全 文 ：2008 年 第 11 期 广 东 化 工
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NaNO2-Al(NO3)3显色分光光度法测定
萼翅藤叶总黄酮的含量

王晓军，刘佳佳，李霞，任娜
(中南大学 化学化工学院 医药生物化工研究所，湖南 长沙 410083)

[摘 要]采用 NaNO2-Al(NO3)3 显色分光光度法测定萼翅藤叶提取液中总黄酮含量，并对测定条件进行研究。结果
表明：以芦丁为标样，以 NaNO2-Al(NO3)3 为显色剂，碱性条件下在 508 nm 处测定显色液的吸光度确定总黄酮的含量，
回归方程 A=0.523C-0.0122，相关系数 R=0.9998，方法的回收率为 90.28 %～99.73 %，相对标准偏差(RSD)为 1.57 %；
本方法简便、快速。
[关键词]萼翅藤；总黄酮；NaNO2-Al(NO3)3；分光光度法
[中图分类号]O657.32 [文献标识码]A [文章编号]1007-1865(2008)11-0127-04

NaNO2-Al(NO3)3 Spectrophotometric Determination of Total Flavonoids in
Calycopteris Floribunda Leaves

Wang Xiaojun, Liu Jiajia, Li Xia, Ren Na
(Institute of Biochemical Engineering, Chemistry and Chemical Engineering College, Central South University,
Changsha 410083, China)

Abstract: A method for the NaNO2-Al(NO3)3 spectrophotometric determination of total flavonoids in Calycopteris floribunda leaves
was described. The conditions of determination were studied. Results showed: Rutin as standard sample, NaNO2-Al(NO3)3 was used as a
chromogenic agent, on condition of basic property, total flavonoids was determined by spectrophotometer at 508 nm. Regression equation
was A=0.523C-0.0122, correlation coefficient R=0.9998, The RSD was 1.57 %. The method was simple and rapid.
Keywords: calycopteris floribunda leaves；total flavonoids；NaNO2-Al(NO3)3；spectrophotometry


