全 文 ：黔产毛蒟提取物的制备及其化学成分的定性分析
杨艳1，吴芹2，龚其海2，徐世兵3，石京山2Δ
(1. 遵义医学院附属医院 药剂科，贵州 遵义 563003;2. 遵义医学院 药理学教研室，贵州 遵义 563002;
3. 遵义市湄潭县人民医院，贵州 遵义 564100)
［摘要］ 目的 考察黔产毛蒟提取物制备的最佳工艺，定性分析各提取物的化学成分。方法 采用溶剂回流加热法进行提取。
在单因素试验的基础上，以提取次数、提取时间、料液比和浸泡时间为因素安排 L9(3
4)正交试验，以提取率为指标，优选黔产毛蒟提
取的最佳工艺;经 D-101 大孔吸附树脂分离，得到黔产毛蒟水洗脱液、醇洗脱液;采用理化分析方法对黔产毛蒟提取物进行初步定性
分析。结果 提取最佳工艺为:提取时间为 2 h，提取次数为 3 次，料液比为 1∶30，浸泡时间为 2 h;经过初步定性反应确认总提取物
含有氨基酸、多肽、蛋白质、生物碱、甾体或三萜类、黄酮、皂苷、多糖、还原糖及糖苷、香豆素及萜类内酯化合物、酚类和鞣质成分;水洗
脱物含有氨基酸、多肽、蛋白质、皂苷、多糖、还原糖及糖苷、香豆素及萜类内酯化合物;乙醇洗脱物含有氨基酸、多肽、蛋白质、生物碱、
甾体或三萜类、黄酮、多糖、还原糖及糖苷、酚类和鞣质成分。结论 黔产毛蒟提取的最佳工艺提取率高、稳定可行。
［关键词］ 毛蒟;提取工艺;定性分析;正交试验设计
［中图分类号］ Ｒ284 ［文献标识码］ A ［文章编号］ 1005 － 1678(2015)05 － 0169 － 05
作者简介:杨艳，女，硕士，副教授，研究方向:医院药学工作，E-mail:
ZYFYYYmY@ 163. com;石京山，通讯作者，男，博士，教授，博士生导师，研究方
向:药理学，E-mail:shijs@ zmc. edu. cn。
Analysis of Piper puberulum (Benth. )Maxim. extracts preparation and the
preliminary qualitative chemical composition
YANG Yan 1，WU Qin2，GONG Qi-hai2，XU Shi-bing3，SHI Jing-shan2Δ
(1. Department of Pharmacy，Affiliated Hospital of Zunyi Medical College，Zunyi 563003，China;
2. Department of Pharmacology，Zunyi Medical College，Zunyi 563002，China;3. Meitan
Peoples Hospital，Zunyi 564100，China)
［Abstract］ Objective To investigate optimal extraction process of Piper puberulum (Benth. )Maxim. and qualitative analyze the chemical
component of the extracts． Methods Method of solvent heating reflux was used for extraction. On the basis of single factor experiment，L9(3
4)orthogonal
experiment was designed with the variants of extraction frequency，time，material-liquid ratio，and immersion time. Extraction rate as index，extraction
processes were optimized to achieve best extraction. The extracts，including total extract，water elution，and ethanol elution，were physiochemically
