全 文 ：白花丹参的组织培养和植株再生
梁宏伟 1 , 王锋祥 2 , 崔秀伟 3　(1.三峡大学生物技术研究中心 ,湖北省天然产物研究与利用重点实验室 , 湖北宜昌 443002;2.莱芜职
业技术学院生物研究所 , 山东莱芜 271100;3.山东省莱芜市农业科学技术研究所 , 山东莱芜 271100)
摘要　[目的 ] 通过植物组织培养技术快速大量繁殖白花丹参优良品系 ,深度开发利用这一药用植物资源。 [方法] 以白花丹参的幼嫩
叶片和叶柄作为外植体 ,接种至器官发生分化培养基上诱导丛生芽 ,然后作壮苗培养 , 继而生根培养 ,建立一套快速再生体系。 [结果 ]
在MS+6-BA2.0mg/L+NAA1.0mg/L和MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.5mg/L培养基上均能诱导分化大量丛生芽 ,然后转接至MS
+KT1.5mg/L+NAA0.2mg/L继代培养基上做继代、壮苗培养 ,消除玻璃化现象。选取健壮芽苗转接至 1/2MS+IBA0.2mg/L培养
基上生根培养 ,待试管苗上长出数条 2cm长的健壮根系时即可炼苗移栽 ,成活率在 90%以上。 [结论] 建立了一套完整的白花丹参组
培再生体系。
关键词　白花丹参;组织培养;植株再生
中图分类号　S603.6　　文献标识码　A　　文章编号　0517-6611(2009)21-09876-01
TissueCultureandPlantRegenerationofSalviamiltiorrhizaBge.f.alba
LIANGHong-weietal　(BiotechnologyResearchCenterofChinaThreeGorgesUniversity, KeyLaboratoryofNaturalProductsResearch
andDevelopmentofHubeiProvince, Yichang, Hubei443002)
Abstract　[ Objective] TheresearchaimedtopropagateabundantlyexcelentlineofS.miltiorrhizaBge.f.albabyplanttissueculture, and
strengthentheutilizationoftheoficinalplant.[ Method] WiththeleafandleafstalkofS.miltiorrhizaBge.f.albaasexplants, thedifferent
mediumwereusedtoinduceclusteredbuds, strengthenregenerativebudandconductrootinginductionsoastoestablishasetofrapidpropa-
gationsystem.[ Result] ThegreatnumberofclusteredbudwereinducedatMSmediumwithsupplement2.0 mg/L6-BAand1.0 or0.5
mg/LNAA.AndthebudsweretransferredtoMSmediumwithsupplement1.5mg/LKTand0.2mg/LNAAinordertostrengthenbudand
eliminatevitrificationofbuds.Thenrootinginductionwasconductedat1/2 MSmediumwithsupplement0.2mg/LIBA.Theregenerated
plantwasexercisedandtransplantwhentheyoutgrewafew2cmstockyroots.Thesurviveratereachedover90%.[ Conclusion] Awholere-
generationsystemofS.miltiorrhizaBge.f.albawasestablished.
Keywords　SalviamiltiorrhizaBge.f.alba;Tissueculture;Plantregeneration
作者简介　梁宏伟(1976-),男 ,内蒙古赤峰人 ,讲师 ,从事珍稀濒危植
物的濒危机制 、发育机理 、保护和利用研究。
收稿日期　 2009-04-07
　　白花丹参(SalviamiltiorhizaBge.f.alba)是唇形科植
物丹参的变形 [ 1] ,主要分布在山东省莱芜山区。在 《山东中
草药手册 》及《泰山药用植物 》中有过白花丹参的记载 ,白花
丹参与紫花丹参相比较 ,在疗效上有独到之处 ,所以引起了
医药工作者和商家的广泛关注 ,并被逐渐开发利用。目前 ,
白花丹参已作为一个新品种被收录进《山东省中药材标准 》
(2002年版)[ 2] 。医学研究证明 ,该药物有效成分高于 《中国
药典 》中的紫花丹参 ,具有祛痰止痛 、活血通络 、清心除烦的
功效 ,对妇女不孕 、月经不调 、肝脾肿大 、心绞痛等均具有明
显的治疗效果 ,尤其对血栓闭塞性脉管炎有特效。目前白花
丹参的药品开发尚处在基础研究阶段 ,至今少见有关白花丹
参组织培养和植株再生的报道。
1　材料与方法
1.1　材料　以采自温室栽培的白花丹参(Salviamiltiorrhiza
Bge.f.alba)幼嫩叶及叶柄为外植体。
1.2　方法　用洗洁精将叶及叶柄清洗干净后 ,流水冲洗 30
min,然后置于 70%乙醇溶液中浸泡 20 s,再用 0.1%升汞溶
液灭菌 10 min后 ,用无菌水冲洗 5次(以上操作均需轻轻摇
