全 文 ：◎研究原著 ◎ 中国临床药理学与治疗学中国药理学会主办
CN 34-1206 R , ISSN 1009-2501
E-mail:ccpt96@21cn.com
2006 Apr;11(4):402-405
2006-02-10收稿　2006-03-22修回
国家自然科学基金资助课题(№39870900)和广东省科委重大科技攻
关项目(№9622007002)
戴滨 ,男 ,硕士 ,主治医师 、讲师 ,研究方向:抗肿瘤药理学。
Tel:0759-2388588-3 E-mai l:daibinsanmei@vip.sina.com.cn
崔燎 ,女 ,博士 ,教授 ,硕士生导师 ,研究方向:骨药理学和抗肿瘤药理
学。
Tel:0759-2388405 　 E-mai l:cuiliao@163.com
半边旗提取物 5F对 SPCA-1细胞周期
及 DNA 、RNA合成的影响
戴 滨 ,崔燎 ,吴 铁 ,邓亦峰1 ,吴科锋1
广东医学院药理教研室 ,湛江 524023 ,广东;1广东天然药物研究与开发实验室 ,湛江 524023 ,广东
摘要　目的:观察半边旗提取物 5F 对 SPCA-1细胞
的抑瘤作用及对细胞周期 、DNA 、RNA 合成的影响 。
方法:用 MTT 法观察 5F 对 SPCA-1细胞的抑瘤作
用;流式细胞术分析细胞周期变化;[ 3H] -TdR 和
[ 3H] -UTR 掺入法观察 5F 对 SPC-A-1 细胞 DNA 、
RNA合成的影响。结果:5F 对 SPCA-1细胞有显著
抑制生长作用;在一定剂量 5F 作用下 SPCA-1 细胞
表现为 G1 期明显减少 ,而 G2 和 S 期相对增多;5F
作用 24 h后细胞[ 3H] -TdR和[ 3H] -UTR掺入量明显
减少 。结论:半边旗提取物 5F 具有体外抗肿瘤活
性;干扰肿瘤细胞的周期;对肿瘤细胞 DNA 、RNA 合
成有抑制作用。
关键词　半边旗;二萜类化合物;SPCA-1;细胞周期;
DNA合成
中图分类号:R730.5;R730.23
文献标识码:A
文 章 编 号:1009-2501(2006)04-0402-04
半边旗(Pteris semipininnata L ,PsL)属凤尾蕨科
植物 ,民间常用于治疗蛇伤 、外伤出血 、菌痢 、肠炎 、
肝炎等[ 1] 。本课题组在筛选抗肿瘤植物药时发现 ,
半边旗的乙醇及水提取物显示良好的体内外抗肿瘤
活性[ 2 , 3] ,随后从醇提物中分离纯化得到 5个成分:
4F 、5F 、6F 、A 及 B[ 4] 。经体外研究证明 5F 、6F 、A有
抗肿瘤活性 ,而 4F 、B无此作用[ 5-7] 。本文旨在用体
外研究方法观察半边旗提取物 5F 抗肿瘤活性及对
肿瘤细胞周期 、DNA 、RNA合成的影响 ,探讨其可能
的抗肿瘤机制。
1　材料与方法
1.1　药物　半边旗有效成分 5F 原料药 ,由天然药
物研究与开发实验室邓亦峰老师提供 ,药物为白色
结晶 ,其中5F 含量46%,其余为4F ,药物中不含 6F。
半边旗有效成分的提取:半边旗全草 5 kg ,洗净风
干 ,以体积分数为 95%的乙醇回流提取 3 次 ,合并
提取液 ,减压浓缩至原体积的 1 3 ,上活性碳柱 ,以
EtOH-CHCl3(10∶1)洗脱 , 减压浓缩得淡黄色固体
120 g 。取此固体 10 g ,经硅胶柱层析 ,以氯仿-甲醇
系统分段洗脱 ,在 CHCl3-CHCl3OH(90∶2 ～ 90∶6)洗脱
部分 分别 得到 6F (99.7 mg)、 B(60 mg)、 4F
(80.7 mg)、5F(9.5 g)及A(200 mg)。
1.2　瘤株与试剂 　SPCA-1 瘤株来自中山医科大
学 ,本教研室传代 。5-氟脲嘧啶(5-FU),上海旭东海
普药业有限公司生产;RPMI-1640培养基购自 Gibco
公司产品;新生小牛血清购自杭州四季青生物材料
公司;胰酶购自中国医药集团上海化学试剂公司。
[ 3H]胸腺嘧啶脱氧胸苷([ 3H]-TdR)、[ 3H] 尿嘧啶核
苷([ 3H]-UTP)购自上海原子核研究所;碘化丙啶
(PI)购于 Sigma公司 。
1.3　SPCA-1 细胞培养 　癌细胞贴壁培养于含
10%灭活小 牛血清 、1 ×105 U·L-1 青霉 素和
