全 文 ：227
杨 婷1，武 芸1，2，* ，郑小江1，2
(1.生物资源保护与利用湖北省重点实验室，湖北民族学院，湖北恩施 445000;
2.湖北民族学院生物科学与技术学院，湖北恩施 445000)
摘 要:研究了热水浸提海金沙组培苗水溶性多糖和总黄酮综合提取工艺的优化。在单因素实验的基础上，选定提取
温度、提取时间及料液比进行 3 因素 3 水平中心组合实验，建立水溶性多糖和总黄酮的总得率二次回归方程，通过响
应面分析得到较优的综合提取工艺参数为提取时间 2.1h、提取温度 80.6℃和料液比 1∶26.2(g /mL)。在此优化条件下
得到海金沙组培苗中水溶性多糖提取得率为 13.241%，总黄酮得率为 3.211%，二者总得率为 16.452%。
关键词:海金沙，水溶性多糖，总黄酮，综合提取，响应面分析
Optimization of simultaneous extraction of water－soluble polysaccharides
and total flavone from Lygodium japonicum by tissue culture
YANG Ting1，WU Yun1，2，* ，ZHENG Xiao－jiang1，2
(1.Key Laboratory of Biologic Resources Protection and Utilization of Hubei Province，
Hubei Institute for Nationalities，Enshi 445000，China;
2.Biological Scientific and Technical College of Hubei University for Nationalities，Enshi 445000，China)
Abstract:The comprehensive extraction technique of water－soluble polysaccharides and total flavone from tissue
cultured Lygodium japonicum was studied.Based on single factor experiments，a central composite design(CCD)
involving three variables such as extraction temperature，time and solid / liquid ratio at three levels was employed
for establishing a quadratic regression model describing total extraction yield of water－ soluble polysaccharides
and total flavonoids at different levels of the above variables. The optimal technical conditions of extraction by
central composite design and response surface analysis(RSA)were as follows:extraction time 2.1h，extraction
temperature 80.6℃，solid / liquid ratio of 1 ∶26.2.Under the optimized conditions，the water－ soluble polysaccharide
yield was 13.241%，the total flavone yield was 3.211%，and both of the total extraction yield was 16.452% .
Key words:Lygodium japonicum;water－ soluble polysaccharides;total flavone;simultaneous extraction;response
surface analysis(RSA)
中图分类号:TS201.1 文献标识码:B 文 章 编 号:1002－0306(2011)11－0227－04
收稿日期:2011－08－18 * 通讯联系人
作者简介:杨婷(1991－) ，女，本科，研究方向:植物生物技术。
基金项目:生物资源保护与利用湖北省重点实验室开放课题(2011) ;
湖北省科技厅创新团队项目(2009CDA155) ;2010 年恩施
州科技指导项目;湖北民族学院生科院大学生创新课题。
海金沙 (Lygodium japonicum)是海金沙科
(Lygodiaceae)海金沙属(Lygodium)多年生蕨类植
物［1－3］，全草和成熟孢子均可入药，有利水通淋、清热