萼翅藤属于使君子科(Combretaceae)的萼翅藤属常绿蔓生
大藤木，生长于亚洲热带山地，主要分布于缅甸、印度、新加
坡和中国，在我国主要见于云南西部的盈江县那邦坝。萼翅藤
已被列为我国的国家Ⅰ级重点保护野生植物，由于萼翅藤在我
国发现较晚, 有关它的研究也很少[1]。
研究发现萼翅藤含有黄酮类化合物[2]。植物中总黄酮含量
的测定方法主要有紫外分光光度法[3]、铝盐显色可见分光光度
法[4-7]、薄层色谱法[8]、高效液相色谱法[9]和毛细管电泳法[10]
[收稿日期] 2008-06-05
[作者简介] 王晓军(1983-)，男，在读硕士研究生，湖南邵阳人，主要研究方向为天然产物的提取与分离。
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等。薄层色谱法、高效液相色谱法、毛细管电泳法主要用于测
定黄酮单体成分，总黄酮含量的测定主要采用分光光度法。紫
外可见分光光度法操作简便、检测成本低，但它要求物质组成
要单一，而总黄酮提取液成分复杂，虽经分离，仍含有难于分
离的干扰性杂质，影响测定的准确度。在比较、综合前人的研
究基础上，用60 %的乙醇作提取剂，提取萼翅藤中的总黄酮，
以芦丁为对照品，采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH体系显色，双光
束紫外分光光度法分析测定云南盈江产萼翅藤叶中的总黄酮
含量，旨在建立一种快速、经济简便的测定萼翅藤叶中总黄酮
含量的分光光度分析方法，并为这一资源的进一步开发利用提
供理论依据。
1 实验部分
1.1 仪器与试剂
UV 2100型双光束可见分光光度计，北京莱伯泰科仪有限
公司；AR2140型电子分析天平，美国OHAUS(奥豪斯)；pHS-3C
型精密pH计：上海精密科学仪器有限公司雷磁仪器厂生产；
GZX-9140MBE电热恒温鼓风干燥箱，上海博迅实业有限公司
医疗设备厂生产，AS2060B Ultrasonic Cleaner。
芦丁，生化试剂，国药集团化学试剂有限公司产品；体积
分数95 %乙醇，亚硝酸钠，氢氧化钠，硝酸铝，均为国产分
析纯。水为实验室自制新鲜蒸馏水。
所用萼翅藤叶于2007年7月下旬采自云南盈江县。采后冲
洗，叶片在烘箱中于35 ℃烘至手可捏碎，粉碎过筛，收集过
18目筛不过100目筛部分，放置干燥避光处密封保存备用。
1.2 实验方法
1.2.1 芦丁标准溶液的制备
准确称取经100 ℃干燥至恒重的芦丁标准试剂0.0232 g，
用60 %(V/V)乙醇溶解，并定量转入100 mL容量瓶中，用60 %
乙醇定容，摇匀得浓度为0.232 g/L标准溶液。
1.2.2 萼翅藤叶总黄酮的提取及样品溶液的制备
称取2 g萼翅藤叶粉放入250 mL锥形瓶中，水浴加热控制
60 ℃，用60 %的乙醇，在1︰10(第1次)、1︰5(第2、3、4次)
料液比的条件下，浸提4次，每次3 h，过滤，用少许60 %的乙
醇洗涤滤渣，合并滤液和洗液，得萼翅藤叶总黄酮提取液150 mL。
用旋转蒸发器蒸发浓缩，用石油醚洗涤浓缩物，去除掉脂溶性
杂质，再用60 %乙醇溶解浓缩物，并定容至100 mL，作为样
品溶液，避光保存。
1.2.3 显色方法
移取一定量的芦丁标准溶液或萼翅藤黄酮提取液于25 mL
容量瓶中，加入0.7 mL 50 g/L NaNO2溶液(新配)摇匀，放置6 min
后加入0.7 mL 100 g/L Al(NO3)3溶液摇匀，放置6 min后加入约
10 mL 30 %乙醇振摇，再加入5.0 mL 40 g/L氢氧化钠溶液，用
30 %乙醇定容至刻度，混匀，10 min后以空白试剂为参比，选
用1 cm比色皿在508 nm波长处测定其吸光度。
1.2.4 测定波长的选择
移取1.0 mL的芦丁标准溶液或萼翅藤黄酮提取液按1.2.3
节实验方法显色后，在UV2100型双光束紫外可见分光光度计
上用1 cm比色皿在波长从200 nm至600 nm区间扫描(以试剂空
白作参比)，波长间隔选1 nm。芦丁标准溶液，萼翅藤叶总黄
酮提取液显色前、后吸收光谱见图1。

0
2
4
吸
光度
/A


图1 芦丁标准溶液显色前、后的吸收光谱
Fig.1 Absorption spectra of rutin standard solution and total flavonoids in Calycopteris floribunda
leaves extractive solution before and after colouring

根据图1可知：萼翅藤叶总黄酮提取物经铝盐显色后在波长
400～600 nm区间的吸光度大大增加，最大吸收波长为508 nm，
在此位置有明显的蜂形，与芦丁标准溶液显色后的扫描曲线相
似，本方法选用508 nm为测定波长。
1.2.5 芦丁标准曲线的绘制
参照文献[11]方法绘制标准曲线，分别准确吸取芦丁标准
溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，分别置于25 mL容量瓶
中，按1.2.3的方法显色，以试剂空白为参比溶液，在508 nm
提取液显色前
芦丁显色前
提取液显色后
芦丁显色后
4
2
0
吸光
度A

