全 文 ：中革菊ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第6期2006年6月
泰山白花丹参干叶片高质量DNA的提取
都岗平1，边高鹏2，张媛英1
(1．泰山医学院生物技术教研室，山东泰安271000}2．长治学院生化系，山西长治0460]1)
摘要：目的为了从富台多酚和多糖的泰山白花丹参干叶片中分离出适用于AFLP分析的高质量基因组DNA。
方法 比较了4种DNA提取方法，获得了一种以CTAB法为基础的分离高质量完整DNA的简便、快速方法。
CTAB-freeBuffer清洗，4倍CTAB抽提和固体PVP和VC防止氧化。结果使用该方法从泰山白花丹参干叶片
中分离的DNA：e㈣／A。为1．86，由此法所得的DNA可直接用于AFLP分析。结论该技术可有效地从富含多酚
和多糖的药用植物组织中分离出高质量DNA。
关键词：泰山白花丹参；DNA提取f改良CTAB法
中圈分类号：R286．02 文献标识码：B 文章编号：0253—2670(2006)06—0855—03
IsolationofhighqualitygenomicDNAfromdriedleavesofTaishan
Sairiamiitiorrhizaf．alba
HAOGang—pin91．BIANGao—pen92．ZHANGYuan—yin91
(1．DepartmentofBiotechn0109y，TaishanMedicalCo lege，Taian271000，China；2．Department
ofBiochemistry，ChangzhiCollege，Changzhi046011，China)
Keywords：TaishanSalviamiltio椭izaBungef．a／baC．Y．WuetH．W．Li；DNAisolation
modifiedCTABmethod
DNA分子标记的基础是基于高质量DNA的
提取。能否快速成功提取植物组织DNA以及所提
取DNA质量的高低将直接影响整个实验的成败。
高质量DNA要求高纯度，无蛋白、糖类、酚类、盐类
等杂质污染，高相对分子质量，无降解和有一定的数
量。用作AFLP(amplicationfragmentlengthpoly—
morphism)分子标记模板对DNA的要求就更高“j，
高质量可完全酶切，连接效率高，特异性高，重复性
好，实验结果稳定可靠。如何去除存在于植物药材中
的多酚或多糖两类主要杂质，目前还没有方便实用
的有效方法。
丹参是我国传统中药，具有活血化瘀、通经止痛
的功能。其成熟于叶片富含多酚类，多糖物质，DNA
常受到严重的多酚污染，造成DNA沉淀物难以溶
解或溶液色深，也会结合到DNA上造成DNA的降
解；多糖污染直接影响基因组DNA的限制性核酸
内切酶的酶切效果口]。多酚类、多糖物质的污染会造
成AFLP酶切连接等后续实验效果差，甚至后续
PCR没有扩增产物。因此，丹参干叶片DNA提取的
关键是除去多酚类、多糖物质。
白花丹参SalviamiltiorrhizaBungef．albaC．
Y．WuetH．W．I。i为丹参的白花变型，主要分布
于山东境内，其他地区较为少见，属珍稀濒危药用植
物。白花丹参除具有丹参的生物活性和用途外，对治
疗血栓性脉管炎具有独特疗效o]。本实验以泰山白花
丹参凉干的成熟干叶片为材料，以CTAB常规方法
作对照，采用高盐低pH法和改良CTAB法两个处
理，来摸索一种适合大量丹参成熟干叶片DNA提取
的有效方法，为后续AFI。P分析奠定基础，同时也可
很好地保存山东特有的泰山白花丹参种质资源。
l实验材料
样品为2004年7—9月在泰山采集白花丹参的
成熟叶片，凉干保存1个月。
CTAB(上海生物工程技术有限公司)，VC(北京
鼎国)，SDS(上海生物工程技术有限公司)，PVP(上
海生物工程技术有限公司)，口mercaptoethanol(E海
生物工程技术有限公司)，Taq酶(Takara)，AFLP
corereagentki (invitrogen，CatNo1084—016)。
PTc—loo基因扩增仪(MJ公司)，AllegrarM
64RCentrifuge离心机(Beckman)，DNA离心真空
干燥器(Savant)，EC600—90(E—CApparatus公司)
高压电泳仪。
鉴鍪是智：篙禁薯≮蹉药管理局资助项目(2。05—234)；泰山医学院博士科研启曲基金项目(2004年)