analysed to achieve an initial qualitative result． Ｒesults The optimal extraction process was:extractions 3 times for 2 hours，with an 1 ︰ 30 material -
liquid ratio and 2 hours of immersion，Initial qualitative analyzed the total extracts containing amino acids，polypeptides，proteins，alkaloids，steroids or
triterpenes，flavones，saponins，polysaccharides，reducing sugars or glucosides，cumarins，terpene lactones，phenols，and tannins. The water
elution containing:amino acids，polypeptides，proteins，saponins，polysaccharides，reducing sugars or glucosides，cumarins，and terpene
lactones. The ethanol elution containing:amino acids，polypeptides，proteins，alkaloids，steroids or triterpenes，flavones，polysaccharides，
reducing sugars or glucosides，phenols，and tanins． Conclusion The experiments show that optimal extraction process can achieve high extraction
yield，stable and practical．
［Keywords］ Piper puberulum (Benth. )Maxim. ;extraction process;qualitative analysis;orthogonal experiment design
毛蒟［Piper puberulum (Benth.)Maxim.］系胡椒科胡椒属植
物，为多年生攀援藤本，全株有浓烈香气，幼枝纤细，密被短柔
毛。常生长在密林、疏林中、沟边阴湿处，主要分布于我国的四
川、云南，贵州、广西、广东等地。毛蒟全株可药用，具有行气止
痛，祛风活血之功效，主治风湿性痹痛、风寒头痛、胃脘痛等［1］。
毛蒟在贵州民间已用于治疗急慢性肝损伤，疗效显著，未发现不
良反应［2］，因此值得研究开发。根据文献记载，胡椒科植物多具
有温中散寒、行气止痛等功效［3］。毛蒟同属植物海风藤、假蒟等
均已见化学成分［4-6］、药理活性方面的研究［7］，但毛蒟化学成分
尚不清楚，所以本实验以质量提取率为指标，在单因素实验的基
础上应用正交实验对提取工艺进行优化，以确定最佳的提取条
件，并对提取物的化成成分进行初步分析，旨在为广泛深入研
究、开发此植物提供实验依据。
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中国生化药物杂志 2015 年第 5 期 总第 35 卷 生化药物技术
1 材料与方法
1. 1 实验仪器 50 × 900 mm玻璃层析柱(上海琪特分析仪
器有限公司)、SHHW电热恒温三用水浴锅(北京永光明医疗仪
器厂)、DHG-9123A电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有
限公司)、MODULYOD-230 冷冻干燥机(Thermoelectron 公司)。
1. 2 药材与试剂 新鲜毛蒟采自于贵州省黔东南州锦屏
县，经贵州省遵义医学院附属医院药剂科杨建文副教授鉴定为
胡椒科胡椒属植物毛蒟的变种［Piper puberulum (Benth. )
Maxim. ］。其他试剂均为分析纯。
1. 3 毛蒟提取工艺条件
