全 文 ：《现代食品科技》 Modern Food Science and Technology Vol.22 No.2(总 88)
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文章篇号:1007-2764(2006)02-0110-035
超声波协同提取隐囊蕨黄酮物质及其抗氧化的研究
丁利君，周燕芳，林淡璇
（韩山师范学院化学系，广东潮州521041）
摘要：采用超声波协同提取隐囊蕨中黄酮物质，最佳提取条件为：在溶剂量（50%的乙醇）为 80倍的情况下，超声波处理 20min，
在 95℃下提取 2h，黄酮得率为 5.79%。隐囊蕨的黄酮提取液对羟自由基、超氧自由基有良好清除作用，并能有效阻断猪油的氧化。
关键词：黄酮；隐囊蕨；超声波；抗氧化
Extraction of Flavonoids From Notholaena hirsute(poir.)Desv with
Ultrasonic Wave-cooperated Method and the Study of its Anti-oxidation
Ding Li-jun , Zhou Yan-fang , Lin Dan-xuan
(Department of Chemistry, Han Shan Normal University, Chaozhou 521041, China)
Abstract: The extraction and the anti-oxidation of flavonoids from Notholaena hirsute(poir) Desv were studied. The result showed that
the yield of flavonoids is 5.79% extracted by 80 times of 50% alcohol for 2h at 95℃ and treatment of Ultrasonic wave for 20min. The
flavonoids extract can scavenge Oxygen and Hydroxy free radicals, and can stop the oxidation of the lard effectively.
Keywords: Flavonoid; Notholaena hirsute(poir.)Desv; Ultrasonic wave; Anti-oxidation
隐囊蕨(Notholaena hirsute(poir.)Desv)是药用蕨类
植物，其生物活性成分主要有酚类化合物、黄酮类、
生物碱类等[1]。我国广东、福建有大量的隐囊蕨野生
资源。对于隐囊蕨中黄酮类化合物的提取与抗氧化性
研究尚未见文献报道。本文对隐囊蕨中黄酮类物质进
行提取与分析，并对其抗氧化作用进行了研究，为隐
囊蕨的开发提供了理论依据。
1 材料与方法
1.1 实验材料
隐囊蕨：采自潮州笔架山。取地上部分，粉碎，
于 60℃烘干。
芦丁，生化试剂。乙醇，亚硝酸钠，硝酸铝，氢
氧化钠，硫酸亚铁，过氧化氢，磷酸氢二钾，磷酸二
氢钾，水杨酸，邻苯三酚。试剂都是分析纯。
1.2 实验仪器
KQ-300DE 型医用数控超声波清洗器；HH-2 数
显恒温水浴锅；724 型分光光度计；TG328B 电光分
析天平；101A-1干燥箱；小型粉碎机等。
1.3 样品的处理
称取样品 5g于 500mL锥形瓶中，加入一定物料
收稿日期：2005-11-21
作者简介:丁利君,副研究员。
比一定体积分数的乙醇浸没隐囊蕨粉末，并用橡皮塞
塞住瓶口，先超声波处理（水浴温度为 50℃），再恒
温浸取，过滤，离心，得测定用的样品液。
1.4 总黄酮测定方法
用芦丁作标准液，做标准曲线[2]，得回归方程：
A=0.8346C-0.002，线性范围为 0-0.6mg/ml，相关系数
r=0.9997。
样液测定：准确吸取浸出液 0.5mL3 份，放入 3
只具塞试管中，各加入 5%NaNO2溶液 0.3mL，摇匀，
放置 6min，加 10% Al（NO3）3 溶液 0.3mL，摇匀，
放置 6min，加 1mol/L NaOH溶液 4 mL，加蒸馏水至
10mL，摇匀，放置 10~15min，同时作试剂空白，以
试剂空白作对照，510nm波长处测定吸光度，由回归
方程计算出样液中总黄酮含量 C。
样品中的黄酮量（%）=
式中：C：根据样液的吸光度值计算得到的测定液中黄酮
含量，mg/ml；V1：定容的体积，ml；V2：从定容液中取出来
进行显色反应测定的体积，ml；W：样品重，mg。
1.5 对羟自由基清除率的测定
