全 文 ：·34· Chinese Journal of Information on TCM Feb.2006 Vol.13 No.2
小红参含药血清对链球菌抗原刺激小鼠的
免疫药理学研究
戴 军 1,邓学端 2
(1.济宁医学院,山东 济宁 272013；2.昆明医学院,云南 昆明 650031)
摘要：目的 利用血清药理学实验方法,评价小红参含药血清对链球菌抗原刺激小鼠的免疫药理学效应,初步
探讨小红参治疗银屑病的作用机制。方法 利用β溶血型链球菌的超声破碎抗原为刺激物,观察小红参含药血清对
链球菌致敏小鼠脾脏淋巴细胞的增殖活性,以及对小鼠腹腔巨噬细胞分泌一氧化氮(NO)的影响。结果 醇提物各剂
量组以及水提物高剂量组与空白血清组比较有显著性差异,均对链球菌抗原致敏小鼠的 T 淋巴细胞增殖具有抑制
作用。醇提物高、中剂量组以及水提物高剂量组与空白血清组比较有显著性差异,均能抑制链球菌抗原致敏小鼠的
腹腔巨噬细胞 NO 的分泌水平。结论 小红参含药血清能够明显抑制 T 淋巴细胞对链球菌抗原的增殖作用；小红参
含药血清可以抑制链球菌抗原诱导的小鼠腹腔巨噬细胞 NO 的分泌。
关键词：小红参；银屑病；血清药理学；链球菌；免疫调节；一氧化氮
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304(2006)02-0034-03
Serum Immunopharmacological Assessment of Effects of Rubia Yunnanensis on Murine Immune
Cell Stimulated with Streptococcal Antigens DAI Jun1, DENG Xue-duan2 (1.Jining Medical College, Jining
272013, China；2.Kunming Medical College, Kunming 650031, China)
Abstract：Objective Serum pharmacological assessment：the effect of Rubia yunnanensis extract
on the immune function stimulated by superantigens of streptococcus. Methods Using cell culture
technique, mouse spleen lymphocytes and peritoneal macrophages were culture with superantigens
of streptococcus and serum of Rubia yunnanensis. Lymphocytes proliferation stimulated by
superantigens of streptococcus measured by MTT assay. NO level in mouse peritoneal macrophages
affected by Rubia yunnanensis at different concentrations were determined and compared. Results
Serum of Rubia yunnanensis significantly inhibit the proliferation of lymphocytes stimulated by
superantigens of streptococcus, compared with normal control. NO content of macrophages culture
in Rubia yunnanensis extract group were lower than those of control. In these tests, the effect of
the extract by alcohol is more obvious than that of extract by water. Conclusions Rubia yunnanensis
extract has effect in inhibiting immune function and anti-infect activity, it could be applied in
clinical practice for immunoregulation and treatment of psoriasis.
Key words： Rubia yunnanensis ； psoriasis ； serum pharmacology ； streptococcus ； NO ；
immunoregulation
小红参(Rubia yunnanensis)为茜草科植物云南茜草的
根及根茎,主要分布于昆明、鹤庆和丽江等地,为云南特产药
材,可作为茜草的代用品。小红参味微甜,苦,性微温,有活血
通络、祛风除湿、镇静镇痛、止咳、止血作用,主要用于风寒
湿痹、跌打损伤、月经不调等症,在云南民间广泛应用[1]。临
床上已用小红参制剂治疗银屑病等病取得了较好效果。
银屑病的发生与链球菌感染有关已被人们所知。研究表
明[2],链球菌感染不仅是急性银屑病的诱发因子,也是银屑病
慢性持续存在的刺激因素。链球菌感染引起的银屑病,一般认
为是由细菌毒素引起的超敏反应,特别是一些超抗原物质。为
进一步研究及开发小红参新药,了解小红参及其提取物治疗
银屑病的抗感染机制,特别是针对链球菌的感染,我们应用血
清药理学方法以链球菌悬液作为抗原物质作用于淋巴细胞和
巨噬细胞,了解其对链球菌抗原的反应,以期从实验中探讨小
红参抗链球菌感染后的银屑病发病机制。
1 实验材料
1.1 动物
昆明种小鼠,雌雄各半,8～10 周龄,体重 18～20 g,购自

1993,13(7)：143－145.