动)。按无菌操作要求将外植体剪切成 0.5～ 1.0cm2小块接
种至器官发生分化诱导培养基上。
1.3　培养过程　将外植体接种至①MS+6-BA2.0 mg/L+
NAA1.0 mg/L;②MS+6-BA2.0 mg/L+NAA0.5 mg/L培
养基上诱导不定芽。培养 3周后 ,将①、②培养基上分化产
生的芽苗转接至③MS+KT1.5 mg/L+NAA0.2mg/L的培
养基上壮苗 ,待芽苗长至 3 ～ 4 cm时剪切单芽茎段做继代培
养。选取继代培养中的健壮芽苗转接至④ 1/2MS+IBA0.2
mg/L培养基上做生根培养 。
1.4　培养条件　以上所用的培养基均添加 0.7%琼脂 , 30
g/L蔗糖(A.R), pH值 5.8。培养温度(25±2)℃,光照时间
12 h/d,光照强度 2 000～ 3 000 lx。
2　结果与分析
2.1　不定芽的诱导　外植体在器官分化诱导培养基上培
养 7 d后 ,叶片外植体切口不同程度卷曲膨大并产生芽点;16
d后切口处形成大量丛生芽 , 40 d时生长至 3 ～ 5 cm高的丛
生芽苗(图 1)。 2种培养基诱导再分化效果相近 ,但部分芽
苗出现玻璃化现象 ,可能是 6-BA浓度偏高所致。该问题在
继代和壮苗培养中可得到解决。
图 1　白花丹参的诱导丛生芽(培养 40d)
Fig.1　TheclusteredshootsinductionofSalviamiltiorhizaBge.f.alba
(下转第 9904页)
责任编辑　金琼琼　责任校对　傅真治安徽农业科学 , JournalofAnhuiAgri.Sci.2009, 37(21):9876, 9904
　 表 2　家鸡胚胎甲基化比例
Table2　Themethylationproportionofchickenembryo %
日龄Dayold
非该两种甲基化位点Methylationlociexceptthesetwokinds
hmC甲基化比例hmCmethylationproportion
Cm甲基化比例Cmmethylationproportion
两种甲基化比例合计Proportiontotaloftwokindsofmethylation
3 360 17.88 15.08 32.96
7 323 20.00 18.48 38.48
12 350 20.76 18.69 39.45
15 299 23.08 24.65 47.73
合计 Total 1 332 20.48 19.30 39.78
　注:因为该方法对于mCmCGG或mCCGG,两种酶都是敏感的 ,即都不
能酶切 ,都无带显示,因而无法检测出来,所以对于非差异位点 ,只
能认为可能为未发生甲基化位点。
　Note:BecausethemethodwassensitivetomCm CGGandmCCGG, it
couldnotbedigestedandhadnoband.Soitcouldnotbedetected.
Fornon-diferentiallocus, thelociwasthoughtashavingnomethy-
lation.
标记表达 ,说明在胚胎发育期间 ,组织形成确实受基因组甲
基化调控的影响 [ 7] 。熊远柱等在国内首次将此项技术用于
家畜基因组 DNA甲基化的研究 ,在杂种优势的预测上 ,验证
了总体甲基化程度与杂种优势无关 ,而特异位点上的甲基化
改变 ,对杂种优势有显著效应这一结论 [ 8] 。徐青等用荧光标
记代替同位素标记的方法 ,提出了家鸡上变异的甲基化位点
数量 ,但种类多这一结论 [ 9] 。
笔者研究发现 , CCGG位点单链外侧的胞嘧啶甲基化和
双链内侧胞嘧啶甲基化的比例共计 39.78%,与现有的报道
基本相符。HpaⅡ与 MspⅠ识别相同的 CCGG序列 ,但它们对基
因组中甲基化的敏感性不同 ,用其处理基因组 DNA,就会产
生甲基化敏感多态性片段 。通常个体基因组带型Ⅰ(CCGG位
点没有发生被检测到甲基化类型)占较大比例 ,而单链外侧
的胞嘧啶甲基化和双链内侧胞嘧啶甲基化 ,更容易倾向哪一
种则没有定论。该研究结果表明 ,二者发生几率基本接近 ,
这与和徐青等对成年家鸡的研究结果较为接近 [ 9] 。但是 ,甲
基化发生也是具有组织特异性的 ,因此下一步研究应该更加
针对不同组织结构 ,不同器官的分化及相关过程中甲基化水
平变化来开展。试验结果同时表明 ,甲基化水平在胚胎发育
中是呈现升高趋势的 ,这和现有的表观遗传胚胎学的观点相
同 ,即 DNA甲基化 ,基因组印记等表观遗传现象在胚胎发育
中都有着的相应的体现 。研究表明 ,当减少 3倍的甲基胞嘧
啶 ,在胚胎干细胞的增殖或生命力中没有出现可探测的影
响;但减少相同量的胚胎 DNA甲基化 ,则会导致异常的生长
发育和胚胎的致死现象。甲基化模式在干细胞发育或早期
胚胎形成时就已建立 ,而且在随后的有丝分裂细胞分化时一
直存在。所以 ,这种甲基化水平递升的结果和表观遗传观点
是符合的 ,也是对这一观点的有力佐证 。但是 ,如果要把研
究具化到表观遗传对性状的调控 ,还需要对具体参与其中的
基因和组织器官特异性甲基化进行进一步研究。
参考文献
[ 1] MARKL, LIANGGM, CHARLESH, etal.Identificationandcharacter-
izationofdiferentialymethylatedregionsofgenomicDNAbymethylation-
sensitivearbitrarilyprimedPCR[J].CancerResearch, 1997, 57:594-
599.