作者简介3蓑掌乏蠹蠹?瓦；i嘉；山西E-临m盘A：!i：三裂n教g授@1’主63要,co从rn事药用植物分子生物学研究。
万方数据
·856· 中革蔼ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第6期2006年6月
2方法与结果
2．1 DNA提取方法及检测结果：采用常规
CTAB；41和高盐低pH法“：。以常规CTAB法作为基
本方法，添加一砦抗氧化剂和提高CTAB的比例，
作为采用改良CTAB法的处理A和处理B法。其中
处理A为提取液中加人VC干粉末30mg(1．5
mg／mg叶片)。处理B(PVP预洗法)为加PVP粉
末(干叶量的10％)，与干叶共同在液氮下研碎。加
入4℃预冷的CTABfree缓冲液(o．2mol／LTris—
C1pH8．0，0．05mol／I。EDTA，0．25mol／L
NaCl，内含4％争mercaptoethan01)，冰上放置10
min，7000r／min(不能太高，否则膜破，DNA损
失)，4C、离心10min，弃上清。然后加VC千粉末
(1mg／mg干叶片)于4×CTAB提取液中，调pH
值为6．0～6．5。
用0．8％琼脂糖电泳和紫外分光光度计测定
A。。。／A。。。的方法判定DNA的质量。
分别采用常规CTAB法、高盐低pH法和改良
的C’I、AB法提取白花丹参成熟十叶片DNA。结果
表明，常规c’rAB法、高盐低pH法，改良CTAB中
的处理A得到的总DNA都呈浅黄色至浅棕色，其
余处理颜色较好(表1)。高盐低pH法，改良CTAB
得到的DNA。／A。比值正常，为1．7～2．0，其余
的方法比值较低(表1)。
表1 4种方法提取白花丹参成熟干叶基因组DNA产率
Table1 GenomicDNAyieldfromdriedleavesofTaishan
S miltiorrhizaf．albayfourextractingmethods
琼脂糖电泳分析说明，常规CTAB法和高盐低
pH法可能蛋白质去除不彻底，点样孔杂质较多；改
良CTAB中的处理A的DNA量少(图1)，说明单
独使用VC时量不能太高；而处理B的DNA量和
蛋白质去除效果均较好。
2，2 AFLP实验分析DNA质量：取250ngDNA
用EcoRI／MseI消化，限制酶切片段经T。DNA连
接酶与接头连接及PCR扩增．变性聚丙烯酰胺凝胶
电泳，银染显色，以构建出重复性好、多态性丰富的
基因组DNAFLP指纹图潜来进一步评价DNA
质量。具体方法参照试剂盒说明书进行。引物组合
为(E—AAG：GAC’IGCGTAC ATTCAAG；
M—CCC：GATAG’ICC7IGATAcC)。将
采用不同方法提取的DNA做AFLP分析，结果见
图2。常规CTAB法、高盐低pH法、改良CTAB中
的处理A得到呈浅黄色至浅棕色的总DNA，AFLP
扩增都没有产物，而改良CTAB中的处理B扩增效
果较好。看来提取液的颜色深度(含有较多酚类物
质)与扩增结果呈明显负相关，文献报道一。去除多酚
类物质效果较好的高盐低pH法并不可行。
1～3CTAB法4～6改良CTAB法的处理
7～9高盐低pH值法10h13改良CTAB法处理B
1--3一normalCTABmethod4-6AtreatedbymodifiedCTAB
method7—9highsaltandlowpHmethod10 l3-Btreated
bymodifiedCTABmethod
图1 4种方法提取白花丹参成熟干叶基因组DNA
电泳固
Fig．tElectrephorogramofDNAextractfromdried
leavesofTaishanS．miltiorrhizaf alba
byfourextractingmthods
图2白花丹参基因组DNA的AFLP分析
Fig．2AFLPAnalysisofgenomicDNAofTaishan
S．miltiorrhizaf．alb
3讨论
植物中的多酚类化合物和多糖对于DNA质量
的影响，是植物分子生物学研究中最常遇到、必须解
决的问题，许多学者对于不同的植物作过研究报
道””]。中药材的特性又使得这一问题更为突出，即
从药材中提取高质量的DNA并非易事。一方面由
于中药材次生代谢物质丰富，细胞裂解后释放的植
物次生代谢产物多酚类化合物易于氧化，氧化的多
酚结合到DNA分子上而导致DNA降解，因此难以
从富含多酚的植物组织中分离出高相对分子质量
!
