全 文 ：HPLC法同时测定照山白中金丝桃苷、槲皮素和山柰素的含量
王志轩1，2，刘喜纲1，崔小丽2，郑晓英2，刘翠哲1*
收稿日期:2015-10-29
基金项目:河北省高校重点学科建设项目(No．冀教高［2003］4 号)
* 通讯作者:刘翠哲，E － mail:liucuizhexy@ 163． com。
(1．河北省中药研究与开发重点实验室，承德医学院中药研究所，承德 067000; 2． 承德市食品药品检验检测中心，承德
067000)
摘 要 目的:建立高效液相色谱法同时测定照山白中金丝桃苷、槲皮素和山柰素含量的方法。方法:采用 Thermo
C18(250 mm ×4． 6 mm，5 μm)色谱柱;甲醇 －乙腈 － 0． 1%磷酸梯度洗脱;流速 1． 0 ml /min;检测波长 356 nm。结果:金丝桃
苷、槲皮素、山柰素分别在 4． 85 ～ 194． 25、5． 05 ～ 202． 07 和 4． 90 ～ 196． 27 μg /ml范围内线性关系良好;平均加样回收率分
别为 97． 34%、96． 79%和 97． 56%，RSD 分别为 1． 60%、1． 01%和 1． 40%。结论:建立的方法简便、准确、重复性好，可用于
照山白药材的质量控制。
关键词 照山白，金丝桃苷，槲皮素，山柰素，HPLC
中图分类号:R917 文献标识码:A 文章编号:1006-5687(2016)01-0015-03
照山白别名万斤、万经棵，为双子叶植物杜鹃花科
植物小花杜鹃(Rhododendron micranthum Turcz)的枝叶
或花，具有止咳化痰、祛风通络、调经止痛等功效，可用
于治疗急慢性气管炎、哮喘、痛经、产后周身疼痛等病
症［1 － 3］。照山白的主要成分为酚酸类化合物［4］、三萜
类化合物［5，6］以及黄酮类化合物［7 － 9］，其中金丝桃苷、
槲皮素、山柰素等黄酮类化合物含量较高。近年研究
表明，金丝桃苷、槲皮素和山柰素具有抗病毒、镇痛、抗
氧化、抗肿瘤和抗癌等多种药效［10 － 12］。
照山白中黄酮类成分的含量测定方法有分光光度
法、气相色谱法、液相色谱法、毛细管电泳法等［13］。已
有文献报道用 HPLC测定糙枝金丝桃中绿原酸、芦丁、
金丝桃苷、槲皮素和山柰酚的含量［14］，以及用 HPLC
测定宣木瓜中绿原酸、芦丁、金丝桃苷、槲皮素的含
量［15］，但未有文献报道同时测定照山白中金丝桃苷、
槲皮素、山柰素的含量。本实验应用 HPLC 法同时测
定照山白中金丝桃苷、槲皮素和山柰素 3 种成分的含
量，为照山白药材的质量控制提供依据。
1 仪器与试药
1. 1 仪器 Agilent 1260 高效液相色谱仪;电子分析
天平(METTLER TOLEDO XPE26DR)。
1. 2 试药 对照品:金丝桃苷(批号 111521 －
201205，含量 93． 3%)、槲皮素(批号 100081 － 200907，
含量 96． 5%)、山柰素(批号 110861 － 201310，含量
93． 2%) ，均购自中国食品药品检定研究院;照山白药
材分别采集于吉林省通化、河北省滦平、宽城，经河北
省食品药品检定研究院段吉平研究员鉴定为杜鹃花科
植物小花杜鹃(照山白) ;乙腈(Fisher Scientific，美
国) ;甲醇(分析纯，天津市康科德科技有限公司) ;磷
酸(分析纯，天津佳兴化工玻璃仪器工贸有限公司) ;
水为娃哈哈纯净水。
2 方法与结果
2. 1 色谱条件 色谱柱采用 Thermo C18柱(250 mm ×
4． 6 mm，5 μm) ，流动相:［甲醇 －乙腈(13∶ 11) ］为 A，
0． 1%磷酸为 B，梯度洗脱(0 ～ 40 min，25% A;40 ～ 60
min，38%A;60 ～ 80 min，43%A) ，流速 1． 0 ml /min，检
测波长 356 nm，柱温 30 ℃，进样量 10 μl。
2. 2 溶液的制备
2． 2． 1 对照品溶液的制备 分别精密称取金丝桃苷
对照品 10． 50 mg、槲皮素对照品 10． 47 mg、山柰素对
照品 10． 53 mg，置 50 ml 量瓶中，加一定量的甲醇溶