100 mg·L-1链霉素的 RPMI-1640 完全培养基中 ,置
37 ℃,5%CO2 饱和湿度孵箱内培养 。细胞经
0.25%胰酶分散传代和收获 , 取对数生长期细胞进
行实验 。
·402·
1.4　半边旗提取物 5F对 SPCA-1细胞的抑瘤作用
MTT 法参照 Hanse 等[ 8] 的方法 。取对数生长期细
胞 ,以台盼蓝染色 ,要求活细胞数大于 95%,以 7×
10
8
L
-1活细胞数接种于 96孔培养板中。待其完全
贴壁后 ,更换含不同浓度药物的 1640 完全培养基
100 μl·well-1 , 继续 培养 24 、 48 、 72 h 后 , 加 入
5 mg·L-1 MTT 试剂 20μl·well-1 , 孵育 5 h ,吸去培
养基 ,加二甲亚砜 150μl ,待其完全溶解后 ,用酶标
仪测定吸光度(A)。按公式计算细胞生长抑制率 ,
药物半数抑制浓度 IC50按改良 Karber公式计算。实
验重复3次 。
细胞生长抑制率=〔1-给药组吸光度(A)〕 对照组
吸光度(A)×100%
1.5　半边旗提取物 5F对 SPCA-1细胞周期的影响
药物处理细胞 24 h 后 ,收集对照组及给药组细胞 ,
1 000×g离心 5 min ,细胞团用 PBS 洗涤 2次 ,迅速
注入冷的体积分数为 70%乙醇中 ,4 ℃固定 24 h 以
上 ,1 000×g 离心 5 min ,去除乙醇 , PBS 洗涤 1次 ,
细胞团悬浮于 0.6 ml PBS 中 ,加 1.4 ml 碘化丙啶
(内含 0.05 mg·L-1 RNase), 避光染色 30 min , 用
Coulter EPTCSXL-31240流式细胞仪测定细胞DNA含
量并分析细胞周期。
1.6　[ 3H] -TdR 、[ 3H]-UTP掺入实验　药物处理细
胞 24 h 后 ,收集对照组及给药组细胞 ,计数细胞数 ,
用预冷的 PBS洗涤 ,每组分成 3份 ,各组重新悬浮在
1 ml含[ 3H] -TdR(终浓度为 3.0×107Bq·L-1)、[ 3H]-
UTP(终浓度为 3.0×107 Bq·L-1)的 RPMI-1640培养
基中 ,于 37 ℃孵育 2 h ,用质量浓度为 100 g·L-1三
氯醋酸沉淀细胞 。用多头细胞收集仪收集细胞于
Whatman玻璃纤维滤膜上 ,多次洗涤后 ,烘干滤膜 ,
加闪烁液 ,于 Beckman液体闪烁计数仪上计数测量
每组 cpm。
2　结果
2.1　提取物 5F对 SPCA-1 瘤株的抑瘤作用　药物
作用后在相差显微镜下观察 ,细胞皱缩 ,变圆 ,从培
养板上脱落下来 ,随着时间的延长逐渐发展为细胞
膜破裂 ,细胞溶解。表 1结果显示提取物 5F对肿瘤
细胞有明显的抑制作用 ,并且呈剂量 、时间依赖关
系 ,对 SPCA-1瘤株24 、48 、72 h 的 IC50分别是 100.9 、
52.0 、25.5 μmol·L-1 。
2.2　提取物 5F对 SPCA-1 细胞周期的影响　药物
作用 24 h 后低浓度(3.125 、6.25μg·ml-1)的 5F 对
细胞周期无显著影响(P >0.05), 中间浓度
(12.5 μg·ml-1)的 5F 对细胞周期影响明显 ,表现为
G 1期明显减少 ,而 G2 和 S 期相对增多(P <0.01)。
但随着浓度的增加对细胞周期的影响又逐渐减小 ,
表现为G 1期又逐渐增多 ,与空白对照组相比仍有差
异(P<0.05)。G2 和 S期有逐渐减少的趋势。
表 1　提取物5F对 SPCA-1瘤株的抑瘤作用
药物 药物浓度 μmol·L-1
抑瘤率 %
24 h 48 h 72 h
　5F 149.7　 47.4 75.0 85.3
74.9 32.8 61.7 76.2
37.4 23.6 36.4 69.9
18.7 9.2 16.2 43.0
9.4 0 7.1 28.5
IC50 97±15 54±5 26±4
5-氟脲嘧啶 385 25.9 61.5 89.0
192 23.6 54.3 80.2
96 21.8 44.5 60.3
48 15.8 39.2 56.3
24 15.5 34.0 53.6
IC50 267±19 108±25 52±12
表 2　提取物5F对 SPCA-1细胞周期的影响(x±s , n=12)