aⅢ蔗聃。黑羔兰法≯巍篡=蚺。兰嚣冀翼竺_l罴鬻罴～
万方数据
中草喃ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第6期2006年6月·857·
DNA。PVP可与多酚结合形成复合物，可以有效避
免多酚类化合物介导的DNA降解“”]。另一方面，
多糖的去除也是提取中药材DNA的关键。一般在
材料粉碎之前，先不加细胞膜裂解液，因而DNA尚
未溶出，用一些缓冲液清洗，可除去一些多糖““。
本研究结果显示，只有改良的CTAB法的处理
B可以达到AFLP分析的要求。笔者根据上述多酚
及多糖的物理、化学特性对CTAB法作了如下改
进：提高CTAB的浓度(4×CTAB缓冲液)以尽可
能破碎细胞壁、细胞膜，使核酸与蛋白质完全解离，
并有利于CTABDNA复合物形成；对于含多酚类
较多的植物，增加cTAB提取缓冲液中}
mercaptoethanol(提高到4％)，以固体形式加入
VC，防止多酚类物质氧化，同时以固体形式加入
PVP使其与多酚类物质结合形成复合物。
通过对普通CTAB法改进以后，笔者从保存一
个月的泰山白花丹参成熟干叶片中提取到高质量的
DNA，DNA的电泳结果表明，DNA的纯度和产率
都比较理想。由于本实验是为了给后续研究利用
AFLP法分析丹参道地性奠定基础，因此采用
AFLP分析对分离的DNA质量作了进一步的评
价，即使用EcoRl／MseI消化DNA和随后的限制
酶切片段经T。DNA连接酶与接头连接及PCR扩
增，结果扩增出可重复的PCR产物(实验重复3
次)。结果表明，该技术可有效地从富含多酚和多糖
的药用植物组织中分离出高质量DNA。
使用此方法时应该注意：PVP和VC都以固体
形式加入最好，不能事先配成储存液，否则会与空气
中的氧发生作用而失去效果，且VC和PVP配合使
用。PVP与样本共研后，要用预冷的清洗液，并在冰
上放置一段时间，也是防止氧化的手段。加VC后溶
液的pH值会下降到pH4～5，这样的条件下，
CTAB的提取效果不佳，必须将提取液的pH值调
到接近中性pH6～6．5。
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(1．江西天施康中药股份有限公司，江西鹰潭335000f2．中国医学科学院
中国协和医科大学药用植物研究所，北京 100094)
健儿糖浆由萝蘼和爵床两味药材组成，具有消
疳化积、行气活血、消肿解毒的功效，用=P／bJL疳积。
制剂原标准中只有爵床药材的薄层色谱鉴别，无定
量测定项。为了更好地控制本品的质量，笔者参考文
牦萼品羿：孥誓甚=：‘l矗5)，男，江西余江人．高级工程师．主要从事新药研发，科研管理工作。，rel：(07。1)6215。。5
*通讯作者杨美华Tel；(010)62899730E—mail：yangmeihual5@hotmailcorn
万方数据
泰山白花丹参干叶片高质量DNA的提取
作者： 郝岗平， 边高鹏， 张媛英， HAO Gang-ping， BIAN Gao-peng， ZHANG Yuan-ying
作者单位： 郝岗平,张媛英,HAO Gang-ping,ZHANG Yuan-ying(泰山医学院,生物技术教研室,山东,泰安
,271000)， 边高鹏,BIAN Gao-peng(长治学院,生化系,山西,长治,046011)
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2006,37(6)
被引用次数： 21次

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