxinmitochondriafractionof5F-treatedHepG2 celsincreased.
Thelevelsofcyto-candAIFinthecytosolof5F-treatedHepG2celsincreased.Conclusion:5Fmediatedapoptosisinvolvesmitochon-
dria-dependentpathwayand5Fmighthaveatherapeuticvalueagainsthumancancercellinesandespecialyonhepatocelularcarcino-
ma(HCC)cells.
Keywords　PterissemipinnataL.;Apoptosis;HepG2 cels;Mitochondria-dependentpathway
　　在许多发育 、生理阶段 ,以及在组织稳态 、免疫
调节过程中 ,细胞凋亡通过调控细胞数量发挥了一
个关键作用 ,而不充分的细胞凋亡则是肿瘤发生 、发
展不可或缺的因素。通过诱导细胞凋亡以抑制恶性
细胞增殖 ,极有可能为肿瘤预防 、治疗提供一个实用
的方法 。哺乳动物细胞主要通过 2条凋亡信号通路
响应凋亡刺激:死亡受体途径及线粒体途径。其中 ,
线粒体途径激活涉及到 Bax转位线粒体及促凋亡因
子释放(如 cyt-c、AIF等由线粒体释放至胞浆),从
而扩大凋亡级联反应 ,并最终导致细胞凋亡。在本
研究中 ,笔者首次检测了细胞凋亡线粒体途径相关
蛋白 Bax、cyt-c及 AIF在半边旗(Pterissemipinnata
L., PsL)提取物 Ent-11α-hydroxy-15-oxo-kaur-16-en-
19-oic-acid(5F)诱导的肝癌细胞株 HepG2细胞凋亡
过程中的表达变化 ,并进一步探讨了 5F影响 HepG2
细胞增殖活性的可能机制。
1　材料与仪器
1.1　细胞株　HepG2,具有野生型 p53的人肝癌
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DOI :10.13863/j.issn1001-4454.2010.01.034
细胞系 ,由本实验室冷冻保存。
1.2 　药品　5F干粉由本实验室(广东天然药物研
究与开发重点实验室)提供(结构式见图 1),经丙二
醇溶解 ,蒸馏水稀释 ,制成丙二醇体积分数为 15%、
5F质量浓度为 1 000mg/L的储备液 ,除菌过滤后冷
藏保存 ,实验时再以培养基稀释至所需浓度 (丙二
醇最终浓度≤1.2%)。
图 1　化合物 5F的结构式
1.3 　主要试剂　RPMI-1640培养基干粉(Sigma公
司);新生牛血清(Hyclone公司);青霉素及链霉素;
胰蛋白酶(Amresco公司);丙二醇;二甲基亚砜 DM-
SO;MTT(Sigma公司 );Hoechst33258(Sigma公
司);溴化丙啶(PI, Sigma公司);蛋白提取试剂盒
(凯基公司);BCA蛋白定量试剂盒(凯基公司);兔
抗 Bax、cyto-c及 AIF多克隆抗体 (博奥森公司);
GAPDH单克隆抗体(凯基公司);辣根过氧化物酶
标记二抗(santa公司);ECL化学发光试剂盒(凯基
公司);PVDF膜(凯基公司)。
1.4 　仪器和设备　YJ-875医用净化工作台(苏州
净化设备公司);CO2恒温培养箱(Precision公司);
ELx800酶标仪(BIO-TEK公司);倒置显微镜(江南
公司);荧光显微镜及成像系统 (Lecia公司);垂直
电泳仪(Bio-rad公司)。
2 　方法
2.1 　细胞培养　人肝癌细胞株 HepG2于含 10%
新生牛血清 、100 U/mL青霉素 、100 U/mL链霉素的
RMPI-1640培养液内 ,在 37 ℃、含 5% CO2的饱和
湿度空气中培养 。
2.2 　MTT法测定肿瘤细胞存活率　当 HepG2生
长面积达细胞培养瓶底面积 80%时 ,以 0.25%胰酶
剥离细胞 ,细胞计数后以培养液调整细胞浓度 ,接种
细胞于 96孔培养板 ,使每孔含细胞 2 000个。细胞
贴壁后换液 ,各实验组添加 5F并使其终浓度分别为