[ 2] XIONGLZ, XUCG, SAGHAIMA, etal.Paternsofcytosinemethyla-tioninanelitericehybridanditsparentallines, detectedbyamethylation
-sensitiveamplilcationpolymorphismtechnique[ J].MolGenGenet,
1999, 261:439-446.
[ 3] XUML, LIXQ, KORBANSS, etal.AFLP-BasedDetectionofDNA
Methylation[ J].PlantMolecularBiologyReporter, 2000, 18:361-368.
[ 4] SANTOSF, HENDRICHB, REIKW, etal.Dynamicreprogrammingof
DNAmethylationintheearlymouseembryo[J].DevelopmentBiol, 2002,
241:172-182.
[ 5] 萨姆布鲁克 J, 弗里奇 EF, 曼尼阿蒂斯 T.分子克隆实验指南[ M].金
冬雁,译.2版.北京:科学出版社 , 1995.[ 6] VOSP, HOGERSR, BLEEKERM, etal.AFLP:anewtechniquefor
DNAfingerprinting[J] .NucleicAcidsResearch, 1995, 23:4407-4414.
[ 7] CHAKRABARTYD, YUKW, PAEKKY.DetectionofDNAmethylation
changesduringsomaticembryogenesisofSiberianginseng(Eleuterococcus
senticosus)[J] .PlantScience, 2003, 165:61-68.
[ 8] 蒋曹德 , 邓昌彦, 熊远.DNA甲基化差异对猪生长性状的影响 [ J] .畜
牧兽医学报, 2005, 36(2):105-110.
[ 9] QINGXU, SUNDX, YUANZ, etal.F-MSAP:Apracticalsystemtode-
tectmethylationinchickengenome[ J].ChineseScienceBuletin, 2005,
50:2039-2044.
(上接第 9876页)
2.2　继代 、壮苗培养　待诱导的芽苗长至 3 ～ 4 cm时剪切
单芽茎段做继代培养。继代培养基中 ,以 KT替代 6-BA并降
低植物激素的浓度 ,使芽苗旺盛健壮生长 ,培养过程中玻璃
化现象逐渐消除。继代培养过程中部分芽苗会生根 ,但不
健全。
2.3　生根移栽　选取继代培养中健壮芽苗转接至生根培
养基上 ,待试管苗上长出数条 2cm长的健壮根系时 ,移至光
线较好的房间内在散射光下炼苗 3～ 5 d,然后移至温室打开
瓶口炼苗 1 d。第 2天用镊子小心地将植株取出 ,用自来水
将根上的琼脂洗去后移栽到经灭菌消毒的蛭石加腐殖土
(1∶1)中 ,搭小拱棚保持湿度 ,注意遮阴和适当通风 ,移栽后
生长良好 ,成活率在 90%以上。
3　讨论
目前 ,用白花丹参开发成的保健食品已大量上市。英国
伦敦大学药用植物研究所还把白花丹参作为治疗老年痴呆
症的重要植物药 。在山东省莱芜市苗山镇已建立白花丹参
种苗基地 20 hm2 [ 2] 。但传统繁殖方法不仅速度慢 ,产量低而
且品质容易退化。通过组织培养来改良其品质 、提高产量 、
离体培养克隆增殖白花丹参优良品系 ,可以快速大量繁殖优
良的白花丹参种苗 ,可望从根本上解决当前白花丹参栽培中
面临的问题和质量控制问题 。
参考文献
[ 1] 李建秀 ,孙秀霞 ,周凤芹,等.山东丹参类药用植物新资源 [ J].山东中
医学院学报 , 1995, 19(3):190-191.
[ 2] 马丽虹 ,翟树林 ,王传杰.白花丹参的开发进展 [ J].中国林副特产 , 2005
(1):72.
9904 　　　　　　　　　　安徽农业科学　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　2009年