全 文 ：365
第 卷第 期 34 4
2016 8 年 月
广 东 医 学 院 学 报
JOURNAL OF GUANGDONG MEDICAL COLLEGE
Vol. 34 No. 4
Aug. 2016
半边旗(Pteris semipinnata 又名半边蕨、半边 L.)
莲、单边旗，为凤尾蕨科半边旗属植物，广泛分布
[1]
于我国南方各省 ，具有止血生肌、解毒消肿之功
效，常用于治疗外伤出血、跌打损伤、抗菌痢、肠
[2]
炎、肝炎等 ，黎族民间还将其鲜叶捣碎，用于治
[3]
疗毒蛇咬伤等 。由于半边旗富含的贝壳杉烷型二
萜类成分有亚甲基环戊酮活性基团，具有显著的细
胞毒性，因此，本实验室对半边旗的该类成分进行
[4]
了广泛的抗肿瘤活性评价和作用机制研究 。在此
基础上，本课题组对半边旗中的二萜类成分开展了
进一步的系统化学成分研究，并从中分离得到了一
系列的该类成分。本文就其中的主要二萜类成分之
一 对人肝癌耐药细胞 的增殖与凋亡PAG HepG2/ ADM
的影响和作用机制进行了初步的探讨。
1 材料和方法　
1.1 材料　
PAG由广东医科大学天然药物开发与开发实验
室从半边旗地上部位中分离纯化，并鉴定为贝壳杉
Abstract: Objective Pteris semipinna- To investigate the mechanism of derived PAG on proliferation and apoptosis of
human hepatocarcinoma cell line with multidrug resistance. After treated with different concentrations of PAG (0-75 Methods
μmol/L), proliferation, cycle, apoptosis, apoptosis-related protein expression and reactive oxygen species (ROS) level in
HepG2/ADM cells were evaluated by MTT, flow cytometry, Western bolt and DCFH-DA, respectively. Results PAG inhibited
dose-dependently cell proliferation and expression of caspase 3, PARP and Bcl-2, but increased G2/M distribution, apoptosis,
cellular ROS level, cytochrome C release from mitochondria, and expression of actived-caspase 3, cleaved-PARP and Bax.
Pretreatment with 1 mmol/L acetylcysteine abolished PAG-induced growth inhibition. Conclusion Pteris semipinna-derived
PAG could reverse the multidrug resistance of hepatocarcinoma cells through ROS-induced mitochondrial apoptosis.
Key words: Pteris semipinnata ; multidrug resistance; hepatocarcinoma; HepG2/ADM cells
半边旗二萜类成分 通过 诱导的线粒体凋亡克服肝癌多药耐药PAG ROS
1 1 1 1 2 1 1 1张森旺 ，卢晓芬 ，何晓虹 ，巫 鑫 ，廖红波 ，吴科峰 ，崔　燎 ，梁念慈 （ 广东医科大学1.