5、10、20、40、80 mg/L,阴性对照组则加等体积培养
液 。实验组每个剂量设 8个平行孔 ,阴性对照组同
样设 8孔。 24h培养后 ,加 MTT染液(MTT终浓度
为 0.5 mg/mL)并继续培养 4h,弃上清 ,每孔加 DM-
SO100 μL,震荡 5min后以酶标仪检测波长 570nm
处光密度 ,计算肿瘤细胞存活率 。
2.3 　观察细胞形态变化　接种细胞于 6孔细胞培
养板 ,当 HepG2生长面积达细胞培养瓶底面积 80%
时 ,以不同浓度 5F(0 ～ 80 mg/L)处理 24 h,并以倒
置显微镜观察细胞形态变化 。
2.4　Hoechst/PI法检测凋亡细胞　接种细胞于盖
玻片 ,细胞贴壁后以不同浓度 5F(0 ～ 80mg/L)处理
24 h。弃去培养液 , PBS洗涤 , 10 μg/mLHoechst
37 ℃孵化 15min;PBS洗涤 , 20μg/mLPI低温孵化
15 min。PBS洗涤 ,荧光显微镜观察凋亡细胞形态
变化 。
2.5　Westernbloting检测线粒体相关蛋白表达　
接种细胞于 6孔培养板 ,细胞贴壁后以 40 mg/L5F
处理 ,于处理 0、1、3、6、12、24 h不同时间点收集细
胞 ,并按照蛋白提取试剂盒所附操作程序提取细胞
线粒体蛋白 、胞浆蛋白及细胞全蛋白 ,为检测 Bax、
cyto-c、AIF及内参 GAPDH的表达做准备 。以蛋白
定量试剂盒测定所提蛋白浓度 ,分装后冷冻保存。
SDS-PAGE电泳 ,转膜;封闭 1 h后加一抗 , 4 ℃孵育
过夜;洗膜后加二抗 ,室温孵育 1h;洗膜 、曝光显影 ,
采用 QuantityOne软件分析目标蛋白表达水平。实
验重复 3次以上。
2.6　统计学处理　采用 SPSS12.0软件系统单因
素方差分析对实验数据进行统计学处理 , P<0.05
认为差异有统计学意义 。
3　结果
3.1　5F抑制 HepG2细胞增殖活性　为了阐明 5F
的细胞毒性 ,本研究利用 MTT分析法检测了 5F对
肿瘤细胞增殖的影响。实验结果显示 , 5F可强烈抑
制肿瘤细胞增殖 ,且其抑制作用随剂量的提高而增
强(表 1,图 2)。
　表 1　5F对 HepG2细胞增殖活性的影响( x±s, n=8)
组别 剂量(mg/L) D(λ)值 生存率 /%
对照组 - 0.370±0.126 100.000
5F 5 0.312±0.029 84.288＊＊
10 0.305±0.021 82.530＊＊
20 0.282±0.030 76.140＊＊
40 0.213±0.013 57.477＊＊
80 0.185±0.010 50.039＊＊
　　注:与对照组比较:＊＊P<0.01
3.2　5F诱导肿瘤细胞发生形态变化 　经不同浓
度 5F处理 24 h后 ,许多细胞出现细胞皱缩现象 ,且
细胞彼此脱离 ,甚至漂浮在培养液中。
3.3　5F诱导肿瘤细胞凋亡　为了确定 5F能否诱
导 HepG2细胞发生凋亡 ,本研究使用了 Hoechst/PI
染色 。与对照组细胞核均呈淡蓝着色相比 , 5F处理
·78· JournalofChineseMedicinalMaterials　　第 33卷第 1期 2010年 1月
后 , 肿瘤细胞呈现出凋亡细胞特有的形态特征:
核浓缩 ,呈亮蓝着色 ,或呈分叶状(图 3)。
图 2　5F对 HepG2细胞增殖活性的影响(n=8)
3.4 　5F上调 HepG2细胞线粒体 Bax、胞浆 cyto-c
及AIF蛋白表达 　为了确定 5F诱导的细胞凋亡是
否涉及到 Bax蛋白转位至线粒体 ,本研究以 Western
bloting法检测了 5F处理后 HepG2细胞内 Bax的表
达水平。实验结果如图 4所示 ,以 0 h时间点处为
对照 ,肿瘤细胞线粒体 Bax蛋白表达水平随 5F处理
时间延长而提高 ,尽管 3、6 h时间点处与对照比较
无统计学差异 ,但随着 5F处理时间延长 Bax表达水
平具有上升趋势 (F=4059.255, Sig.=0.000, P<
0.001);本研究还以 Westernbloting法检测了经 5F
处理的肿瘤细胞内胞浆 cyto-c及 AIF蛋白表达水