200 400 600
λ/nm
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下测定不同浓度芦丁标准溶液的A值，以吸光度A对芦丁浓度C
绘 制 标 准 曲 线 。 曲 线 方 程 A=0.523C-0.0122 ， 相 关 系 数
R=0.9998；线性范围为：芦丁浓度16.894～100.676 mg/L。
2 结果与讨论
2.1 溶液酸碱度—40 g/L NaOH溶液加入量的选择
取3.0 mL的标准溶液按实验方法，分别加入2.0、4.0、5.0、
6.0、8.0 mL 40 g/L NaOH溶液，测定A值。结果表明40 g/L
NaOH用量在4.0～8.0 mL之间时A值变化幅度小于1 %。本试验
选择加40 g/L NaOH 溶液5.0 mL。
2.2 显色剂硝酸铝用量的选择
取3.0 mL的标准溶液按实验方法，分别加入0.3～1.1 mL(间
隔为0.2 mL)100 g/L Al(NO3)3溶液，测定A值，结果表明100 g/L
Al(NO3)3溶液用量在0.7～1.1 mL之间时A值变化幅度小于0.3 %。
本试验选择加100 g/L硝酸铝溶液0.7 mL。
2.3 显色剂硝酸铝作用时间的选择
取3.0 mL的标准溶液按实验方法，分别加入0.7 mL 100 g/L
硝酸铝溶液后摇匀，放置2～10 min，测定A值，结果表明0.7 mL
100 g/L Al(NO3)3溶液作用时间在2～10 min范围内A值变化
幅度大于1 %，在6～10 min范围内A值变化幅度小于0.5 %。
本试验选择硝酸铝作用时间6 min。
2.4 标准溶液、萼翅藤叶黄酮提取液显色液稳定性
取3.0 mL标准溶液、0.5 mL萼翅藤叶总黄酮提取液按实验
方法，每隔2 min测定一次A值，标准溶液显色液A在10～20 min
内基本保持不变，萼翅藤黄酮提取液显色液在15 min内稳定，
20 min后吸光度开始下降。本实验选择加入NaOH溶液10 min
后测定A值。
2.5 萼翅藤叶黄酮提取物中总黄酮含量的测定、精密
度实验结果
黄酮类化合物在植物体内主要与糖结合成甙，本实验以芦
丁配制标准液作标准曲线，以芦丁为标样计算黄酮类化合物的
总量。取萼翅藤叶总黄酮提取液2 mL按实验方法显色，摇匀
放置5 min，超声振荡2 min，控制加入5 mL1mol/L氢氧化钠溶
液，10 min后用1 cm比色皿508 nm波长处测定其吸光度，参比
为空白溶液。利用回归方程并按以下公式计算出样品溶液中总
黄酮的浓度，并计算RSD。提取液总黄酮浓度=样品溶液黄酮
的浓度×测定时浸提液的稀释倍数。萼翅藤叶总黄酮含量=提
取液总黄酮浓度×浸提液总体积/萼翅藤叶质量。计算得萼翅
藤叶黄酮提取液中黄酮浓度的测定结果见表1。

表1 重现性试验结果
Tab.1 Determination resutls of precisions experiment
试样
测定值
(n=5)/ (mg·mL-1)
平均值
/( mg·mL-1)
标准偏差 RSD/%
芦丁标准液 0.656～0.660 0.657 0.0017 0.255
样品标准液 2.85～2.97 2.91 0.048 1.57

从表 1 可知，本方法测定萼翅藤叶总黄酮含量相对标准偏
差 RSD=1.57 %，达到一般分光光度法的要求精密度高。由萼
翅藤叶提取物总黄酮含量计算得实验条件下萼翅藤叶黄酮量
为 108.245 mg/g。
2.6 加标回收实验
取浸提液1 mL 5份于5只25 mL容量瓶中，分别加入0.232 g/L
芦丁标准溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，分别按实验方法显
色，放置5 min，超声振荡2 min，控制加入5.0 mL 1 mol/L氢氧
化钠溶液10 min后，用1 cm比色皿在508 nm波长处测定其吸光
度，参比为空白试剂。计算总黄酮含量和回收率，结果见表2。