1. 3. 1 药材的处理:新鲜毛蒟(20 g)以纯化水适当冲洗去
除泥土，于 40 ℃烘箱中低温干燥，粉碎成粗粉，密封于璃瓶内
备用。
1. 3. 2 毛蒟的提取方法:称取约 10 g毛蒟干燥粗粉放置于
圆底烧瓶中，按一定比例加入蒸馏水(料液比)，浸泡合适的时间
(浸泡时间)，加热提取数小时(提取时间)，加热结束后，趁热真
空抽滤，收集滤液。残渣用蒸馏水洗入圆底烧瓶中，再次加热回
流提取，提取数次(提取次数)后，同样趁热真空抽滤，合并滤液。
滤液于旋转蒸发仪减压回收溶剂、浓缩，置于冷冻干燥机干燥得
毛蒟总提取物。
1. 3. 3 提取工艺单因素实验:①料液比:分别称取约 10 g
毛蒟粗粉末 5 份，于圆底烧瓶中，加入 100、200、300、400、500 mL
(料液比为 1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50)蒸馏水，浸泡 2 h，
固定提取温度，提取时间 2 h的条件下，提取 3 次，考察料液比对
粗提取物的质量提取率的影响，每一条件下重复测定 3 次，取平
均值。②提取次数:分别称取约 10 g毛蒟粗粉末 5 份，于圆底烧
瓶中，加入“1. 3. 3”项下①方法得到的质量提取率最高的体积比
的水，浸泡 2 h，固定提取温度，提取时间 2 h的条件下，提取 1、2、
3、4 次，考察提取次数对粗提取物的质量提取率的影响，每一条
件下重复测定 3 次，取平均值。③提取时间:分别称取约 10 g毛
蒟粗粉末 5 份，于圆底烧瓶中，加入“1. 3. 3”项下①方法得到的
质量提取率最高的体积比的水，浸泡 2 h，固定提取温度，提取时
间 0. 5、1. 0、2. 0、3. 0、4. 0 h 的条件下，按照提取“1. 3. 3”项下②
方法得到的质量提取率最高的次数，考察提取时间对粗提取物
的质量提取率的影响，每一条件下重复 3 次，取平均值。④药材
浸泡时间:分别称取约 10 g 毛蒟粗粉末 5 份，于圆底烧瓶中，加
入“1. 3. 3”项下①方法得到的质量最高的体积比的水，浸泡 0. 5、
1、1. 5、2、2. 5 h，固定提取温度，提取时间为“1. 3. 3”项下③质量
提取率最高的时间，提取“1. 3. 3”项下②方法得到的质量提取率
最高的次数，考察药材浸泡时间对质量提取率的影响，每一条件
重复 3 次，取平均值。
1. 3. 4 提取工艺正交实验:在单因素实验的基础上，以料
液比(A)、浸泡时间(B)、提取次数(C)、提取时间(D)为考察因
素。以质量提取率为指标，选用 L9(3
4)正交表根据“1. 3. 3”项下
的方法安排提取实验。每一水平重复 3 次，取其平均值。采用
直观分析方法，根据极差大小和方差分析确定影响提取因素的
主次顺序。正交实验因素水平，见表 1。
表 1 提取正交实验因素水平表
Tab. 1 Factors and levels of extraction test
水平
A B C D
料液比 浸泡时间(h) 提取次数 提取时间(h)
1 1∶10 1. 5 1 0. 5
2 1∶20 2. 0 2 1. 0
3 1∶30 2. 5 3 2. 0
料液比 =毛蒟干燥粗粉质量︰蒸馏水质量
1. 3. 5 提取工艺参数的验证试验:称取毛蒟粗粉末约 10 g
各 3 份，用“1. 3. 4”优选出来的最佳提取工艺参数照“1. 3. 2”项
下的方法进行重复性实验 3 次，分别计算质量提取率，以此来验
证提取工艺的稳定性和可行性。
1. 3. 6 毛蒟总提取物的制备:取毛蒟干燥药材 10. 0 kg，粉
碎，用 1∶30 体积比的蒸馏水浸泡 2 h，冷凝回流 3 次，每次回流
时间为 2 h，真空抽滤后合并滤液，减压浓缩后冷冻干燥，得得毛
蒟总提取物(以下简称总提物)。
1. 3. 7 毛蒟总提取物的分离:将毛蒟总提取物进行分离，
采用 D-101 大孔树脂，将其进行酸、碱处理，得到大孔树脂填装，
再将大孔树脂填装进行醇、水处理，得到待用大孔树脂;将上一
步骤中得到的毛蒟总提取物溶解、离心，得到总提物上清液;将
总提物上清液缓慢加入待用大孔树脂内进行水洗脱;将水洗脱
毕后的水洗液减压回收溶剂，得到水洗浸膏，再将该水洗浸膏冷