平 ,以期进一步确定 5F诱导的细胞凋亡是否与线粒
体途径有关。如图 4所示 ,与 Bax相类似 ,胞浆蛋白
cyto-c及 AIF表达均随着 5F处理时间延长而出现
上升趋势(F=180.269, Sig.=0.000 , P<0.001;F=
700.801, Sig.=0.000, P<0.001)。
图 3　5F处理细胞后 ,通过 Hoechst/PI染色观察凋亡细胞形态特征(20×)
A.5F0 mg/L　B.5F5 mg/L　C.5F10 mg/L　D.5F20mg/L　E.5F40mg/L　F.5F80 mg/L
图 4　HepG2细胞经 5F处理后 , Bax转位至线粒体 , cyto-c及 AIF由线粒体释放至胞浆(n=3)
注:与对照组比较 , ＊P<0.05, ＊＊P<0.01
4 　讨论
　　PsL又名半边莲 、半边菊 ,属凤尾蕨科植物 ,广
泛分布于中国南方各省 ,可用于肝炎 、肠炎及毒蛇咬
伤等疾病治疗。本课题组经多年研究发现 , PsL乙
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醇提取物对多种细胞具有细胞毒作用 ,其中 ,二萜类
化合物 5F显示了较强抗肿瘤活性 。本研究 MTT分
析显示 5F可强烈抑制 HepG2增殖 ,并且在相同时
间内 ,抑制率随着 5F浓度增加而上升 ,具有剂量依
赖性。本结果与先前 5F抑制卵巢癌 、甲状腺未分化
癌 、胃癌及大肠癌等癌细胞株增殖活性的研究结果
类似〔1-4〕 ,提示 5F具有较强的抗肿瘤活性 。而通过
Hoechst/PI染色分析则可清楚地观察到经 5F处理
后肿瘤细胞呈现出凋亡细胞特有的形态特征。尤其
值得注意的是 ,在 Hoechst/PI染色分析中 ,几乎未有
着红色的坏死细胞出现。据此可推测 5F诱导的
HepG2细胞死亡是通过细胞凋亡实现的 。
　　Bcl-2家族包括抗凋亡成员(如 Bcl-2及 Bcl-
xL)及促凋亡成员(如 Bax及 Bcl-xS),目前已有确
凿的证据表明该家族蛋白在调控线粒体通透性及
Caspase激活过程中发挥了重要作用 。细胞凋亡线
粒体途径起始于 Bax转位至线粒体〔5〕 ,并由此可导
致线粒体膜通透性提高 ,进而 cyto-c及 AIF由线粒
体释放至胞浆。在胞浆内 , cyto-c激活 Caspase信号
途径 , 并最终导致细胞发生凋亡〔6〕。 AIF为非
Caspase依赖细胞凋亡影响因子 ,由胞浆转位至细胞
核 ,使染色质凝集 、DNA大规模断片化 ,并导致细胞
死亡〔7〕。在本研究中发现经 5F处理后 , HepG2内
线粒体 Bax蛋白表达提高 ,提示 Bcl-2家族成员参
与了 5F介导的细胞凋亡调控过程。由于 Bax线粒
体转位导致线粒体膜通透性提高 ,故在本研究中可
以观察到经 5F处理后肿瘤细胞胞浆内 cyto-c及
AIF蛋白表达均显著提高 ,提示上述促凋亡因子由
线粒体释放至胞浆 。综上所述 ,在本研究中 , 5F诱
导的 HepG2细胞凋亡与线粒体途径有关 。
　　肝细胞癌 (hepatocelularcarcinoma, HCC)是世
界上最常见癌第 5位 、恶性肿瘤致死原因第 3位 ,其
发病率占原发性肝癌 80% ～ 90%,每年新发病例达
50万 ～ 100万之多 。HCC是一种耐药性较强的肿
瘤 ,到目前为止 ,仍没有确凿证据表明系统化疗可提
高晚期 HCC患者总生存期。为了提高晚期 HCC患
者预后 ,寻找可替代传统细胞毒性化疗药物的探索
极具现实意义。实验已证实许多天然产物具有药理
作用 ,并且具有潜在抗癌应用价值 〔8〕。其中 ,植物
产物被广泛用于药物筛选则是缘于其低毒性及巨大
的药用价值 〔9, 10〕。本研究首次证实了细胞凋亡线粒
体途径参与了 5F诱导的 HepG2凋亡 ,提示 5F具有
治疗 HCC的潜在价值;而 5F最终能否成为抗 HCC
的有力候选药物 ,仍有许多问题需要回答 ,如 5F对
体内 HCC治疗效果如何 ,以及是否需要对 5F进行
适当的结构改造等 。
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