全 文 ：浙江农业学报 Acta Agriculturae Zhejiangensis，2012，24(6) :1021 － 1025 http:/ /www． zjnyxb． cn
沈晓霞，沈宇峰，江建铭．杭白芷种质资源遗传多样性的 AFLP分析［J］．浙江农业学报，2012，24(6) :1021 － 1025．
杭白芷种质资源遗传多样性的 AFLP分析
沈晓霞，沈宇峰，江建铭
(浙江省中药研究所，浙江 杭州 310023)
收稿日期:2012-04-17
基金项目:国家科技重大专项(2012ZX09304006)
作者简介:沈晓霞(1973—) ，女，浙江海宁人，高级工程师，主要
从事中药材育种、资源再生。Tel:0571-85241074;E-mail:xiaoxi-
ashen@ sina． com
摘 要:通过对 50 份杭白芷种质资源的 AFLP分析，探求各种质间的遗传多样性。采用扩增片段长度多态性
(AFLP)标记，在 DNA水平上进行遗传多样性研究，筛选出 12 对选择性扩增引物，将扩增出的条带作为原始
矩阵，用 NTSYS-PC软件计算并分析了杭白芷种质间的相似度，构建了遗传系统进化树。结果表明，50 份杭
白芷种质间，相似度均超过 70%，总体上亲缘关系都比较接近，相对而言，ZYS002039 和 ZYS002045 种质，与
其他种质的遗传背景差异较大。
关键词:杭白芷;种质资源;AFLP;遗传多样性
中图分类号:S 567． 9 文献标志码:A 文章编号:1004-1524(2012)06-1021-05
AFLP analysis of genetic diversity of Angelica dahurica
SHEN Xiao-xia，SHEN Yu-feng，JIANG Jian-ming
(Zhejiang Research Institute of Traditional Chinese Medicine，Hangzhou 310023，China)
Abstract:The 50 germplasmic resources of Angelica dahurica were analyzed by AFLP to determine the genetic diver-
sity． The amplified fragment length polymorphism (AFLP)tags were used to investigate the genetic diversity at the
DNA level． Twelve pairs of selective amplification primers were screened out to amplify the bands，which were used
as original matrix and analyzed the similarity between different Angelica dahurica germplasm by NTSYS-PC software
calculation and constructed the phylogenetic tree． The results indicated that the similarity of the 50 Angelica dahurica
germplasm resources all more than 70%，whose overall phylogenetic relationships were relatively close． The germ-
plasm ZYS002039 and ZYS002045 showed larger difference in genetic background from the others．
Key words:Angelica dahurica;germplasm resourse;AFLP;genetic diversity
伞形科植物杭白芷［Angelica dahurica
(Fisch． ex Hoffm．)Benth． et Hook． f． var． formo-
sana(Boiss)Shan et Yuan］，具有解表散寒、祛风