解毒之功效，可治疗尿路结石、尿路感染、肾炎水肿、
湿热肿满、皮肤湿疹、肠炎痢疾、咽喉肿痛等症状。
海金沙多糖是海金沙的有效成分之一，对细菌及真
菌都有抑制作用，具有修复造血系统、调节机体免
疫、抗肿瘤、抗病毒和抗氧化等作用。海金沙黄酮具
有抗肿瘤及抑菌作用，在临床上，海金沙已作为一种
中草药应用于防治肿瘤等疾病，将海金沙多糖、黄酮
开发为天然药物免疫促进剂和调节剂应用于疾病防
治方面具有重要意义［4－6］。目前对黄酮、多糖类化合
物的提取、分离和含量测定方法较多［7－9］，而有关海
金沙水溶性多糖和总黄酮的综合提取研究还未见报
道，本研究采用热水浸提法对海金沙组培苗可溶性
多糖和总黄酮的综合提取工艺条件进行优化，应用
响应面分析法来确定其最佳提取工艺［10－16］，具有回归
方程精度高、实验周期短、能同时研究几种因素间交
互作用等优点。本研究旨在为海金沙综合开发利用
提供技术支撑。
1 材料与方法
1.1 材料与设备
海金沙组培苗 生物资源保护与利用湖北省重
点实验室(湖北民族学院)组培室提供，将海金沙组
DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2011.11.047
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培苗先用自来水洗净，再用蒸馏水冲洗 2～3 次，于
55～60℃烘箱中烘至恒重，用粉碎机磨成粉末，过 60
目筛，装于试剂瓶中，干燥器内贮存备用;无水乙醇、
95%乙醇、苯酚、正丁醇、氯仿、标准葡萄糖、浓硫酸、
芦丁标准品(含结晶水)、5% NaNO2、1mol /L NaOH、
10%Al(NO3)3 等 分析纯，均由恩施市红霞化工有
限公司提供;水 双蒸水。
SZ－93双重蒸馏水器、植物样品粉碎机、756MC－
紫外分光光度计、RE－52 型旋转蒸发器 上海亚荣生
化仪器厂;HWS12电热恒温水浴锅 上海一恒科技有
限公司;DGX型电热鼓风干燥箱 上海福玛实验设备
有限公司;S21－3 磁力搅拌器 上海司乐仪器厂;pH
计(PHS－3C)、冷冻干燥机、低速大容量多管离心机
上海安亭科学仪器厂;B－191喷雾干燥仪 瑞士。
1.2 实验方法
1.2.1 海金沙组培苗多糖和黄酮综合提取工艺流程
精确称取海金沙组培苗粉末 1.0g→热水浸提水溶性多糖
和总黄酮→离心→收集上清液→浓缩为适当体积→加入 3 倍
体积乙醇→低温静置 24h→离心→
a.上清液→减压浓缩→冷冻干燥→黄酮→30%微热乙
醇溶解→定容至 50mL备用。
b.沉淀→再复溶醇沉一次→冷冻干燥→多糖→水溶并
定容至 50mL备用。
1.2.2 多糖含量测定 苯酚 －硫酸法测定多糖
含量［17－18］。
1.2.2.1 标准曲线制作 精密称取葡萄糖标准品
17mg，置于 50mL容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，
摇匀，即得葡萄糖标准液。每管加入葡萄糖标准液
和双蒸水后立即混匀，待各管都加入苯酚试剂后，迅
速摇匀，然后迅速加入浓硫酸 5mL 置于各试管中摇
匀，之后置于 40℃水浴中，准确加热 15min 后，立即
取出置于流水中冷却 10min。再取出所有试管用
1cm口径的比色皿，以第一管为空白，迅速测定其余
各管的吸光度。以糖的质量分数为横坐标、吸光度
(A490nm)为纵坐标，绘出相关标准曲线并得出线性回
归方程:A =0.7940x － 0.0304，R2 = 0.9990。
1.2.2.2 多糖含量测定 吸取 3 份 5.0mL样液置于 3
支具塞试管中，加苯酚 1.0mL 和浓硫酸 5.0mL，同上
做空白对照，于波长 490nm处测定吸光度，按标准曲
线回归方程计算出葡萄糖的质量分数(mg /mL)。
多糖含量(%)= C × V × Nm ×100% 式(1)
式中，C 为测得样品溶液中葡萄糖的质量分数，
mg /mL;V 为样品溶液的最终稀释体积，mL;N 为稀
释倍数;m为样品质量，mg。
1.2.3 总黄酮含量测定
1.2.3.1 芦丁标准曲线制作 标准液制备:准确称取
芦丁标准品 5.0g(含结晶水) ，用 30%微热乙醇溶解，
倒入 50mL 容量瓶中，用 30% 乙醇定容得浓度为
0.1mg /mL的标准液。
标准曲线制作:准确吸取标准液 0、0.1、0.2、0.3、
0.4、0.5mL 置于 6 支具塞试管中，加 30% 乙醇到
5mL，加 5%NaNO2 溶液 0.3mL，摇匀放置 6min。再加
入 10% Al(NO3)3 溶液 0.3mL，摇匀放置 6min 后，加
1mol /L NaOH溶液 4mL，加 30%乙醇 0.4mL，摇匀后
放置 10～15min，于 510nm 处测定吸光度，以芦丁的
质量分数为横坐标、吸光度(A510nm)为纵坐标，绘出相
关标准曲线并得出线性回归方程:A = 1.1624x +
0.017，R2 = 0.9998。