冻干燥后，即得到毛蒟水提物;另外，将水洗脱毕的余下物进行
醇洗脱，将得到的醇洗液减压回收溶剂，得到醇洗浸膏，将该醇
洗浸膏冷冻干燥后，即得到毛蒟醇提物。
1. 3. 8 总提物、水洗物、醇洗物定性实验:
① 氨基酸、多肽、蛋白质的定性检测:
茚三酮(Ninhydrin)实验:分别取总提液 2 mL 于试管中，加
试剂 3 ～ 5 滴，在沸水浴上加热 5 min，冷却后有蓝色或蓝紫色出
现。以乙醇液为对照，同法进行操作。
双缩脲(Biuret)反应:分别取总提液 2 mL于试管中，加入试
剂，摇动，冷却时候显绿色—紫红色。以乙醇液为对照，同法进
行操作。
② 生物碱的定性实验
碘-碘化钾(Wagner)实验:分别取总提液 2mL 于试管中，加
入试剂，生成棕色沉淀。以乙醇液为对照，同法进行操作。
碘化汞钾(Mayer)实验:分别取总提液 2 mL 于试管中，加入
试剂，生成红棕色沉淀。以乙醇液为对照，同法进行操作。
苦味酸试剂:分别取总提液 2 mL 于试管中，加入试剂，生成
棕黄色沉淀。以乙醇液为对照，同法进行操作。
③ 甾体或三萜类的定性检测
Liebrmann-Burchand反应:分别取总提液 0. 5 mL 悬浮于
1 mL 醋酐中，沿试管壁缓慢滴加 1 mL 浓硫酸，溶液逐渐呈紫红
色。以乙醇液为对照，同法进行操作。
④ 黄酮的定性检测
铅盐反应:分别取总提液 2 mL 于试管中，加入试剂，生成棕
黄色沉淀。以乙醇液为对照，同法进行操作。
三氯化铝-乙醇实验:分别取总提液 2 mL 于试管中，加入试
剂，充分振摇，于 365 nm 下呈现明显绿色或黄绿色荧光。以乙醇
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生化药物技术 中国生化药物杂志 2015 年第 5 期 总第 35 卷
液为对照，同法进行操作。
⑤ 皂苷的定性检测
泡沫实验:分别取总提液 2 mL 于试管中，充分振摇，产生蜂
窝状泡沫，10 min 不消退，加入少量 95%乙醇泡沫也无明显减
少。以乙醇液为对照，同法进行操作。
⑥ 多糖、还原糖及糖苷的定性检测
α-萘酚试剂反应:分别取总提液 2 mL 于试管中，加入 5%
α-萘酚乙醇溶液 3 ～ 5 滴，充分振摇，再沿试管壁缓慢滴加
0. 5 mL浓硫酸，在试液与浓硫酸交界处形成紫色环。以乙醇液
为对照，同法进行操作。
费林(Fehling)试剂反应:分别取总提液 2 mL 于试管中，加
试剂 3 ～ 5 滴，充分振摇，在沸水浴上加热 5 min，有砖红色沉淀生
成。以乙醇液为对照，同法进行操作。
多糖实验:分别取总提液 2 mL 于试管中，分加入 1 倍量的
95% 乙醇，出现絮状悬浮物或沉淀。以蒸馏水为对照，同法进行
操作。
⑦ 香豆素及萜类内酯化合物的定性检测
开环闭环反应:分别取总提液 1 mL 于试管中，加入 1% 氢
氧化钠溶液 2 mL 在沸水浴上加热 3 ～ 4 min，再加入 2% 盐酸酸
化，放置一段时间液体出现浑浊或沉淀。以乙醇液为对照，同法
进行操作。
⑧ 酚类和鞣质的定性检测
氯化钠-明胶试剂反应:分别取总提液各 2 mL于试管中，加
入试剂，出现白色沉淀。以乙醇液为对照，同法进行操作。
三氯化铁试剂反应:分别取总提液 2 mL于试管中，滴加 2 ～
3滴醋酸酸化，摇匀，再加入试剂，呈蓝或墨绿色。以乙醇液为对
照，同法进行操作。
表 2 定性检测实验现象
Tab. 2 Phenmenon of qualitative detection experiment
检出成分 定性检测实验及试剂 反应现象
氨基酸、多肽、蛋白质
1. 茚三酮(Ninhydrin)试剂
2. 双缩脲(Biuret)反应
显蓝紫色
显绿色
生物碱
1. 碘-碘化钾(Wagner)试剂
2. 碘化汞钾(Mayer)试剂
3. 苦味酸试剂
棕色沉淀
红棕色沉淀
棕黄色沉淀
甾体或三萜类 1. Liebrmann-Burchand反应 显紫红色
黄酮
1. 铅盐反应
2. 三氯化铝-乙醇试剂
黄棕色沉淀
绿色或黄绿色荧光
皂苷 1. 泡沫实验 持久性泡沫
多糖、还原糖及糖苷