止痛、宣鼻通窍等功效［1］，在长期人工栽培过程
中，由于地理位置、气候条件和栽培技术等因素
的差异形成了许多地方品种和类型，而一些地方
的杭白芷种源差，产量低，达不到生产上要求的
二级以上种子的标准。
AFLP是一种广泛用于研究遗传多样性分
析、作物品种鉴定、基因定位等方面的分子标记
方法，具有可靠性好、重复性强、可信度高等优
点［2 － 5］。
郭丁丁等［6，7］建立了适用于白芷的 ISSR 反
应体系，并得出不同产地栽培白芷遗传多样性较
低;陈要致等［8］建立了适用于白芷的 AFLP 反应
体系，并筛选出了合适的引物;杨滨等［9］利用
RAPD分析探讨了白芷的亲缘关系。目前，尚未
见到将 AFLP分子标记技术用于浙江道地药材杭
白芷种质资源遗传多样性研究的报道。本研究
运用 AFLP分子标记技术，建立适合杭白芷的分
子遗传标记体系，构建 50 份杭白芷种质资源遗
传系统进化树，根据遗传系统进化树的聚类分析
图，表明 AFLP对杭白芷种质遗传多样性的检测
效应较高，揭示了浙江道地药材杭白芷种质资源
的遗传多样性。
1 材料与方法
1． 1 材料
1． 1. 1 供试杭白芷
供试的 50 份种质分别采自杭白芷主产区浙
江省磐安县和东阳市(依次编号为 ZYS002001-
ZYS002050，详见表 1) ，在苗期，采集杭白芷新鲜
幼嫩叶片。每份种质采 3 ～ 5 株，每株采集 3 ～ 5
张叶片。
1． 1. 2 试剂
表 1 供试样品编号及来源列表
Table 1 Test sample number and the source list
编号 种质来源 编号 种质来源
ZYS002001 磐安尚湖镇 1 ZYS002026 磐安胡宅乡 2
ZYS002002 磐安尚湖镇 2 ZYS002027 磐安九和乡 1
ZYS002003 磐安尚湖镇 3 ZYS002028 磐安九和乡 2
ZYS002004 磐安新渥镇 1 ZYS002029 磐安万苍乡 1
ZYS002005 磐安新渥镇 2 ZYS002030 磐安万苍乡 2
ZYS002006 磐安新渥镇 3 ZYS002031 磐安方前镇 1
ZYS002007 磐安大盘镇 1 ZYS002032 磐安方前镇 2
ZYS002008 磐安大盘镇 2 ZYS002033 磐安盘峰乡 1
ZYS002009 磐安仁川镇 1 ZYS002034 磐安盘峰乡 2
ZYS002010 磐安仁川镇 2 ZYS002035 磐安维新乡 1
ZYS002011 磐安安文镇 1 ZYS002036 磐安维新乡 2
ZYS002012 磐安安文镇 2 ZYS002037 磐安高二乡 1
ZYS002013 磐安冷水镇 1 ZYS002038 磐安高二乡 2
ZYS002014 磐安冷水镇 2 ZYS002039 东阳横店镇 1
ZYS002015 磐安深泽乡 1 ZYS002040 东阳横店镇 2
ZYS002016 磐安深泽乡 2 ZYS002041 东阳马宅镇 1
ZYS002017 磐安玉山镇 1 ZYS002042 东阳马宅镇 2
ZYS002018 磐安玉山镇 2 ZYS002043 东阳千祥镇 1
ZYS002019 磐安尖山镇 1 ZYS002044 东阳千祥镇 2
ZYS002020 磐安尖山镇 2 ZYS002045 东阳湖溪镇 1
ZYS002021 磐安双峰乡 1 ZYS002046 东阳湖溪镇 2
ZYS002022 磐安双峰乡 2 ZYS002047 东阳南市街道 1
ZYS002023 磐安窈川乡 1 ZYS002048 东阳南市街道 2
ZYS002024 磐安窈川乡 2 ZYS002049 东阳三单乡
ZYS002025 磐安胡宅乡 1 ZYS002050 东阳南马镇
AFLP接头和引物均由上海生工生物工程技
术服务有限公司合成。EcoRⅠ(20 000 U·mL －1，
0. 25 mL) ，MseⅠ(10 000 U·mL －1，0. 025 mL)、
BSA(10 mg·mL －1，0. 25 mL)和 T4 DNA Ligase
(400 000 U·mL －1，0. 025 mL)由纽英伦生物技术
(北京)有限公司生产，Taq DNA 聚合酶(2 U·