天然药物研究与开发实验室，广东湛江 524023；2. 广东医科大学药理学教研室，广东湛江 524023）
Pteris semipinna-derived PAG reverses multidrug resistance through ROS-induced
mitochondrial apoptosis in hepatocarcinoma cells
ZHANG Seng-wang , LU Xiao-feng , HE Xiao-hong , WU Xin , LIAO Hong-bo , WU Ke-feng , CUI Liao ,
1 1 1 1 2 1 1
LIANG Nian-ci
1
(1. Guangdong Key Laboratory for Research and Development of Natural Drugs; 2. Department of
Pharmacology; Guangdong Medical University, Zhanjiang 524023, China)
摘　要：目的 研究半边旗二萜类成分 对人肝癌耐药细胞株增殖与凋亡机制。方法 细胞用不同PAG HepG2/ADM
浓度( 处理 、 、 ，分别用 、流式细胞术、 、 法检测细胞增殖、细胞0~75 μmol/L)PAG 24 48 72 h MTT Western blot DCFH-DA
周期、细胞凋亡、凋亡相关蛋白表达、活性氧自由基( 水平。结果 呈剂量依赖性抑制细胞增殖及 、ROS) PAG caspase 3
PARP Bcl-2 G2/M ROS actived-caspase 3 cleaved-PARP Bax和 表达，增加 期细胞分布、细胞凋亡、细胞内 水平及 、 和 表
达，促进线粒体中细胞色素 释放到胞质； 乙酰半胱氨酸可阻断 对细胞增殖的抑制作用。结论 半边旗二C 1 mmol/L PAG
萜类成分 可通过 诱导的线粒体凋亡克服肝癌多药耐药。PAG ROS
关键词：半边旗；多药耐药；肝癌； 细胞HepG2/ADM
中图分类号： 文献标识码： 文章编号：R 966 A 1005-4057(2016)04-0365-05
DOI: 10.3969/j.issn.1005-4057.2016.04.009
基金项目：国家自然科学基金青年基金( ，No. 81503226)
　　　　　广东大学生科技创新培育专项资金项目
　　　　　(No. pdjh2015b0299)
2016-04-13 2016-06-14收稿日期： ；修订日期：
1992 )作者简介：张森旺( － ，男，在读本科生。
通信作者：巫　鑫，男，博士，助理研究员，
　　　　　 。Email: woodbirdlhb@163.com
烷型二萜类成分 ，人肝癌耐药Pteisolic acid G (PAG)
细胞 购自天津血液病研究所；HepG2/ADM DMEM
高糖培养基( 、胎牛血清( 购于赛默Invitrogen) Gibco)
飞 世 尔 科 技 公 司 。 羊 抗 兔 、 羊 抗 鼠IgG-HRP IgG-
HRP Annexin V-购于中杉金桥生物技术有限公司；
FITC BD试剂盒购于 公司；细胞周期与细胞凋亡检测
试剂盒、活性氧检测试剂盒、 蛋白浓度测定试BCA
剂盒、 裂解液、细胞线粒体分离试剂盒、细胞RIPA
核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒、 化学发光ECL
液、抗体稀释液等均购于碧云天生物技术有限公
司； 、 、 、 、β-actin caspase 3 actived-caspase 3 PARP
cleaved-PARP Bcl-2 Bax Cell Signal-、 、 抗体购于美国
ing Tecchnolgy Cox IV Cytochrome c公司； 和 抗体购
于 公司。Proteintech
1.2 方法　
1.2.1 HepG2/ADM 10% 　细胞培养　将 细胞接种于含