参照 Fenton 反应的方法建立反应体系模型[3]，
H2O2与二价铁离子混合后产生•OH。•OH具很高的反
应活性，存活时间短，但反应体系中加入水杨酸能有
效地捕捉•OH并产生有色产物。该产物在 510nm处有
CV1
V2W ×100%
DOI:10.13982/j.mfst.1673-9078.2006.02.035
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强吸收,若加入具有清除•OH功能的被测物，便会与水
杨酸竞争•OH，从而使有色产物的生成量减少。被测
物对•OH清除率/% =(ＡX -ＡO)÷ＡX × 100%。Ax为反
应体系原来的吸光度，A0为加入提取液后的吸光度。
提取液对•OH 自由基的清除率的测定：取 6m
mol/L的 FeSO41mL于试管中，加入 6 m mol/L水杨酸
1mL，再滴加 6 m mol/L H2O2 1mL，摇匀，1min后测
定其吸光度AX，测定后在试管中加入提取液，加蒸馏
水至 10ml,摇匀，放置 10min，再测定其吸光度 AO，
计算清除率。
1.6 对超氧自由基清除率的测定方法[4]
碱性条件下(pH=8.34),邻苯三酚发生自氧化反应 ,
生成 O2﹒-和有色中间产物, 该有色中间产物在 322nm
处有一特征吸收峰。当加入O2- 清除剂时, O2- 的生成
受到抑制,邻苯三酚自氧化过程受阻,溶液在 322nm 处
吸收减弱。故通过测定A322值可以推断清除剂对O2
﹒-的清除作用 ,并比较不同清除剂该作用的相对大小。
提取液对·O2﹒-自由基清除率的测定方法：25 ,℃
体系总体积 10.00ml, PH=8.34 的 50 mmol﹒l-1 PBS
5.00ml, 0.2 mmol﹒l-1 邻苯三酚 0.3ml,加提取液 0、0.1、
0.2、0.3、0.4、0.5ml或不加提取液 (作为对照 ) ,并分
别以同浓度同一提取液为参比 (对照以PBS为参比 ) ,
测反应启动后第 20秒时的A322值。清除率计算:·O2﹒-
清除率 S（%） =(A 空 -A 样)÷A 空 × 100%
1.7 隐囊蕨黄酮提取液对猪油中的抗氧化作用[5]
猪油由市售板油在烧杯中用文火熬炼而成。分别
称取 0.010g、0.025g、0.050g、0.100g、0.200g粗黄酮
粉、0.010gBHT，各用 4ml 无水乙醇溶解后分别加到
50.00g 温热猪油中，搅匀，以不加粗黄酮粉，仅在
50.00g猪油中加入4ml无水乙醇为对照样，在(60±1)℃
培养箱中强化保存，定时搅伴，于不同时间取样测定
猪油中的过氧化值(POV 值)，并以此来表示猪油的氧
化速度，进而衡量乌毛蕨黄酮类化合物的抗氧化活性。
过氧化值的测定按GB5009.37—1985方法进行。
准确称取 2～3g油样品，置入 250mL锥形瓶中，加入
30mL三氯甲烷-冰乙酸混合液，使样品完全溶解。加
入 1.00mL 饱和碘化钾溶液，用保鲜膜覆盖瓶口，并
轻轻摇匀 0.5min，然后放在暗处 3min，取出加 100mL
水，摇匀。立即用 0.002M硫代硫酸钠标准溶液滴定,
至淡黄色时，加 2~3滴淀粉指示剂，继续滴定至蓝色
消失为终点，取相同量三氯甲烷-冰乙酸混合液、碘化
钾溶液、水,按同一方法，作试剂空白试验。样品的过
氧化值(POV)计算：POV=（V1-V2）M/m*1000。式
中:POV 为样品的过氧化值,mmol/kg；V1为试样消耗
硫代硫酸钠标准溶液体积,mL；V2为空白试验消耗硫
代硫酸钠标准溶液体积,mL；M 为硫代硫酸钠标准溶
液的摩尔浓度,mol/L；m为样质量,ｇ。
1.8 数据处理
测定样品有三个平行样，测定结果以平均值计。
2 结果与分析
2.1 超声波协同提取隐囊蕨黄酮物质的技术参数的
确定
2.1.1 溶剂倍数的确定
取 10g隐囊蕨粉末 5份于 50ml锥形瓶中，分别
加入不同体积的 50%乙醇，于 85℃恒温水浴中浸取
1.5 h。表 1可知，溶剂倍数为 80时，提取率最大。
表1 不同溶剂倍数对提取效果的影响
溶剂倍数 20 40 60 80 100
吸光度A 0.328 0.398 0.415 0.452 0.431
黄酮得率（%） 3.95 4.79 5.00 5.44 5.24
2.1.2 正交试验的结果与分析
选取提取温度、超声波处理时间、乙醇浓度、提
取时间进行四因素四水平正交实验，结果如表 2。
表2 正交实验的结果及分析
试验
号
A提取温
度/℃
B超声波处
理时间/min
C乙醇浓
度/%
D提取时
间/h
吸光
度
黄酮得
率/%
1 65[1] 10[1] 30[1] 0.5[1] 0.166 2.01