μL －1，1 000 U)由北京鼎国生物技术有限责任公
司生产。
1． 1. 3 仪器
Bio-Rad smart spec-plus 核酸蛋白分析仪，
Sigma 3K15 冷冻离心机，Bio-Rad Dyad PTC-0220
PCR仪，Bio-Rad GS-800 扫描仪，Bio-Rad T2A 凝
胶成像仪，天能 EPS-100 电泳仪。
1． 2 方法
1． 2. 1 提取基因组 DNA
采用 SDS法提取杭白芷幼嫩叶片的基因组
DNA。
1． 2. 2 酶切
每个反应总体积为 20 μL，其中包括:杭白芷
基因组 DNA (100 ng·μL －1)10 μL，EcoRⅠ 0. 5
μL，MseⅠ 0. 5 μL，BSA 0. 2 μL，EcoRⅠ Buffer
2. 0 μL，ddH2O 6. 8 μL。37℃酶切 5 h，酶切后
70℃反应 15 min，使酶失活，再次离心后放置在
冰上。
1． 2. 3 连接
酶切后，在酶切体系中加入接头连接反应
液。EcoRⅠ接头的上游接头为 5’-CTCGTAGACT
GCGCGTACC-3’，下 游 接 头 为 5’-AATTGG-
TACGCAGTCTAC-3’;MseⅠ接头的上游接头
为 5’-GACGATGAGTCCTGAG-3’，下游接头为
5’-TACTCAGGACTCAT-3’。接头连接反应液
包括:5 μmol·L － 1 EcoRⅠ上游接头 2. 5 μL，5
μmol·L － 1 EcoRⅠ下游接头 2. 5 μL，50μmol·
L － 1 MseⅠ上游接头 2. 5 μL，50 μmol·L － 1 Mse
Ⅰ下游接头 2. 5 μL，T4 DNA Ligase 1. 0 μL，T4
DNA Ligase Buffer(含 dATP)4. 0 μL，ddH2O
5. 0 μL，共 20. 0 μL。
室温下混匀，离心，16℃或室温下反应 15 h;
反应结束后 70℃反应 15 min，使酶失活;将上述
反应液稀释 10 倍，不用的部分保存在 － 20 ℃冰
箱中。
·2201· 浙江农业学报 第 24 卷 第 6 期(2012 年 11 月)
1． 2. 4 预扩增
EcoRⅠ预扩增引物(E pre-primer)为 5-GAC
TGC GTA CCA ATT C-3;MseⅠ预扩增引物(M
pre-primer)为 5-GAT GAG TCC TGA GTA A-3。
取 3. 0 μL 连接后并稀释过的 DNA 样品，加入
27. 0 μL 反应液:10 × PCR Buffer 3. 0 μL，10
mmol·L －1的 dNTP 混合液 0. 6 μL，10 μmol·L －1
EcoRⅠ端预扩增引物 1. 0 μL，10 μmol·L －1 MseⅠ
端预扩增引物 1. 0 μL，2. 0 U·μL －1的 Taq DNA
聚合酶 1. 0 μL，ddH2O 20. 4 μL。
混匀后，在 PCR 仪上扩增:94℃ 5 min;94℃
30 s，55℃(退火温度)30 s，72℃ 80 s，共 31 个
循环;72℃延伸 10 min;4℃保温。预扩增产物稀
释 20 倍，－ 20 ℃保存备用。
1． 2. 5 选择性扩增
取 5 μL预扩增稀释混合液，加入 15. 0 μL反
应液:10 × PCR Buffer 2. 0 μL，10 m mol·L －1的
dNTP混合液 0. 4 μL，10 μmol·L －1 MseⅠ端引物
和 EcoRⅠ端引物各 0. 25 μL，5 U·μL －1的 Taq
DNA聚合酶 0. 75 μL，ddH2O 11. 35 μL。
混匀后，在 PCR 仪上扩增:94℃ 5 min;94℃
30 s，65℃ 30 s，72℃ 60 s，以后每个循环温度递
减 0. 7℃，扩增 12 个循环;然后按 94℃ 30 s，55℃
30 s，72℃ 60 s扩增 23 个循环;72℃延伸 10 min，
4℃保温。
1． 2. 6 电泳和银染
用 40 mL的 PAGE溶液在 1. 0 mm胶版上制
胶一块，静置 3 h后点样，在电泳仪上以 200 V的
电压电泳 3 h，然后在醋酸溶液中固定 30 min，纯
水中清洗 10 min 后，银染 30 min，再放入显影液