药物浓度
μg·ml-1 G1 % G2 % S %
0 66.1±0.9 11.1±1.1 22.8±0.2
3.125 67.3±1.4 11.2±0.3 21.4±1.8
6.25 67.7±0.4 12.6±1.3 19.6±1.0
12.5 34.9±2.0c 31.5±0.5c 33.6±1.4c
25 52.2±4.7c 23.7±6.9b 24.1±2.8
50 58.0±3.0b 14.9±1.0c 27.0±2.0b
与空白对照组比较cP<0.01, cP<0.01
2.3　提取物 5F对 SPCA-1细胞 DNA和 RNA合成
的影响　药物作用 24 h 后肿瘤细胞 DNA合成量明
显减少 ,具有明显的剂量依赖关系。药物作用 24 h
后剂量较高组 RNA 合成量减少 ,作用较其对 DNA
弱 。
表 3　提取物5F对 SPCA-1细胞 DNA合成的影响(x ±s , n
=12)
药物浓度
μg·ml-1
细胞数
×105
Cpm
×103
Cpm 5×105
×103
0 4.3 8.1±0.4 9.4±0.4
0.781 5.8 8.3±0.3 7.2±0.3c
3.125 4.2 5.2±0.3 6.2±0.3c
12.5 4.8 4.5±0.9 4.7±0.9c
与空白对照组比较cP<0.01
·403·中国临床药理学与治疗学 2006 Apr;11(4)
表 4　提取物 5F对 SPCA-1 细胞 RNA 合成的影响(x±s , n
=12)
药物浓度
μg·ml -1
细胞数
×105
Cpm
×103
Cpm 5×105
×103
0 4.3 15.4±1.3 17.9±1.5
0.781 5.8 19.5±4.1 16.8±3.5
3.125 4.2 13.2±2.2 15.6±2.7
12.5 4.8 11.8±1.3b 12.2±1.3b
与空白对照组比较bP<0.05
3　讨论
该体外试验显示提取物 5F 有较强的抗肿瘤活
性 ,并且成剂量 、时间依赖关系 ,药物作用 24 h 后即
表现出明显的抑瘤作用 , 48 和 72 h 抑瘤作用明显 ,
与阳性药 5-FU 相比 ,提取物 5F 量效曲线陡直 , 而
阳性药5-FU量效曲线则较平缓 ,反应出两药的不同
特点 ,提取物 5F 最低药效浓度大于 5-FU的最低有
效浓度 ,但高药物浓度时提取物 5F 的抑瘤率较 5-
FU高 ,提取物 5F 在 24 、48 、72 h 的 IC50均小于阳性
药5-FU ,表明提取物 5F 在体外有较强的抗肿瘤活
性。
肿瘤细胞在许多方面不同于正常细胞 ,如去分
化 、侵袭性 、药物不敏感性等 ,这些区别不单源于失
控的细胞生长 ,而且来自细胞进化的过程。细胞基
因组完整性的改变 ,是肿瘤发生的物质基础。细胞
周期的监控机制 ———监测点 ,是细胞基因组完整性
的重要保证 。细胞周期的 DNA 复制和染色体分离
过程中 ,受到监测点的精密监控 。以确保前一过程
的完成以及细胞内重要物质如 DNA 是否有损伤[ 9] 。
这些监控机制的破坏将导致遗传的不稳定性 ,它是
所有癌前细胞和癌细胞的本质特征。同时 ,人们也
可以通过影响细胞周期的方法 ,来治疗肿瘤。如长
春新碱 、秋水仙碱等能干扰微管蛋白的装配 ,阻断纺
缍丝的形成 ,使恶性细胞处于分裂中期而不能继续
增殖 。本实验观察到一定浓度的 5F 对细胞周期有
影响 ,表现为 G 1 期明显减少 ,而 G2 和 S 期相对增
多 ,差异显著(P <0.01)。但随着浓度的增加对细
胞周期的影响又逐渐减小 ,表现为 G1 期又逐渐增
多 ,与空白对照组相比仍有差别(P <0.05)。G2 和
S期有逐渐减少的趋势 。目前研究表明细胞内环境
的变化会影响细胞周期 ,短暂的细胞周期停顿为细
胞提供时间修复 ,同时也观察到细胞受损时细胞周
期长久的停顿 ,细胞生长停止[ 10] 。和凋亡一样 ,细
胞周期的停顿对细胞很重要 ,它可以避免受损的
DNA继续复制 ,抑制进一步形成肿瘤。Bhonde的研
究认为在化学治疗作用下细胞周期的停滞与凋亡发
生的机制相同[ 11] 。当DNA受损时 ,有多个途径影响
细胞的监测点 。G1期的停顿是由于在刺激作用下 ,
p53的激活以及其增强子靶基因的转录[ 12] 。P53诱