1. α-萘酚试剂
2. 费林(Fehling)试剂
3. 多糖实验
紫红色环
砖红色沉淀
絮状悬浮物
香豆素及萜类内酯化
合物
1. 开环闭环反应 浑浊或沉淀
酚类和鞣质
1. 氯化钠-明胶试剂
2. 三氯化铁试剂
乳白色浑浊
显墨绿色
2 结果
2. 1 提取单因素实验结果
2. 1. 1 料液比对质量提取率的影响:随着料液比的增加，
提取率一直是递增趋势，料液比为 1∶50 时提取率达到最高为
22. 31%。但是在料液比 1∶30 之后升高趋势变得缓慢，说明在
料液比为 1∶30 时提取很充分。提取溶剂体积太大会给后续的
过滤、浓缩等工作带来困难，综合上述因素，因此选择最佳的料
液比在 1∶30 为宜。见图 1。
图 1 料液比对提取率的影响
Fig. 1 Effect of the ratio of material to liquid on extraction yield
2. 1. 2 浸泡时间对质量提取率的影响:提取率随着浸泡时
间的增加，也逐渐增大，而且一直是递增趋势，当浸泡时间为
2. 5 h时提取率达到最高点，但 2. 0 h和 2. 5 h的质量提取率相差
不大，结合实际生产，提高生产效率，因此选择浸泡时间在 2. 0 h
较适宜。见图 2。
图 2 浸泡时间对提取率的影响
Fig. 2 Effect of steeping time on extraction yield
2. 1. 3 提取时间对质量提取率的影响:提取率在 2 h 时达
到最高点，在此之后提取率下降，说明药材中某些有效成分可能
因为提取时间的延长而发生了分解，综合考虑工业生产的效率
等问题，因此选择最佳的提取时间在 2. 0 h为宜。见图 3。
图 3 提取时间对提取率的影响
Fig. 3 Effect of extract time on extraction yield
2. 1. 4 提取次数对质量提取率的影响:从图 4 可知，提取率
随着提取次数的增加而增大，提取 3 次时达到最大 10. 03%，由
于提取 3 次与提取 4 次的提取率相差不大，从节约成本、时间的
角度考虑，本实验认为 3 次提取已经较为充分，效果较好，选择
最佳的提取次数为 3 次。见图 4。
图 4 提取次数对提取率的影响
Fig. 4 Effect of extract times on extraction yield
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2. 2 正交试验结果 正交试验结果见表 3，方差分析结果
见表 4。从表 3 的直观分析结果、表 4 的方差分析结果可知:其
中 A、C、D因素均有显著性差异、B因素没有显著性差异，C因素
影响最大、其次是 A因素、再次是 D 因素、B 因素。即各因素对
提取率的影响程度依次为提取次数 ＞料液比 ＞提取时间 ＞浸泡
时间。综合直观分析和方差分析的结果，提取的最佳水平组合
为 A3B2C3D3即以 1∶30 倍体积的溶剂浸泡药物粉末 2. 0 h，加热
回流提取 3 次，每次提取 2. 0 h。
表 3 L9(3
4)正交试验结果
Tab. 3 Ｒesults of orthogonal test L9(3
4)
实验号
因 素
A B C D
提取率
%
1 1 1 1 1 9. 35
2 1 2 2 2 16. 17
3 1 3 3 3 22. 72
4 2 1 2 3 21. 57
5 2 2 3 1 24. 88
6 2 3 1 2 9. 42
7 3 1 3 2 26. 20
8 3 2 1 3 16. 42
9 3 3 2 1 23. 29
K1 48. 24 57. 12 35. 19 57. 52
K2 55. 87 55. 47 61. 03 51. 79
K3 65. 91 55. 43 73. 8 60. 71
Ｒ 17. 67 2. 04 38. 61 8. 92
质量提取率 =冷冻干燥后提取物粉末质量 /毛蒟粗粉末质量 × 100%
表 4 方差分析结果
Tab. 4 Ｒesult of variance analysis
方差来源 离均差平方和 自由度 均方 F P