( 100 mg/L 100 mg/L 体积分数)胎牛血清、 青霉素和
链霉素的高糖 培养基中，置于 ℃、DMEM 37 5%
CO2 80%培养箱中培养。当细胞生长至 融合度时，用
0.25% 胰蛋白酶消化，传代。
1.2.2 MTT　 细胞增殖抑制实验　取对数生长期的
HepG2/ADM 10% 细胞，经胰酶消化后，用含 胎牛血
清的 培养基配成活细胞密度为 个/ 的
4
DMEM 3×10 mL
细胞液，按每孔 接种于 孔培养板中，培养90 μL 96
过夜后每孔加入 含 的药液，使其终浓度分10 μL PAG
别为 、 、 、 、 、 、 ，0 3.125 6.25 12.5 25.0 50.0 75.0 μmol/L
每个浓度设 个复孔。继续培养 、 、 后每孔6 24 48 72 h
加 ，继续孵育 后弃去培养液，MTT (5 g/L) 20 μL 4 h
每孔加入 二甲基亚砜( ，在摇板机上震200 μL DMSO)
荡 ，用酶标仪测定各孔光密度值 ( 。10 min 570 nm )
1.2.3 PI　 法检测细胞周期分布　将对数生长期的人
肝癌 细胞以细胞数 孔接种于 孔
5
HepG2/ADM 1×10 / 6
板中，加药 后收集细胞于 管中，用 洗涤24 h EP PBS
2 4 70%次， ℃预冷的 乙醇过夜固定细胞，次日离心
弃上清，再次用 洗涤细胞 次，每管细胞样品中PBS 1
加入 染色液( ， ，0.6 mLPI 1×PBS 50 mg/L PI 2.5 mg/L
RNase) 37 30 min，缓慢重悬细胞沉淀， ℃避光染色 ，
400目滤布过滤，用流式细胞仪检测细胞周期分布。
1.2.4 Annexin V-FITC/PI　 双染法测定细胞凋亡率　
取对数生长期的 细胞，以细胞数
5
HepG2/ADM 1×10 /
孔接种于 孔板中，加药 后收集细胞， 洗涤6 24 h PBS
2 195 μL Annexin V-FITC次，将细胞重悬于 的 结合液
中 ， 室 温 避 光 孵 育 后 加 入15 min 5 μL Annexin V-
FITC 5 μL PI 。、 ，最后用流式细胞仪检测细胞凋亡率
1.2.5 Western Blotting　 检测相关蛋白的表达　将对
数生长期的人肝癌 细胞以细胞数 孔接种
5
HepG2 5×10 /
于 孔板中，加药 后收集细胞，根据需要用不同6 24 h
的蛋白提取方法提取细胞的总蛋白或线粒体、胞浆
蛋白。 法进行蛋白定量，以 凝胶BCA 10%SDS-PAGE
电泳分离蛋白质，将分离后的蛋白质转移至 膜NC
上，用 脱脂奶粉封闭 ， 洗涤 ，一5% 2 h TBST 10 min
抗 ℃ 摇 床 过 夜 ， 洗 涤 次 ， 每 次 ，4 TBST 3 15 min
HRP 2 h TBST 3标记的二抗室温孵育 ， 洗涤 次，每次
15 min ECL， 最 后 在 暗 室 进 行 化 学 发 光 显 色 和 曝
光。
1.2.6 ROS)　细胞内活性氧自由基( 的测定　根据试剂
盒说明进行检测， 给药 后，收集细胞，用PAG 6 h 10
μmol/L DCFH-DA 37 5% CO2 30 于 ℃、 培养箱中处理
min ROS，流式细胞仪检测细胞内 水平。
1.2.7 NAC PAG 1.2.2　 对 细胞毒性的作用测定　按 法
处理细胞， 给药前 ，加入终浓度为PAG 1 h 1 mmol/L
的 进行预保护，其它步骤同 测定细胞活NAC 1.2.2
性。
1.3 统计学处理　
所有实验结果源自 次独立实验，计量数据采用 3
±s GraphPad Prism 5.0表示。采用 软件处理数据结
果 ； 用 统 计 软 件 中 的 单 因 素 方 差 分 析SPSS 19.0
( 进行检验，先用 对One-Way ANOVA) Levene’s test
数据进行方差齐性检验，如方差齐则采用 检验LSD
方法，如方差不齐则采用 检验方法，以Dunnett’ T3
P<0.05 表示差异有统计学意义。
2 结果　
2.1 PAG对HepG2/ADM细胞增殖抑制的影响 　