表2 加标回收实验结果
Tab.2 Deter mination results of recovery
待测液测得/(mg·mL-1) 加标量/(mg·mL-1) 吸光度A 加标后测得量/(mg·mL-1) 回收率/% 平均回收率/%
0.144102 0.116 0.118 0.249 90.28
0.144102 0.232 0.177 0.361 93.54
0.144102 0.348 0.242 0.484 97.81
0.144102 0.464 0.285 0.568 91.32
0.144102 0.58 0.362 0.716 98.52
0.072051 0.232 0.145 0.301 98.72
0.072051 0.348 0.207 0.419 99.73
0.072051 0.464 0.255 0.510 94.33
0.072051 0.58 0.312 0.619 94.33
0.072051 0.696 0.356 0.704 90.80
94.94

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从表2可知，显色液中总黄酮含量在线性范围内，加标回
收率在90.28 %～99.73 %之间，平均加标回收率为94.94 %，方
法的准确度良好。
3 结论
用乙醇作提取剂时，会将脂溶性色素及其他一些组分一起
提取出来，这将干扰比色测定，用石油醚洗涤提取浓缩物去除
掉脂溶性物质，可以剔除其干扰，本文建立了萼翅藤叶总黄酮
含量NaNO2-Al(NO3)3-NaOH显色可见光分光光度法的测定方
法，实验结果表明：用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH显色体系，测定
波长508 nm，在标准曲线上查找或计算总黄酮含量，显色10 min
后测定显色液吸光度，加标回收率在90.28 %～99.73 %之间，
平均加标回收率达94.94 % (n=10)，测定结果真实可靠，准确，
重现性好，精密度高(RSD=1.57 %，n=5)，操作简单方便，快
速。其准确性，重现性，线性关系，回收率均能满足科研和
生产的要求，可用于萼翅藤叶提取物中总黄酮含量的测定。

参考文献
[1]杨志云，龚洵，张启泰．萼翅藤的核型研究[J]．云南植物研究，2002，
24(2)：250-252．
[2]Mayer R．Five biflavonoids from Calycopteris floribunda (Combretaceae)[J]．
Phytochemistry， 2004，65：593-601．
[3]蒋俊毅，曹凯，吴德康，等．紫外分光光度法测定杏香兔耳风制剂中总
黄酮含量[J]．时珍国医国药，2005，16(3)：178-179．
[4]邓桂春，王鑫，赵丽艳，等．分光光度法测定银杏叶中黄酮的含量[J]．辽
宁大学学报：自然科学版，2005，32(2)：101-104．
[5]庄向平，虞杏英，杨更生，等．银杏叶中黄酮含量的测定和提取方法[J]．中
草药，1992，23(8)：122-124．
[6]许钢，张虹，胡剑．竹叶中黄酮提取方法的研究[J]．分析化学，2000，
28(7)：857-859．
[7]林春蕊．野菊花总黄酮含量的测定[J]．广西植物，2002，22(5)：467-468．
[8]李俊，余丽娟，苏小建，等．薄层扫描测定银杏叶黄酮的研究[J]．广西
师范大学学报：自然科学版，1995，13(4)：54-57．
[9]邹耀洪，李桂荣．反相高效液相色谱分析杨梅叶中抗氧化成分黄酮类化
合物[J]．分析化学，1998，26(5)：531-534．
[10]陈刚，章慧琴，吴性良，等．毛细管电泳电化学检测葛根和葛藤中几
种黄酮类化合物[J]．复旦学报：自然科学版，2004，43(4)：672-675．
[11]杨铭，吴志谊，吴川，等．可见光及紫外光分光光度法测定菊花总黄
酮含量的研究[J]．广东化工，2007，34(9)：112-113．

(本文文献格式：王晓军，刘佳佳，李霞，等．NaNO2-Al(NO3)3
显色分光光度法测定萼翅藤叶总黄酮的含量[J]．广东化工，
2008，35(11)：127-130)