解，定容，摇匀，配制成金丝桃苷浓度为 195． 93 μg /ml、
槲皮素浓度为 202． 07 μg /ml 和山柰素浓度为 196． 27
μg /ml的混合对照品溶液。
2． 2． 2 供试品溶液的制备 精密称取粉碎后的照山
白粉末约 1 g，置于锥形瓶中，精密加入 70%甲醇 20
ml，称定质量，超声处理 30 min，用 70%甲醇补足重量，
取上清液用 0． 22 μm 微孔滤膜滤过，续滤液作为供试
品溶液。
2. 3 系统适应性试验 分别取供试品溶液和混合对
照品溶液，按“2． 1”项下色谱条件进样分析，结果见图
1，表明在此色谱条件，金丝桃苷、槲皮素和山柰素 3 种
成分分离良好。
2. 4 线性关系考查 分别精密吸取混合对照品溶液
51天津药学 Tianjin Pharmacy 2016 年 第 28 卷 第 1 期
0． 25、0． 5、2． 5、5． 0、7． 5 和 10． 0 ml，置 10 ml 量瓶中，
加甲醇定容至刻度，摇匀，得到 3 种成分的系列浓度的
对照品溶液，按“2． 1”项下色谱条件进行测定，记录峰
面积，分别以 3 种对照品的浓度为横坐标(X) ，峰面积
为纵坐标(Y) ，作图，得到金丝桃苷、槲皮素和山柰素
的回归方程为:金丝桃苷 Y = 12 1110 715． 40 X －
10 550 469． 80(r = 0． 999 1，n = 6) ;槲皮素 Y =
12 1110 715． 40 X － 10 558 469． 80(r = 0． 998 7，n =
6) ;山柰素 Y = 238 205 793． 70 X － 20 836 336． 90(r =
0． 998 6，n = 6)。结果表明，金丝桃苷、槲皮素和山柰
素分别在 4． 85 ～ 194． 25、5． 05 ～ 202． 07 和 4． 90 ～
196． 27 μg /ml范围内线性关系良好。
1．金丝桃苷 2．槲皮素 3．山柰素
图 1 混合对照品(A)供试品(B)HPLC色谱图
2. 5 精密度试验 精密吸取 3 种成分的混合对照品
溶液，按“2． 1”项下色谱条件重复进样 6 次，计算金丝
桃苷、槲皮素和山柰素峰面积 RSD 分别为 1． 1%、
0． 14%和 0． 88%。表明仪器的精密度良好。
2． 6 重复性试验 分别精密称取粉碎后的同一样品
6 份，每份 1 g，按“2． 2． 2”项下方法制备，按“2． 1”项下
方法测定，测得样品中金丝桃苷、槲皮素和山柰素的平
均含量分别为 5． 10、0． 10 和 0． 40 mg /g，RSD 分别为
0． 71%、0． 56%和 1． 5%，表明重复性良好。
2． 7 稳定性试验 精密吸取同一样品溶液 10 μl，分
别于 0、2、6、12、24 和 48 h 进样，结果样品中 3 种成分
金丝桃苷、槲皮素和山柰素峰面积的 RSD 分别为
0． 51%、1． 5%和 1． 7%。表明金丝桃苷、槲皮素和山柰
素在 48 h内稳定。
2． 8 回收率试验 分别精密称取 9 份已知含量样品，
每份约 0． 5 g，分别加入一定量的金丝桃苷、槲皮素和
山柰素对照品，按“2． 2． 2”项下方法制备，按“2． 1”项
下色谱条件检测，计算金丝桃苷、槲皮素和山柰素的回
收率，结果金丝桃苷平均回收率为 97． 34%，RSD 为
1． 60%;槲皮素平均回收率为 96． 79%，RSD 为
1． 01%;山柰素平均回收率为 97． 56%，RSD 为
1． 40%。见表1 － 3。
表 1 金丝桃苷回收率试验结果
编号
样品含量
(mg)
加入量
(mg)
测得量
(mg)
回收率
(%)
1 2． 590 3 2． 039 2 4． 587 6 98． 38
2 2． 577 0 2． 039 2 4． 600 7 99． 40
3 2． 579 6 2． 039 2 4． 589 4 98． 86
4 2． 578 6 2． 549 0 5． 092 0 98． 62
5 2． 556 1 2． 549 0 5． 034 8 97． 25
6 2． 550 8 2． 549 0 4． 978 8 95． 26