2 65[1] 15[2] 50[2] 1.0[2] 0.329 3.97
3 65[1] 20[3] 70[3] 1.5[3] 0.292 3.52
4 65[1] 25[4] 90[4] 2.0[4] 0.172 2.08
5 75[2] 10[1] 50[2] 1.5[3] 0.363 4.37
6 75[2] 15[2] 30[1] 2.0[4] 0.330 3.98
7 75[2] 20[3] 90[4] 0.5[1] 0.172 2.08
8 75[2] 25[4] 70[3] 1.0[2] 0.317 3.82
9 85[3] 10[1] 70[3] 2.0[4] 0.365 4.40
10 85[3] 15[22] 90[4] 1.5[3] 0.264 3.19
11 85[3] 20[3] 30[1] 1.0[2] 0.350 4.22
12 85[3] 25[4] 50[2] 0.5[1] 0.371 4.47
13 95[4] 10[1] 90 1.0 0.293 3.53
14 95[4] 15[2] 70 0.5 0.337 4.06
15 95[4] 20[3] 50 2.0 0.481 5.79
16 95[4] 25[4] 30 1.5 0.304 3.67
K1 11.59 14.32 13.88 12.62
K2 14.26 15.19 18.6 15.54
K3 16.27 15.61 15.8 14.75
K4 17.05 14.04 10.88 16.25
R1 2.90 3.58 3.47 3.16
R2 3.56 3.80 4.65 3.89
R3 4.07 3.90 3.95 3.69
R4 4.26 3.51 2.72 4.06
R 1.36 0.39 1.93 0.90
因素主次顺序
C（AD）B
表 2结果表明，影响黄酮得率的所选因素主次顺
序为：乙醇浓度>提取温度>提取时间>超声波处理时
间。提取的最佳条件为 A4B3C2D4，即在超声波处理
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20min后，用 50%的乙醇在 95℃恒温水浴中浸取 2.0h。
此条件下测定出总黄酮物质含量为 5.79%。
2.2 隐囊蕨黄酮提取液的抗氧化作用
2.2.1 隐囊蕨中黄酮类化合物的提取液对•OH自由基
的清除作用
分别取提取液 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、
1.4、1.6、1.8、2.0ml，按 1.5 的实验方法，测定其吸
光度。由图 1结果可知，在一定浓度范围内，提取液
对羟自由基清除作用随浓度的增加而增大。
0
10
20
30
40
50
60
0 0 .2 0 .4 0 .6 0 .8 1 1 .2 1 .4 1 .6 1 .8 2
提取液体积 /ml
羟
自
由
基
清
除
率
/%
图1 提取液对羟自由基的清除效果
2.2.2 隐囊蕨黄酮类化合物提取液对O2﹒-自由基的清
除作用
分别取提取液 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、
1.4、1.6、1.8、2.0ml，按 1.6 的实验方法，测定其吸
光度。由图 2可看出，在一定浓度范围内，提取液对
超氧自由基清除率随浓度的增大而增大。
0
10
20
30
40
50
60
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 2
提取液量/ml
超
氧
自
由
基
清
除
率
/%
图2 提取液对超氧自由基的清除效果
2.2.3 隐囊蕨黄酮提取液对猪油的抗氧化作用
7.59
6.09
4.34 4.01
0
3
6
9
空白对照样 0.02%BHT 0.2%提取液 0.4%提取液
PO
V值
/m
mo
l/
kg
图3 烘箱强制氧化72h测 POV值
图 3 可知,隐囊蕨提取液能有效降低猪油强制氧
化时的 POV 值，阻断猪油的过氧化作用。且用量越
大，其抗氧化作用越强。
3 结论
(1)超声波协同提取隐囊蕨黄酮类物质的最佳条
件为：用 80 倍的溶剂提取，超声波处理 20min，用
50%的乙醇在 95℃下提取 2h。此条件下黄酮得率为
5.79%。
(2)在一定浓度范围内，隐囊蕨黄酮提取液对羟自
由基、超氧自由基有很好的清除作用。
(3)隐囊蕨黄酮提取物能有效阻断猪油氧化作用。
隐囊蕨资源丰富，其黄酮物质的含量为 5.79%，
提取物的抗氧化作用强，有很好的开发前景。
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