MTT 24 48 72 h PAG结果表明，作用 、 、 时， 可
剂量依赖性地抑制 细胞的增殖， 分HepG2/ADM IC50
别为( 、( 、( 。52.2±3.3) 33.4±2.8) 24.1±2.3) μmol/L
详见图 。1
2.2 PAG对HepG2/ADM细胞周期的影响 　
Pi单染流式细胞仪测定结果显示，与对照组相
比 ， 用 药 时 、 可 显 著 降 低24 h PAG(50 75 μmol/L)
HepG2/ADM G1细胞在 期的分布，可剂量依赖性地
( 、 、 显 著 增 加 细 胞 在25 50 75 μmol/L) HepG2/ADM
G2/M S期的分布，而对其在 的分布影响不明显，即
PAG G2/M 2可以使细胞阻滞在 期。详见图 。
2.3 PAG对HepG2/ADM细胞凋亡的影响　
x
366 广 东 医 学 院 学 报 2016 34 年 第 卷
Annexin V-FITC/PI双染的流式细胞仪检测结果
显示，与对照组相比，用药 时 可浓度依赖24 h PAG
性( 、 、 地显著增加 细胞25 50 75 μmol/L) HepG2/ADM
凋亡率。详见图 。3
2.4 PAG对HepG2/ADM细胞凋亡相关蛋白表达的　
影响
PAG 25 50 75 μmol/L)可浓度依赖性地( 、 、 显著
降低 细胞凋亡蛋白 和 ，HepG2/ADM caspase 3 PARP
显 著 增 加 和 表 达 水actived-caspase 3 cleaved-PARP
平，同时降低 的表达，增加 的表达(图 ，Bcl-2 Bax 4A)
此外， 还可浓度依赖性地( 、 、PAG 25 50 75 μmol/L)
显著促进 细胞 从线粒体释HepG2/ADM Cytochrome c
放到胞浆(图 。4B)
图1　PAG的结构及其对HepG2/ADM细胞增殖的影响(　　，n=3)，*P<0.05 vs 对照组。
OH
O
H
HOOC
Pterisolic acid G
OH
H
OH
100
80
60
40
20
0
细
胞
存
活
率
(%
)
0 3.125 6.25 12.5 25.0 50.0 75.0 μmol/L
24 h
48 h
72 h
x s±
0 μmol/L 25 μmol/L
50 μmol/L 75 μmol/L
G1: 70.9
S: 19.5
G2/M: 9.6
G1: 73.2
S: 15.4
G2/M: 11.4
G1: 50.1
S: 21.0
G2/M: 28.9
G1: 48.7
S: 14.6
G2/M: 36.7
细
胞
数
量

DNA含量
细
胞
周
期
分
布
(%
)
100
80
60
40
20
0
0 μmol L /
/25 μmol L
/50 μmol L
/75 μmol L
G1 S G2 M/
图2　PAG对HepG2/ADM细胞周期分布的影响(　　，n=3)，*P<0.05 vs 对照组。x s±
图3　PAG对HepG2/ADM细胞凋亡率的影响(　　，n=3)，*P<0.05 vs 对照组。
0 μmol/L 25 μmol/L
50 μmol/L 75 μmol/L
P
1
Annexin V-FITC
40
30
20
10
0
凋
亡
率
(
%
)
0 25 50 75
μPAG, mol/L
x s±
367第 期 4 张森旺，等. 半边旗二萜类成分PAG通过ROS诱导的线粒体凋亡克服肝癌多药耐药
2.5 PAG对HepG2/ADM细胞内ROS的影响　
DCFH-DA PAG检测结果表明 可浓度依赖性地
( 、 、 显 著 增 加 细 胞 内25 50 75 μmol/L) HepG2/ADM
ROS 5水平。详见图 。
0 25 50 75 μ /mol L
Casp 3
Active Casp3
PARP
Cleaved PARP
Bcl-2
Bax
β-actin
0 25 50 75 μ /mol L
cyt c
cox IV
cyt c
β-actin
