全 文 ：2007年9月第45卷第13期
泰山白花丹参对人脐静脉内皮细胞氧化应激损伤的保护作用
焦 鹏 1 王 云 1 李福荣 2 叶文静 1 赵晓民 1 夏作理 3
(1.泰山医学院生命科学研究所;2.科研处;3.微循环重点实验室,山东泰安 271000)
[摘要]目的 研究泰山白花丹参对血管内皮细胞氧化损伤的保护作用。方法 体外培养人脐静脉内皮细胞株 ECV304,在培
养液中预先加入不同浓度(0、0.3、0.6、0.9g/L)的白花丹参制剂后,以 0.001%过氧化氢诱导内皮细胞损伤,通过光镜观察细胞
形态,以四甲基偶氮唑蓝比色法检测细胞存活数量,用流式细胞仪 AnnexinV/PI双染法检测细胞凋亡变化。结果 血管内皮
细胞受到氧化损伤后,细胞存活率明显降低,而预先加入白花丹参制剂可改善上述结果,它能抑制 H2O2引起的血管内皮细
胞减少,降低凋亡细胞比例。结论 泰山白花丹参对内皮细胞氧化应激损伤有保护作用。
[关键词]白花丹参;内皮细胞;过氧化氢;损伤;保护作用
[中图分类号]R282.71;R361.3 [文献标识码]A [文章编号]1673-9701(2007)13-14-03
ProtectiveEffectofTaishanSalviaMiltiorrhizabge.f.albaonCultivated
HumanUmbilicalVeinEndotheliumCelsOxidativeStressInjuryCausedby
HydrogenPeroxide
JIAOPeng1WANGYun1LIFurong2YEWenjing1ZHAOXiaomin1XIAZuoli3
1.BasicMedicalResearchInstitute;2.ScientificResearchDepartment;3.KeyLaboratoryofMicrocirculatory,TaishanMedicalColege,Shandong
Taian271000
[Abstract]ObjectiveToobservetheprotectiveefectofTaishanSalviamiltiorhizabge.f.albaoncultivatedendotheliumcelsoxidativestress
injurycausedbyhydrogenperoxide.MethodsECV304werecultivatedinvitroandTaishanSalviamiltiorhizabge.f.albamixtureofdiferent
concentration(0,0.3,0.6,0.9g/L)wereaddedintocultivatedmedium,then0.001%H2O2inducedcelinjury.Changesofcelularmorphologywere
detectedwithmicroscope.TherelativesurvivalrateofthecelsineachgroupwasexaminedbyMTTmethod.Flowcytometrywasusedtodemon-
strateapoptoticchanges.ResultsComparedwiththecontrol,H2O2decreasedtheproliferativeactivitysignificantlyandincreasedtherateofcel
apoptosis.Salviamiltiorhizabge.f.albaalteredtheabovementionedresults,restrainedthereductionofendotheliumcelcausedbyhydrogenper-
oxide,decreasedtherateofcelapoptosis.ConclusionSalviamiltiorhizabge.f.albamixturecanprotectendotheliumcelsfromoxidativestress
injurycausedbyH2O2.
[KeyWords] Salviamiltiorhizabge.f.alba;Endotheliumcels;HydrogenPeroxide;Injuries;Protectiveefect
白花丹参是山东特有珍奇物种,主要分布于泰山及其周边地
区,属珍稀濒危药用植物。医学研究证明,白花丹参的药物有效成
分远高于《中国药典》中的紫花丹参。在临床上,丹参是具有活血化
瘀活性的常用中药,在治疗心脑血管疾病中有重要意义[1]。内皮细
胞是造血诱导微环境的重要成分之一,在造血调控中起重要作用。
血管内皮细胞结构和功能紊乱与心血管疾病间的关系是目前国际
上普遍关注的研究课题。自由基、活性氧、脂质过氧化物、过氧化氢
等均可引起内皮细胞的损伤[2]。本研究在培养人脐静脉内皮细胞株
ECV304的基础上,用过氧化氢诱导其损伤,采用噻唑蓝(MTT)比
色法结合流式细胞仪分析检测泰山白花丹参对内皮细胞的作用。