A 0. 018 2 0. 009 50. 294 ＜ 0. 05
B 0. 000 2 5. 16E-005 0. 294
C 0. 051 2 0. 025 144. 192 ＜ 0. 05
D 0. 002 2 0. 001 7. 113 ＜ 0. 05
2. 3 提取工艺验证试验结果 测定的结果均优于正交实
验表中的任何一组，重现性很好，说明该工艺稳定可行。见表 5。
表 5 最佳提取工艺的验证试验 (n = 3)
Tab. 5 Verification test of the optimum extraction process(n = 3)
提取次数 质量提取率(%) 平均质量提取率(%) ＲSD(%)
1 27. 34
2 27. 32 27. 31 0. 152
3 27. 26
2. 4 定性检测结果 总提物、水洗物、醇洗物初步定性实
验结果见表 6、图 5。
表 6 定性实验结果
Tab. 6 Ｒesults of qualitative detection experiment
检测试剂
对照液
(水或乙醇)
粗提液 醇洗液 水洗液
茚三铜(Ninhydrin)试剂 － + － +
双缩脲(Biuret)反应 － + + +
碘-碘化钾(Wagner)试剂 － + + -
碘化汞钾(Mayer)试剂 － + + －
苦味酸试剂 － + + －
Liebrmann-Burchan反应 － + + －
铅盐反应 － + + －
三氯化铝-乙醇试剂 － + + －
泡沫实验 － + － +
α-萘酚试剂 － + + +
费林(Fehling)试剂 － + － +
多糖实验 － + － +
开环闭环反应 － + － +
氯化钠-明胶试剂 － － － －
三氯化铁试剂 － + + －
+:反应阳性;－反应阴性
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图 5 定性检测结果
1. 对照液;2. 粗提液;3. 醇提液;4. 水洗液
Fig. 5 Ｒesults of qualitative detection experiment
1. control solution;2. crude extracts;3. ethanol extracts;4. water extracts
3 讨论
中药有效成分的提取工艺考察，是通过比较不同的提取工
艺参数，从中选择一种有效成分溶出率高、操作简单、成本消耗
少的提取方法。由于药材之间差别较大，每种植物中所含的成
分不同，故其提取没有一种通用的方法，在遵循浸提原理［8］的基
础上应根据不同药材特点、采用不同的方法。中药在传统应用
中均以水煎常见，在民间流传用毛蒟煮水喝治疗肝脏疾病很有
效，说明其有效成分有可能是水溶性的，因此本实验选用了水
提法。
大孔吸附树脂具有物理化学稳定性高、吸附选择性独特，不
受无机物存在的影响、再生简便、解吸条件温和、使用周期长、节
省费用等诸多优点，广泛用于植物中有效成分的分离纯化［9-10］，
是提取分离中草药有效成分的一种有效方法。该工艺操作简
便，成本较低，树脂可反复使用，越来越受到人们的重视。综合
以上因素，本实验选择了大孔树脂对毛蒟粗提取液进行初步的
分离纯化。
直观分析结果及方差分析结果表明对提取率影响最大的是
提取次数，其次是料液比和提取时间，影响最小的是浸泡时间;
因此，在进行提取时，必须注意各工艺参数的调控。提取工艺验
证实验 3 次提取率均高于正交实验里任何一组，说明优选出来
的工艺参数组合是可行、稳定的。
从总提物、水洗物、醇洗物的初步定性检测结果可知，水洗
物和醇洗物有些成分是交叉的，即水洗物与醇洗物中均含有，本
实验只是初步分离，定性鉴定，后期药效学实验完成后，需对药
理活性强的提取部位进行深入的分离纯化研究。
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(编校:王冬梅)
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中国生化药物杂志 2015 年第 5 期 总第 35 卷 生化药物技术