Mito
Cytosol
A B
图4　PAG对HepG2/ADM细胞凋亡相关蛋白的影响
c
o
u
n
ts

FL1 LOG
0
0 μmol L /
/25 μmol L
/50 μmol L
/75 μmol L
4
3
2
1
0
0 25 50 75
μPAG, mol/L
平
均
荧
光
强
度
图5　PAG对HepG2/ADM细胞内ROS水平的影响(　　，n=3)，*P<0.05 vs 对照组。
2.6 NAC对PAG抑制HepG2/ADM细胞增殖的影响　
当 使 用 的 抑 制 剂 对1 mmol/L ROS NAC HepG2/
ADM 1 h 3.125 6.25 12.5 25.0细胞预处理 时， 、 、 、 、
50.0 75.0 μmol/L PAG 24 48 72 h 3、 的 在 、 、 个时间点
对 细胞增殖抑制作用均被不同程度地阻HepG2/ADM
断。详见图 。6
3 讨论　
原发性肝癌是全球第 大常见的恶性肿瘤， 占5
肿瘤致死原因的第 位， 全球每年有超过 万人患3 50
有肝癌 。我国是肝癌的高发地区，年发生率和年
[5]
死亡率均占全球的 以上 。虽然近年来治疗技术
[6]
50%
有了很大提高，但手术切除率及 年生存率仍处于5
较低水平。而且肝癌早中期无明显的临床表现，不
易察觉，有近 的肝癌患者在首诊时便被确诊为50%
晚期，失去了最佳的手术治疗时机，只能进行辅助
性综合治疗 。与其它肿瘤一样，化疗是在肝癌综
[7]
合治疗中的重要手段，然而由于肝癌细胞普遍存在
多药耐药现象，化疗效果并不理想 。克服肿瘤多
[8]
药耐药的常见方法为使用耐药逆转剂，目前已经发
现大量具有 逆转活性的合成药物，但是这类合MDR
成逆转剂的不良反应极大地限制了其在临床上的应
图6　NAC对PAG的增殖抑制作用的影响(　　，n=3)，
　　 *P<0.05 vs 对照组。
24 h
48 h
72 h
120
100
80
60
40
20
0
细
胞
存
活
率
(%
)
0 3 125. 6 25. 12 5. 25 0. 50 0. 75 0. PAG mol/Lμ
NAC 1mmol/L
x s±
x s±
368 广 东 医 学 院 学 报 2016 34 年 第 卷
用 。可见，寻找和开发能够克服肿瘤多药耐药的
[9]
新途径和方法对肝癌的临床治疗极其重要。
ROS是细胞通路中的重要第二信使，对正常的
生理过程具有重要的作用，但是其过度表达可以直
接或间接氧化或损伤 、蛋白质和脂质，进而导DNA
致细胞凋亡或坏死。由于肿瘤细胞更易产生 ，ROS
从而使得其更易受到促氧化剂的损伤。所以，促氧
化剂的使用被认为是抗肿瘤的有效方式之一 ，同
[10]
时，也是克服肿瘤多药耐药的可行途径 。
[11]
近 年来，本实验室对半边旗及其主要贝壳杉20
烷型二萜类成分 的抗肿瘤活性和作用机制开展了5F
大量的研究 ，但是对半边旗中其它的二萜类成分
[4]
研究还不够深入。最近的研究发现，贝壳杉烷型二
萜类成分 可以通过亚甲基环戊酮活性基Adenanthin
团与多种抗氧化酶( 、Peroxiredoxin I Peroxiredoxin II
和 上半胱氨酸残基的巯基发生Thioredoxin-1) Michael
反应，导致细胞内氧化还原平衡失调， 水平显ROS
著升高，从而发挥抗肿瘤活性 ，这唤起了我们
[12-14]
重新研究半边旗二萜类成分的热情。本研究发现，
半边旗中的贝壳杉烷型二萜类成分 对人肝癌耐PAG
药细胞 具有显著的细胞毒性，其作用机HepG2/ADM
制可能是通过增加细胞中 水平，促进细胞色素ROS C
从线粒体释放到胞浆，从而诱导细胞凋亡，但是其
具体的作用靶点是否与 相同，还有待进Adenanthin
一步的研究，其在克服肝药多药耐药的作用也有待
进一步证实。
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369第 期 4 张森旺，等. 半边旗二萜类成分PAG通过ROS诱导的线粒体凋亡克服肝癌多药耐药