1 材料与方法
1.1材料
白花丹参(产自泰山);人脐静脉内皮细胞株 ECV304(购自
中国典型培养物储藏中心);DMEM培养基(Gibco);新生牛血清
(杭州四季清公司);30%过氧化氢(国药集团化学试剂有限公司);
二甲基亚砜(DMSO)、噻唑蓝(MTT)(均购自 Sigma公司);Annexin-
Ⅴ-FLOUSstaining试剂盒(Roche公司)。
1.2 方法
1.2.1白花丹参制剂的制备 取 100g自然干燥的白花丹参根,剪切
成碎块,加1L双蒸水,以温水浸泡4h。文火第1次煎2h,收集煮
剂,再加双蒸水 1L,第 2,3次各煎 1.5h,合并煎液,200目滤网过
滤,5000r/min离心 10min,收集上清液,旋转蒸发仪蒸馏煮剂至
100mL,-20℃～-60℃冰冻煮剂后,冷冻干燥机干燥约 19h后大
约得到50g样品。每次用时称取适当样品,用无血清培养液溶解
制成各种不同浓度的白花丹参制剂,0.22!m滤膜过滤后,4℃冰
箱避光储存备用。
1.2.2细胞培养 选用人脐静脉内皮细胞株 ECV304,于含新生牛血
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清浓度为 100mL/L的 DMEM培养基中,在恒温培养箱中以
50mL/LCO2、37℃及饱和湿度条件下培养,每2～3天换液 1次,
当细胞80%融合时传代。
1.2.3 实验分组 将体外培养的 ECV304随机分为 3组:(1)正常
对照组(n=5):无血清培养液+ECV304;(2)过氧化氢处理组(n=5):
0.001%H2O2+无血清培养液 +ECV304;(3) 白花丹参处理组
(n=5):不同浓度白花丹参制剂与 ECV304共同培养 24h后,加入
终浓度0.001%H2O2继续培养。
1.2.4MTT法检测细胞存活数量 单细胞悬液以每孔 5×103个细胞
100mL接种于 96孔培养板中,贴壁 24h后分别按以上分组处
理,24h后弃原培养基,各孔加入含 0.5mg/LMTT的培养液,再继
续培养 4h,弃去上清,每孔加 DMSO200!L,充分振荡 30min,溶
解MTT沉淀物,490nm测定每孔的吸光度 A值[3,4]。 计算细胞相
对存活率:相对存活率=实验孔A值/对照孔A值×100%[5]。
1.2.5流式细胞仪检测细胞凋亡 按分组处理细胞,24h后将漂浮细
胞和用胰酶消化下的细胞 5×105,PBS洗涤 2次,1000r/min离心
5min后去上清,将细胞重悬于100LAnnexin-Ⅴ-FLOUSstain-
ing染色试剂中,室温下避光孵育 20min,立即进行流式细胞仪检
测,实验重复1次。
1.3 统计学处理
用SPSS11.5统计学软件和t检验处理数据,所有数据均用
(χ±s)表示。
2 结果
2.1 形态学指标
倒置显微镜下动态观察可见正常组细胞生长状态好,细胞
呈梭形或圆形,紧密贴壁,呈铺路石状生长,细胞折光性好,分裂
相多。过氧化氢损伤组可见细胞形态明显不规则,细胞缩小变
圆,可见局部细胞融合,坏死细胞崩解现象,坏死细胞较多。白花
丹参处理组细胞形态明显好于过氧化氢损伤组,0.9g/L组细胞形
态趋近正常组。
2.2 白花丹参对人脐静脉内皮细胞株ECV304细胞存活率的影响
与正常对照组比较,过氧化氢显著抑制 ECV304增殖 (P<
0.01),使内皮细胞活性明显下降,白花丹参处理组内皮细胞活性
明显高于过氧化氢处理组(P<0.01),见表1。
表1白花丹参对内皮细胞株ECV304细胞存活率的影响
分组 吸光度(A值) 存活率(%)
空白对照组 0.902±0.059 —
过氧化氢处理组 0.309±0.015# 34.30±1.66
白花丹参处理组(0.3g/L) 0.398±0.061*# 44.10±6.76
(0.6g/L)0.601±0.063*# 66.60±6.98
(0.9g/L)0.722±0.053*▲ 80.00±5.88
注:*与过氧化氢处理组比较,P<0.01;#与空白对照组比
较,P<0.01;▲与空白对照组比较,P<0.05
2.3 流式细胞仪检测细胞凋亡
0.001%H2O2与内皮细胞孵育 24h后,与正常对照组比较能
明显诱导细胞凋亡,而用不同浓度白花丹参预处理后,能不同程
度的抑制H2O2引起的细胞凋亡及损伤(图1)。
3讨论
近年来国内外在活血化瘀类中药对血管内皮细胞作用的研
究方面进展迅速,活血化瘀类中药在调节血管内皮细胞的多种功
能中抗脂质氧化损伤作用和抗凝、促进纤溶功能尤为突出。内皮细
胞损伤是血管损伤的初始阶段,因此保护内皮细胞功能是预防血
管性疾病发生的关键。在引起内皮细胞结构及功能障碍的诸多因
素中,有关氧化应激、氧化损伤的作用正受到广泛的关注[6,7]。过氧
化氢参与诱导细胞凋亡、降低细胞增殖活力的作用已在多种细胞
得到验证,其机制与促凋亡基因p53、bad、CED23等上调相关[8,9]。
本研究以山东特有珍奇物种泰山白花丹参为研究对象,在