1.2.3.2 总黄酮含量测定 采用亚硝酸钠－硝酸铝－
氢氧化钠络合分光光度法测定总黄酮含量。精确吸
取 3 份 5mL 样液置于 3 支具塞试管中，各加 5%
NaNO2 溶液 0.3mL，摇匀后放置 6min，加入 10%
Al(NO3)3 溶 液 0.3mL，摇匀后放置 6min，加入
1moL /L NaOH溶液 4mL，加对应浓度乙醇 0.4mL，摇
匀后放置 10～15min。以试剂空白作对照，于 510nm
波长处测定吸光度，求出 3 组平均值，查标准曲线，
计算出样液中总黄酮质量分数。
总黄酮含量(%)= C × V × Nm ×100% 式(2)
式中，C为测得样品溶液中总黄酮的质量分数，
mg /mL;V 为样品溶液的最终稀释体积，mL;N 为稀
释倍数;m为样品质量，mg。
1.2.4 单因素实验 分别以提取温度、提取时间、料液
比以及提取次数为单因素进行实验，考察各单因素对
浸提液中水溶性多糖和总黄酮得率的影响。
温度的影响:精确称取 1.0g 海金沙组培苗粉于
锥形瓶中，加入 25mL 蒸馏水，在不同温度的水浴中
提取 2h，连续提取 2 次，按 1.2.1 方法获得水溶性多
糖和总黄酮。所有实验设计 3 组平行实验，所得实
验结果为其平均值(以下同)。
料液比的影响:精确称取 1.0g 海金沙组培苗粉
15 份于锥形瓶中，分成 3 组，每组分别加入蒸馏水
10、20、30、40、50mL，在 80℃水浴锅中提取 2h，连续
提取 2 次。
提取时间的影响:称取 1.0g 的海金沙组培苗干
粉于锥形瓶中，加入蒸馏水 30mL，在 80℃的水浴锅
中提取一定时间，连续提取 2 次。
提取次数的影响:称取 1.0g 样粉于锥形瓶中，各
按 1∶30 料液比加入蒸馏水，80℃水浴锅中提取 2h，
连续提取一定的次数。
1.2.5 中心组合实验 在单因素实验基础上，确定
中心组合实验(CCD)的因素与水平，以测量粗多糖
和黄酮的总提取量为响应值，通过响应面分析
(RSA)对提取条件进行优化。参考单因素实验结
果，根据 Box－Benhnken 中心组合实验设计原理，以
浸提温度、料液比和浸提时间为因素设计中心组合
实验(见表 1)。
表 1 中心组合设计的因素与水平表
水平编码
因素
X1浸提温度
(℃)
X2料液比
(g /mL)
X3浸取时间
(h)
－ 1 70 1∶30 1
0 80 1∶40 2
1 90 1∶50 3
2 结果与分析
2.1 单因素实验结果分析
229
2.1.1 温度对海金沙组培苗水溶性多糖和总黄酮提
取得率的影响 结果(见图 1)显示，海金沙组培苗总
黄酮得率随温度升高先上升后下降，70℃达到最大
值 2.9%，在 70～100℃时，随温度升高而下降的原因
可能是高温使黄酮的化学结构受到了破坏。其水溶
性多糖得率随着温度的升高呈现上升趋势，但在
90～100℃时其得率略有下降。
图 1 温度对黄酮和多糖得率的影响
2.1.2 料液比对海金沙组培苗水溶性多糖和总黄酮
提取得率的影响 结果(见图 2)表明，在一定料液比
范围内，海金沙黄酮和多糖含量随蒸馏水体积的增
加不断升高，到料液比 1∶40 时达到最大值，而后略为
下降。料液比 1∶40(g /mL)比较理想。
图 2 料液比对黄酮和多糖得率的影响
2.1.3 提取时间对多糖和黄酮提取得率的影响 结
果见图 3。由图 3 可知，总黄酮的提取量随着时间的
延长先上升后略为下降，在提取 2h 时达到最高。多
糖的提取量在一直呈上升趋势，2h 后变化不大。综
合分析，提取 2h比较理想。
图 3 提取时间对多糖和黄酮得率的影响
2.1.4 提取次数对海金沙浸提液中多糖和黄酮提取
得率的影响 结果(见图 4)表明，随提取次数的增
加，总黄酮和多糖得率都呈下降趋势，第 1次和第 2 次
已经将绝大部分的总黄酮和多糖提取出来了，第 3、4
次的提取物得率比较少，几乎可以忽略不计。因此，本
实验选择提取 2次，提取物得率为两次提取之和。
2.2 中心组合实验结果分析
参考单因素实验结果，根据 Box－Benhnken 中心
组合实验设计原理，以浸提温度、料液比和浸提时间为
图 4 提取次数对多糖和黄酮得率的影响
因素设计中心组合实验(见表 1) ，实验结果见表 2。
表 2 中心组合实验方案与结果
实验号 X1 X2 X3
多糖得率
(%)
黄酮得率
(%)
总得率
(%)
1 － 1 － 1 0 5.521 1.452 6.973
2 － 1 0 － 1 7.805 1.402 9.207
3 － 1 0 1 6.987 1.847 8.834
4 － 1 1 0 7.543 2.058 9.601
5 0 － 1 － 1 8.648 2.348 10.996
6 0 － 1 1 7.587 2.485 10.072
7 0 1 － 1 8.326 2.606 10.932
8 0 1 1 8.015 1.78 9.795
9 1 － 1 0 8.691 1.782 10.473