7 2． 566 8 3． 058 0 5． 500 3 95． 15
8 2． 585 2 3． 058 0 5． 582 3 97． 64
9 2． 578 1 3． 058 0 5． 520 3 95． 51
表 2 槲皮素回收率试验结果
编号
样品含量
(mg)
加入量
(mg)
测得量
(mg)
回收率
(%)
1 0． 050 8 0． 418 8 0． 468 7 98． 23
2 0． 050 5 0． 418 8 0． 467 3 96． 04
3 0． 050 6 0． 418 8 0． 468 2 97． 63
4 0． 050 6 0． 052 4 0． 101 2 96． 44
5 0． 050 1 0． 052 4 0． 100 5 96． 01
6 0． 051 3 0． 052 4 0． 102 8 98． 24
7 0． 050 3 0． 628 2 0． 676 5 96． 02
8 0． 050 7 0． 628 2 0． 677 4 97． 04
9 0． 050 6 0． 628 2 0． 676 5 95． 45
表 3 山柰素回收率试验结果
编号
样品含量
(mg)
加入量
(mg)
测得量
(mg)
回收率
(%)
1 0． 203 2 0． 168 0 0． 366 2 97． 54
2 0． 202 1 0． 168 0 0． 365 1 97． 53
3 0． 202 3 0． 168 0 0． 362 3 96． 05
4 0． 202 2 0． 210 0 0． 410 9 99． 36
5 0． 200 5 0． 210 0 0． 401 5 95． 51
6 0． 201 2 0． 210 0 0． 405 7 97． 27
7 0． 201 3 0． 252 0 0． 451 1 98． 91
8 0． 202 8 0． 252 0 0． 453 5 99． 36
9 0． 202 2 0． 252 0 0． 447 2 96． 54
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2． 9 含量测定 分别取不同批号照山白药材 5 份，精
密称定，按“2． 2． 2”项下方法制备，按“2． 1”项下色谱
条件测定，外标法计算，结果见表 4。
表 4 样品测定结果
采收时间和产地
金丝桃苷
(mg /g)
槲皮素
(mg /g)
山柰素
(mg /g)
2014 年 5 月河北滦平 5． 10 0． 10 0． 40
2014 年 7 月河北滦平 2． 40 0． 12 0． 12
2014 年 10 月河北滦平 3． 64 0． 048 0． 13
2014 年 4 月河北宽城 2． 93 0． 066 0． 12
2014 年 5 月吉林通化 4． 52 0． 25 0． 034
3 讨论
3. 1 流动相的选择 照山白中化学成分较复杂，检测
组分较多，实验中曾选择过不同比例的甲醇 － 0． 1%磷
酸、乙腈 － 0． 1%磷酸、［甲醇 －乙腈(1∶ 1) ］－ 0． 1%
磷酸、［甲醇 －乙腈(13∶ 11) ］－ 0． 1%磷酸等流动相，
其中以［甲醇 －乙腈(13∶ 11) ］－ 0． 1%磷酸分离效果
最为良好，故选择该流动相体系。
3. 2 提取方法的选择 在供试品制备时分别考查了
甲醇回流提取、乙醇回流提取、索氏提取器提取、超声
提取等不同方法，发现超声提取即可提取完全;又对不
同浓度的甲醇进行考查，结果发现 70%甲醇提取完
全，同时对超声处理的时间进行了考查，发现超声处理
30 min即可提取完全。
3. 3 产地和采收季节的影响 从结果来看，不同产
地、不同采收季节对金丝桃苷、槲皮素和山柰素的含量
均有影响。从产地来看，吉林产照山白中槲皮素含量
最高，采收自滦平的照山白中山柰素含量最高。从采
收季节来看，承德地区 5 月份采收的照山白中金丝桃
苷、山柰素均高于 7 月、10 月采收，槲皮素含量也较
高，为照山白比较适合的采收季节。
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