H2O2诱导的内皮细胞凋亡模型基础上,采用 MTT法、流式细胞
术检测泰山白花丹参对内皮细胞凋亡的影响,结果发现,白花丹
参呈浓度依赖性的提高内皮细胞活性,降低内皮细胞凋亡比例,
说明白花丹参能有效拮抗H2O2诱导的内皮细胞凋亡,对临床治
疗心脑血管类疾病具有潜在的应用价值,为进一步开发白花丹
参这一珍奇的植物物种资源的应用价值提供基础资料。
图1流式细胞仪AnnexinV/PI双染法检测内皮细胞凋亡
A:正常对照组;B:过氧化氢处理组;C:0.3g/L白花丹参处理组;D:0.6g/L
白花丹参处理组;E:0.9g/L白花丹参处理组。
PI-/AnnexinV+,活细胞;PI-/AnnexinV+,凋亡早期细胞;PI+/AnnexinV+,凋
亡晚期和坏死细胞;PI+/AnnexinV-,机械死亡细胞。
[参考文献]
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(收稿日期:2007-06-11)
配制的碱性电泳缓冲液 500mL(1mmol/LNa2EDTA,300mmol/L
NaOH)中,静置 20min,使断裂的 DNA碎片在强碱的条件下,从
DNA的超螺旋结构中释放出来。然后在 12V,100mA条件下,于
4℃上电泳40min。
1.2.4.5 中和、染色 用 PH7.2PBS浸洗 3次,每次 15min。取出
胶板,在其表面加 5～15!L/20mLEB水溶液染色,再盖上盖玻
片。于4℃、避光、潮湿条件下保存,15min后,用PBS清洗后阅片。
1.2.5结果处理及统计分析
检测结果,先用 CASP(CometAssaySoftwareProject)软件进
行测定,以均数±标准差(χ±s)表示,采用 t检验进行统计学处
理,用SPSS10.0进行统计分析。
2 结果
表1胸腺细胞SCGE测定结果
组别 细胞数量 胸腺细胞尾长(m)
正常组 20 3.12±0.72▲▲
模型组 20 56.67±18.40
维生素E组 20 46.29±11.20▲
低剂量组 20 45.60±13.50▲★★
中剂量组 20 37.62±11.67▲▲☆★★
高剂量组 20 12.58±9.80▲▲☆☆
注:与模型组比较,▲P<0.05,▲▲P<0.01。与维生素 E组比
较,☆P<0.05,☆☆P<0.05;与高剂量组比较,★★P<0.01
实验结果显示:与正常组比较,模型组胸腺细胞尾长有显著
性差异(P<0.01)。与模型组比较,中、高剂量组胸腺细胞尾长均
有显著性差异(P<0.01),维生素 E组和低剂量组与模型组比较
有差异(P<0.05),与维生素 E组相比,高剂量组胸腺细胞尾长
有显著性差异(P<0.01),中剂量组有差异(P<0.05),低剂量组
无差异。与中剂量组比较,高剂量组有显著性差异(P<0.01)。
3 讨论
近年来由于细胞生物学、分子生物学等学科的迅速发展,推
动了衰老机理的微观研究,在分子水平的研究促进了衰老机理的
日趋深化。荷兰科学家们研究了能使人体机能紊乱的一种携带
变异基因 XPD的小鼠,表明受损伤的 DNA使转录过程不能正常
进行,从而使关键的基因钝化,最终导致细胞死亡。DNA的损伤与
衰老密切相关。DNA分子中遗传信息的完全正确,对机体生命的
维持十分重要。但随年龄的增加,DNA的修复能力却下降[4]。DNA
修复能力的下降会影响机体的衰老。中药对于 DNA修复、合成
能力有着影响,刘群良等[5]研究由枸杞、杜仲等补肾中药组成的
抗衰延寿方具有拮抗环磷酰胺损伤 DNA的作用,并能提高 DNA
的修复能力。此外,许多单味补肾健脾中药也能促进DNA损伤的
修复能力或合成能力,如口服枸杞子可以显著提高老年人 DNA
修复合成能力;何首乌可明显提高大鼠外周淋巴细胞 DNA损伤
的修复能力[6];人参可促进大鼠肝、肾、骨髓、睾丸等器官和组织
中的DNA、RNA和蛋白质的生物合成。
单细胞凝胶电泳,也称彗星实验,是在单细胞水平进行 DNA
损伤和修复检测的荧光检测方法,具有简单、快速、灵敏、原位等
特点。细胞经过裂解、解旋、电泳后,断裂的 DNA会在电场力的
作用下从核内移出,荧光染料染色后,在荧光显微镜下,可观察
到受损细胞核的彗星状图像。通过对该图像进行测量与计算机
图像分析即可判断单细胞水平上的DNA损伤程度。
本实验结果表明,正常组胸腺细胞虽有很短尾长,但并未表
现为彗星样拖尾,提示正常组胸腺细胞DNA氧化损伤较少。中、
高剂量组和西药对照组的胸腺细胞尾长与模型组比较均有显著
性差异,且中药高剂量组作用强于维生素E组。提示脾肾双补法
可以减少衰老模型小鼠胸腺细胞彗星拖尾长度,对 DNA氧化损
伤具有一定的拮抗或修复作用,并存在一定的量效关系,说明脾
肾双补法延缓模型小鼠衰老的作用可能与其对 DNA氧化损伤
的拮抗或修复作用有关,但其对 DNA氧化损伤起作用的具体机
制尚待进一步研究探讨。
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