10 1 0 － 1 8.947 2.048 10.995
11 1 0 1 9.057 2.33 11.387
12 1 1 0 9.598 2.298 11.896
13 0 0 0 12.019 2.587 14.606
14 0 0 0 11.763 2.964 14.727
15 0 0 0 12.187 2.678 14.865
在 15 个实验中，1～12 是析因实验，13～15 是中
心实验，用来估计实验误差。以海金沙组培苗水溶
性多糖和总黄酮的总得率为响应值(Y) ，所得结果用
响应面分析软件(SAS)分析，经二次回归拟合求得响
应函数，即回归方程为:
Y = 12.564 + 0.925X1 + 0.524X2 + 0.368X3 －
3.156X21 －0.258X2X1 －2.369X
2
2 + 0.087X3X1 －0.697X2X3
－0.657X23
从表 3 的 t检验方差分析表中可以看出，一次项
中，浸提温度对海金沙组培苗浸提液中水溶性多糖
和总黄酮总得率的影响达到了极显著水平;提取时
间对其浸提液中多糖和黄酮总得率的影响达到了显
著水平;而料液比的影响不显著。因此，影响浸提液
中多糖和黄酮总得率的各因素按影响大小排序依次
为提取温度、提取时间、料液比。在交互项中，X21、
X22、X3X2、X
2
3对提取率有显著影响，而其他因素之间
的交互作用不显著。
经回归方程方差分析，用上述回归方程描述各
因素与响应值之间的关系时，因线性关系显著(R2 =
0.9918) ，模型的显著水平远远小于 0.01，此时该回归
方差模型是极显著的，因此，该实验方法可靠。而方
程失拟误差不显著，这说明各因素值和响应值之间
的关系可以用此模型来函数化，可用该回归方程代
替实验真实点对实验结果进行分析。回归方程各项
的方差分析结果还表明，方程一次项和二次项影响
极显著，交互项不显著，因此各实验因子对响应值的
影响不是简单的线性关系。
230
表 3 t检验方差分析
因素 参数估计值 标准误差 t Pr
常数项 12.564 0.1147 68.547 ＜ 0.0001
X1 0.925 0.2471 14.000 ＜ 0.0001
X2 0.524 0.2471 9.257 0.8214
X3 0.368 0.2471 14.014 0.0124
X21 － 3.156 0.3684 － 7.53 0.0065
X2X1 － 0.258 0.3015 0.79 0.2145
X22 － 2.369 0.3684 － 7.26 0.0084
X3X1 0.087 0.1498 0.21 0.2547
X3X2 － 0.697 0.1498 － 5.68 0.0125
X23 － 0.657 0.2456 － 9.25 0.0050
表 4 回归方程的方差分析
方差来源 自由度 平方和 F值 Pr 显著性
总回归 9 0.9903 87.69 0.0002 ＊＊
一次项 3 0.6998 90.17 ＜ 0.0001 ＊＊
二次项 3 0.2610 72.36 0.0005 ＊＊
交互项 3 0.0294 9.63 0.0475
失拟项 3 1.139410 15.32 0.0154
误差项 2 0.089464
总误差 5 0.719432
注:＊＊表示极显著水平(p ＜ 0.01)。
从典型分析表(表 5)中可以看出，3 个因素的特
征值都是负值，表明此二次响应面存在极值。由 SAS
分析所得编码值为:X1 = 0.1653，X2 = 0.4824，X3 =
0.2154;由编码值可得最佳工艺参数为:提取时间
2.1h、提取温度 80.6℃、料液比 1∶26.2(g /mL)。在此
优化条件下对实验结果进行验证实验，得到海金沙
中多糖提取量为 13.241%，黄酮提取量为 3.211%，二
者总得率为 16.452%，与理论预测值 15.591% 基本
相符，说明响应面分析法对水溶性多糖和总黄酮提
取量的优化具有实际应用价值。
表 5 典型分析表
特征值
特征向量
X1 X2 X3
－ 1.2365
－ 1.8472
－ 1.0365
0.02451
－ 0.12545
－ 0.02654
－ 0.2451
0.1254
0.9852
0.6521
0.3254
0.2541
3 结论
本研究以海金沙组培苗为原料，利用热水浸提
乙醇沉淀的方法，以水溶性多糖和总黄酮的总得率
作为评价指标，用响应面分析法对综合提取水溶性
多糖和总黄酮的工艺条件进行优化，最佳综合提取
的工艺参数为:提取时间 2.1h、提取温度 80.6℃、料液
比 1∶26.2(g /mL)。在此优化条件下得到海金沙组培
苗中水溶性多糖提取得率为 13.241%、总黄酮得率为
3.211%，二者总得率为 16.452%。本研究可为海金
沙综合开发利用提供技术支撑。
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