中显影，显影完成后放回醋酸固定液中。用扫描
仪扫描胶片。
2 结果与分析
2． 1 AFLP指纹图谱的建立和鉴别效率
经过对各个试验参数反复的比较和优化，建
立了简便、高效的杭白芷 AFLP 分析体系，从 14
对引物组合中筛选了 12 对多态性较强、带型较
好、分辨率较高的引物组合进行分析，12 对引物
组合对 50 个杭白芷种质扩增结果见表 2。
表 2 12 对 AFLP引物对 50 个杭白芷种质的扩增结果
Table 2 Twelve pairs of AFLP primer amplification results
of 50 Angelica dahurica germplasm
序号 末端碱基组合
(EcoRⅠ-MseⅠ)
扩增位
点 /个
多态性
位点 /个
多态性位
点比例 /%
1 AAG-CCA 109 9 8. 3
2 AAC-CAC 11 11 100
3 AAC-CAA 14 14 100
4 AAC-CAG 16 16 100
5 AAC-CTA 10 10 100
6 AAC-CTC 30 30 100
7 AAG-CAG 27 27 100
8 AAG-CAT 61 61 100
9 AAG-CAC 97 97 100
10 AAG-CCT 61 61 100
11 AGC-CAA 51 51 100
12 AAG-CTC 41 41 100
合计

528 428 81. 1
表 2 可知，12 对引物组合共在 528 个位点上
扩增出条带，平均每对引物组合扩增位点为 44
个。平均每个种质扩增位点为 10. 56 个。扩增
位点数量最多的是 1 号引物组合，共扩增出的位
点为 109 个;扩增位点最少的是 5 号引物组合，
扩增出的位点为 10 个。12 对引物组合共扩增出
多态性位点 428 个，多态性位点占总扩增位点的
比例平均为 81. 1%，平均每对引物扩增多态性位
点为 35. 7 个。
2． 2 杭白芷种质的 AFLP指纹图谱
在 50 个杭白芷种质中，共有多态性位点 428
个，平均每对引物组合扩增的每个种质的多态性
位点为 35. 7 个，这些条带组合对于特定的材料
和引物位点是稳定的，利用这些条带，可以将生
物学特性相近的种质区分开来(图 1) ，把有条带
标记为 1，无条带标记为 0，通过这些位点的不同
条带组合，可以构建杭白芷的 AFLP指纹图谱，将
50 个杭白芷种质全部区分开来。
2． 3 AFLP分子标记的聚类分析
将 12 对引物组合在 428 个位点上扩增出的
条带作为原始矩阵，用 NTSYS-PC 软件计算并分
析了 50 份杭白芷种质间的相似度，结果见图 2。
从聚类图可以看出，各杭白芷种质遗传距离比
较接近，相似度在 70%以上，大体上，将它们聚
·3201·沈晓霞，等． 杭白芷种质资源遗传多样性的 AFLP分析
书为两类，其中，39 号和 45 号种质，与其他种质的
亲缘关系相对较远，故将二者聚为第一类;其余
种质为第二类，其中，20 号和 23 号、11 号和 17
号、19 号和 22 号、48 号和 49 号的亲缘关系最近，
相似度超过 97%。
3 讨论
·4201· 浙江农业学报 第 24 卷 第 6 期(2012 年 11 月)
本研究应用 AFLP 分子标记技术，对浙江省
内 50 份不同来源的杭白芷种质，进行了遗传多
样性分析，从分子水平揭示了杭白芷种质的遗传
基础，为今后的种质资源收集保存、新品种选育
等提供了理论依据，对更有效地利用杭白芷种质
资源具有重要意义。
研究结果还表明:不同杭白芷居群间，DNA
多态性虽然存在一定的差异，但总体差异较小，
这可能与杭白芷传统产区地域范围相对比较小，
生态气候条件比较接近，基因背景相似有关;另
一方面，这 50 份杭白芷种质都为栽培种，经过长
年的人工栽培和人工选择，生物学性状都较为近
似，也是一个因素。有关杭白芷野生种和栽培种
之间的遗传多样性，还有待进一步研究。
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(责任编辑 张 韵)
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