导的 p21 抑制细胞从 G1 期进入 S 期[ 13] 。当细胞
DNA损伤时 ,细胞停滞于G 2 期 ,虽然非 p53途径启
动这一过程 ,但是 p53在持久G2 期停滞中仍然是必
不可少的[ 14] 。在人类肿瘤细胞中超过 50%的 p53
基因发生突变 ,导致当 DNA发生损伤时细胞周期不
能停滞或凋亡 ,引起 DNA 的不稳定性和肿瘤的发
生[ 15] 。本实验中细胞周期的变化可能与药物抑制
DNA 、RNA合成有关 ,由于药物抑制 DNA , RNA的合
成 ,导致细胞内遗传物质缺乏 ,细胞周期停滞。也有
学者研究发现环境因素会影响细胞周期 ,而细胞周
期的变化又会对 DNA 复制产生影响 ,造成 DNA的
突变[ 16] 。可见 DNA合成受到抑制会影响细胞周期 ,
细胞周期的变化反过来也会对 DNA合成产生影响 。
参 考 文 献
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Effect of compoud 5F isolated from Pteris Semipinnata L on cell cycle and
synthesis of DNA and RNA of SPCA-1 cells
DAI Bin , CUI Liao ,WU Tie ,DENG Yi-feng1 ,WU Ke-feng1
Department of Pharmacology , Guang dong Medical College , Zhanjiang 524023 , Guangdong , China;1Guangdong Key
Laboratory for Research and Development of Nature Drugs , Guang dong Medical College , Zhanjiang 524023 , Guang-
dong , China
ABSTRACT　AIM:To study the effects of compound
5F , one of the diterpenoids extracted from Pteris Semipin-
nata L , on cell cycle and synthesis of DNA and RNA of
SPC-A-1 cells.METHODS:Cytotoxicity was determined
by MTT test , the cell cycle was analysed by flowcytometry
(FCM)and the synthesis of DNA and RNA was observed
by the [ 3H]-TdR and [ 3H ]-UTP incorporation.RE-
SULTS:Compound 5F strongly inhibited the growth of
SPC-A-1cells , FCM analysis revealed that 5F could in-
crease the percentage of cells in G2 and S phase and de-
crease those in G1 phase after 24 h treatment.The assays
of [ 3H] -TdR and [ 3H]-UTP incorporation into DNA and
RNA respectively showed obvious inhibition dose-depen-
dent after exposure to 5F for 24 h.CONCLUSION:
Compound 5F obviously inhibits SPC-A-1cells prolifera-
tion , arrests SPC-A-1cells in G2 and S phase and inhibits
the synthesis of DNA and RNA.
KEY WORDS　Pteris Semipinnata L;diterpenoid;SP-
CA-1;cellcycle;DNA synthesis
·405·中国临床药理学与治疗学 2006 Apr;11(4)