[8] 杨卫东,朱鸣泉,赵保路,等.丹参的氧自由基清除作用[J].中国药理
学通报,1990,6(2)：118－121.
(收稿日期：2005-04-21,编辑：华强)
2006 年 2 月第 13 卷第 2期 中国中医药信息杂志 ·35·
昆明生物研究所实验动物中心。
1.2 主要仪器与设备
CO2 恒温培养箱,美国 shellab 生产；酶标仪,日本
Bir-Rad 产；电子天平,Mettler Toledo 公司产；可调式移液
器,Thermolabsystems 公司生产。
1.3 药物及试剂
小红参水提物和醇提物,昆明医学院药学院植物化学实
验 室 加 工 完 成 ； RPMI-1640 MEDIUM,Hyclone 公 司 ；
Convanavalin A,Sigma 公司；MTT,AMRESCO 公司；小牛血清,
郑州佰安生物工程有限公司；β溶血型链球菌,本教研室微生
物实验室提供。
2 实验方法
2.1 分组
含药血清的制备：昆明种小鼠 60 只,随机分成生理盐水
组(即空白血清组)、小红参水提物组、小红参醇提物组。
小红参治疗银屑病的抗感染机制研究：昆明种小鼠 16
只,随机分成2组,每组8只,分别为链球菌抗原致敏组和非致
敏组。
2.2 小红参提取物血清的制备[3]
按照 30 g/(kg·d)剂量灌胃给药,给药 2 次,末次给药后
1 h 无菌取血。空白血清组灌服生理盐水。含药全血离心 10
min (3 000 r/min),收集血清,经 0.45 µm 滤膜过滤除
菌,-20 ℃保存待用。
2.3 β溶血型链球菌抗原的制备
链球菌菌体抗原的制备[4]：β溶血型链球菌接种于 10%
羊血培养平皿,37 ℃,24 h,用适量 0.4%甲醛生理盐水冲洗刮
下菌苔,移入无菌三角瓶,置 37 ℃水浴 24 h。上述菌液作无
菌检验合格后,用生理盐水稀释成5×108/mL(McFarland氏标
准比浊管比浊定量),即成链球菌菌体抗原,4 ℃保存作致敏
小鼠用。
链球菌超声抗原悬液的制备[5]：β溶血型链球菌接种于
10%羊血培养平皿,37 ℃,24 h,用适量 0.4%甲醛生理盐水收
获细菌于生理盐水中；并洗涤 3 次,4 ℃,离心(3 000 r/min)
15 min；McFarland 氏标准比浊管比浊定量。超声破碎直到
涂片后显微镜观察细菌已破碎。破碎后的液体 4 ℃离心 30
min(15 000 r/min),取上清,保存于-20 ℃贮存备用。
2.4 链球菌抗原免疫小鼠
以制备的链球菌菌体抗原为刺激物,按表 1 方案进行小
鼠致敏[4]。
表 1 小鼠致敏过程
免疫日程(d) 项目
1 3 5 10
剂量(mL) 0.2 0.3 0.4 试验
途径 腹腔注射 腹腔注射 腹腔注射
2.5 致敏小鼠脾脏淋巴细胞对链球菌抗原的增殖反应
含药血清的淋巴细胞转化试验采用 MTT 法。无菌取小鼠
脾脏,制备单个细胞悬液,调细胞浓度 5×106/L。分别加淋巴
细胞悬液 100 µL/well 于 96 孔培养板,每孔加入β溶血型链
球菌超声抗原悬液 106/mL,分别加入含药血清(含药血清与正
常血清的比例为 1∶0、1∶1、1∶2)共同孵育。每孔设 3 个
复孔,并设空白血清对照、无血清对照和无链球菌抗原悬液对
照。在 37 ℃、质量分数为 5% CO2的环境下培养 68 h。培养
结束后,每孔轻轻吸弃上清液 100 µL,然后加入 MTT(5
g/mL)10 µL,继续培养 4 h。培养结束后,离心 96 孔培养板,2
000 r/min 离心 10 min。弃去上清液,每孔加入 DMSO 100 µL,
在平板振荡器上振荡 1 min,静置 10 min,待紫色颗粒完全溶
解,570 nm 下用酶标仪测 OD 值。
2.6 致敏小鼠腹腔巨噬细胞 NO 分泌的检测[6]
消毒小鼠皮肤,解剖暴露腹膜,向每只小鼠腹腔注射无菌
PBS 缓冲液 5 mL,轻轻按揉腹部 3 min,在腹膜剪一小口,用毛
细吸管吸取腹腔液。离心腹腔液(1 500 r/min),共 10min,
PBS 缓冲液洗涤 3 次,用完全 RPMI-1640 培养液调终浓度 4×
106,分别加入 96 孔板 100 µL/孔。每孔设 3 个复孔。在 37 ℃、
5% CO2的环境下培养 4 h,弃去上清,以预温的 PBS 缓冲液洗涤
3次,然后加入β溶血型链球菌抗原悬液106/mL,分别加入含药
血清(与正常血清的比例为 1∶0、1∶1、1∶2)共同孵育。24 h
后,取上清液-20 ℃贮存测 NO 用。NO 的测定采用硝酸盐还原
酶耦联法(Grasss 法),按试剂盒步骤操作。
NO 含量(µmol/L)=(测定管吸光度-空白管吸光度)/(标准管吸光度-
空白管吸光度)×标准品浓度(100 µmol/L)×样品测试前稀释倍数
2.7 统计学处理
数据以—x±s表示,采用 SPSS 11.5 统计软件包进行统计分
析,各组间两两比较采用单因素的方差分析。
3 结果(见表 2～表 4)
表 2 链球菌抗原免疫小鼠与未免疫小鼠的比较(—x±s)
组别 n OD 值
未免疫小鼠组 8 0.183±0.009
免疫小鼠组 8 0.192±0.007**
注：与未免疫小鼠组比较,*P <0.05,**P <0.01
表 3 致敏小鼠脾脏淋巴细胞对链球菌超声抗原的增殖反
应(加含药血清)(—x±s,n =8)
组别 OD 值 抑制率(%)
空白血清组 0.818±0.146
水提物血清组(1∶0) 0.716±0.092* 12
水提物血清组(1∶1) 0.792±0.070
水提物血清组(1∶2) 0.752±0.083
醇提物血清组(1∶0) 0.605±0.083** 26
醇提物血清组(1∶1) 0.609±0.063** 25
醇提物血清组(1∶2) 0.704±0.125* 14
注：与空白血清组比较,*P <0.05,**P <0.01(下同)
4 讨论
中药血清药理学是伴随中药复方研究向细胞、分子和基
因水平深入的需要而出现的。血清药理方法具有体外实验易
于控制的特点,在很大程度上可以模拟药物的体内过程。血清
药理方法比传统的体外实验方法有明显优点。第一,中药粗
制剂中含有大量杂质,若直接加入体外反应系统,其渗透
·36· Chinese Journal of Information on TCM Feb.2006 Vol.13 No.2
表 4 链球菌超声抗原诱导致敏小鼠腹腔巨噬细胞 NO 的
分泌(加含药血清)
组别 浓度(µmol/L) 抑制率(%)
空白血清组 10.88±3.22
水提物血清组(1∶0) 7.00±2.50* 36
水提物血清组(1∶1) 8.87±3.52
水提物血清组(1∶2) 9.75±3.61
醇提物血清组(1∶0) 6.37±2.55** 41
醇提物血清组(1∶1) 7.50±2.77* 31
醇提物血清组(1∶2) 9.25±3.15
压、pH、鞣质、无机盐等许多非特异性理化因素会严重干扰
实验,产生假阳性或假阴性结果,故其科学性难以得到认可。
第二,中药口服后其有机成分在胃肠内会受到消化液和肠道
菌微生态转化,中药中的有效成分不一定就是在体内直接发
挥作用的成分,这就使中药直接作用于体外实验的价值更加
重要。
在小红参抗链球菌感染后银屑病作用机制的研究中,我
们以小红参血清药理学实验为基础,利用链球菌抗原刺激致敏
小鼠免疫细胞为模型。首先,用链球菌的菌体抗原来免疫小鼠,
使小鼠获得对链球菌抗原的免疫应答,通过这种方式模拟银屑
病患者的链球菌感染。研究表明,经过一系列免疫致敏,免疫小
鼠与未免疫小鼠比较,其淋巴细胞对链球菌超声抗原的增殖显
著性提高。张氏等[7]通过实验证实,链球菌抗原中存在超抗原
成分,可以使淋巴细胞异常增殖,释放大量炎症细胞因子,从而
导致皮肤角质形成细胞的增生。经过超声处理的链球菌抗原中
含有一些对Vβ亚型T淋巴细胞有刺激作用的超抗原成分,使T
淋巴细胞产生类似丝裂原反应的多克隆增殖。研究发现,这些
细菌的细胞壁凸出约40～60 nm呈丝状的具有特征性的M蛋白,
这种 M 蛋白呈卷曲的α螺旋结构,由几个几乎完全相同的氨基
酸序列的串联重复。链球菌 M 蛋白和 I型角蛋白之间存在很多
相同序列,这些蛋白片断序列具有明显的交叉反应性,其中 M5
蛋白有明显的有丝分裂原活性,能刺激人类 T 细胞 Vβ2、Vβ4
和 Vβ8增殖。所以,链球菌超声抗原可以诱导小鼠 T淋巴细胞
大量增殖,实验也证实了这一点。
小红参抑制链球菌抗原刺激的免疫细胞活性是通过小红
参含药血清、链球菌超声抗原和免疫细胞共同培养实现的。
实验结果表明,小红参含药血清能够抑制 T 淋巴细胞对链球
菌超声抗原的增殖作用,其中醇提取物含药血清的作用更明
显,抑制率最高达到 26%。这些说明小红参含药血清中含有抑
制 T 淋巴细胞增殖的成分,醇提取物血清的含量更高一些,这
可能与醇提取物蒽醌含量较高有关(已有实验证明蒽醌类化
合物可以抑制 T 淋巴细胞的增殖[8])。
近年发现,银屑病皮损可由外毒素超抗原活化 T 细胞而
引起。特殊的 T 细胞克隆能对链球菌的 M 蛋白和皮肤角蛋白
发生反应。把银屑病患者未累及的皮肤移植到 SCID 小鼠上,
然后给小鼠皮内重复注射细菌性超抗原,同时把患者血中的
单核细胞在小鼠腹膜内注射,结果引起表皮过度增生,真皮有
T 细胞浸润等银屑病样反应。已证明选择抑制 T 细胞的制剂
对于治疗银屑病是非常有效的,如环胞素(Cyclosporin)、
FK560 和 CD4+T 细胞单克隆抗体。小红参抑制 T 淋巴细胞对链
球菌超抗原的增殖作用,说明小红参能通过抑制 T 淋巴细胞
增殖,减少炎症细胞因子的释放,从而缓解银屑病病灶的炎症
反应。
Th 细胞根据分泌细胞因子的不同又分为 Th1和 Th2细胞,
银屑病主要是由 Th1/Th2 细胞的失衡造成的,其中 Th1 细胞被
大量活化。小红参可能主要抑制 Th1细胞的增殖,但需要进一
步实验证实,可以进一步研究小红参对 T 细胞亚群的影响,如
IFN-γ、IL-4 等 Th 细胞特异性细胞因子的分析。
小红参含药血清还可以抑制链球菌抗原诱导的小鼠腹腔
巨噬细胞 NO 的分泌。巨噬细胞在抗原的诱导下活化,发生呼
吸爆发,产生大量的超氧阴离子和炎症介质,其中包括 NO。近
年来对 NO 在炎症及免疫性疾病中的作用进行了广泛研究[9],
银屑病患者血浆和皮损NO水平显著高于正常,过多的NO可导
致血管扩张和炎症介质的释放。通常认为银屑病皮损处的炎
症细胞表达 iNOS 增加,进而催化 NO 生成。实验结果表明,小
红参可能通过抑制 NO 的分泌缓解皮损的症状,并可以调节炎
症局部的免疫状态。同样,小红参醇提取物含药血清高剂量组
的抑制作用较强,有更重要的开发价值。
小红参在细胞和分子水平抑制免疫炎症反应,从作用机
制上可以调节银屑病患者的免疫功能异常,但要获得更有说
服力的证据,仍需建立更好的银屑病病理模型或直接研究银
屑患者的免疫细胞,这也是本课题下一步努力的方向。而且,
作为药物开发,对其作用机制和有效成分还要进行深入的研
究,特别是分子水平的研究。
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(收稿日期：2005-04-05,编辑：华强)