全 文 ：书收稿日期：２０１５－０８－２５
基金项目：浙江省科技计划项目（２０１３Ｃ３２１０２）；丽水市科技计划项目（２０１２０３１０）
作者简介：洪震（１９６９－），男，高级工程师，主要从事观赏植物开发利用研究，Ｅ－ｍａｉｌ：４５２４５１６５１＠ｑｑ．ｃｏｍ。
ＤＯＩ．：１０．１３２６８／ｊ．ｃｎｋｉ．ｆｂｓｉｃ．２０１５．０６．００１
中华野海棠遗传多样性分析
洪震１，傅冰２，傅金尧２，陈盛专３，季国华４
（１．丽水市林业科学研究院，浙江 丽水 ３２３０００；２．丽水职业技术学院，浙江 丽水 ３２３０００；
３．浙江省平阳林场，浙江 平阳 ３２５４０６；４．遂昌九龙山自然保护区，浙江 遂昌 ３２３３１２）
摘 要：利用ＳＲＡＰ－ＰＣＲ方法研究了８个不同种源中华野海棠的遗传多样性。结果表明：８个中华野海棠种质资
源被划分为２大类群，其中遂昌、景宁、庆元、泰顺、武夷山种源聚成１个类群；平阳、松阳、云和种源聚成另外个类
群；遗传相似性系数界于０．４２３０～０．９６１５，平均相似性系数为０．７１。
关键词：ＳＲＡＰ－ＰＣＲ；中华野海棠；遗传多样性
中图分类号：Ｓ６６１．４ 文献标识码：Ｂ
Ａｎａｌｙｓｉｓ ｔｈｅ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｂｒｅｄｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ
Ｈｏｎｇ Ｚｈｅｎ１，Ｆｕ Ｂｉｎｇ２，Ｆｕ Ｊｉｎｙａｏ２，Ｃｈｅｎ Ｓｈｅｎｇｚｈｕａｎ３，Ｊｉ Ｇｕｏｈｕａ４
（１．Ｌｉｓｈｕｉ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ，Ｌｉｓｈｕｉ，Ｚｈｅｊｉａｎｇ ３２３０００；２．Ｌｉｓｈｕｉ ｖｏｃａｔｉｏｎａｌ ＆ｔｅｃｈｎｉｃａｌ ｃｏｌｅｇｅ，Ｌｉｓｈｕｉ，Ｚｈｅｊｉａｎｇ，３２３０００；
３．Ｐｉｎｇｙａｎｇ Ｆｏｒｅｓｔ Ｆａｒｍ ｏｆ Ｚｈｅｊｉａｎｇ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ，Ｐｉｎｇｙａｎｇ，Ｚｈｅｊｉａｎｇ ３２５４０６；４．Ｊｉｕｌｏｎｇｓｈａｎ Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｓｅｒｖｅ ｏｆ Ｓｕｉｃｈａｎｇ，Ｓｕｉｃｈａｎｇ，
Ｚｈｅｊｉａｎｇ ３２３３１２）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＳＲＡＰ－ＰＣＲ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ８ Ｂｒｅｄｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ ｐｒｏｖｅｎａｎｃｅｓ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ
ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ：ｔｈｅ ８ Ｂｒｅｄｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ ｐｒｏｖｅｎａｎｃｅｓ ｗｅｒｅ ｄｉｖｉｄｅｄ ｉｎｔｏ ｔｗｏ ｇｒｏｕｐｓ，ｗｈｉｃｈ ｐｒｏｖｅｎａｎｃｅｓ ｏｆ Ｓｕｉｃｈａｎｇ
Ｃｏｕｎｔｙ，Ｊｉｎｇｎｉｎｇ Ｃｏｕｎｔｙ，Ｑｉｎｇｙｕａｎ Ｃｏｕｎｔｙ，Ｔａｉｓｈｕｎ Ｃｏｕｎｔｙ，Ｗｕｙｉｓｈａｎ Ｃｉｔｙ ｔｏｇｅｔｈｅｒ ｉｎｔｏ ｏｎｅ ｇｒｏｕｐ；ａｎｄ ｔｈｅ ｏｔｈ－
ｅｒ ｇｒｏｕｐ ｉｎｃｌｕｄｅ ｐｒｏｖｅｎａｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｉｎｇｙａｎｇ Ｃｏｕｎｔｙ，Ｓｏｎｇｙａｎｇ Ｃｏｕｎｔｙ，Ｙｕｎｈｅ Ｃｏｕｎｔｙ．Ｔｈｅ ＧＳ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔｓ ａｍｏｎｇ ｔｈｅ
８ Ｂｒｅｄｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ ｐｒｏｖｅｎａｎｃｅｓ ｗｅｒｅ ｒａｎｇｅｄ ｆｒｏｍ ０．４２３０ｔｏ ０．９６１５ｗｉｔｈ ａｎ ａｖｅｒａｇｅ ｏｆ ０．７１．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ＳＲＡＰ－ＰＣＲ；Ｂｒｅｄｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ；Ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ
中华野海棠（Ｂｒｅｄｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ），为野牡丹科野
海棠属常绿灌木，花瓣粉红色至紫红色，优美艳丽，
叶形美观，叶色翠绿有光泽，叶与花均有很高的观赏
价值［１］。同时，该种具有较高的药用价值，全株供药
用，在浙江民间常用其治小儿腹泻、感冒、头痛以及
疟疾等病症［２］。中华野海棠主要分布于两广、江西、
浙江、福建等省，浙江省则分布于丽水、温州等浙南
山区，通常在海拔４００～１４００ｍ的山谷、山坡、林下
等地有生长。
目前，对于中华野海棠的研究较少，主要集中在
移栽培养［３］、抗逆性研究、化学成分分析［４］、生物学
特性［５］研究等方面，而对于遗传育种、分类鉴定等方
面，现有报道均未涉及。利用ＳＲＡＰ技术分析不同
种源的中华野海棠的遗传多样性，可为分类鉴定以
及良种选育等工作提供一定的理论依据。
１ 材料与方法
１．１ 材料
表１ 供试材料
编号 名称 采集地
１ 松阳种源 松阳县箬寮原始林景区
２ 景宁种源 景宁县望东洋高山湿地
３ 庆元种源 庆元县百山祖自然保护区
４ 云和种源 云和县安溪乡东岱村
５ 遂昌种源 遂昌九龙山国家级自然保护区
６ 平阳种源 平阳县满田山森林公园
７ 泰顺种源 泰顺乌岩岭国家级自然保护区
８ 武夷山种源 武夷山自然保护区
１
第６期（总第１３９期） 中 国 林 副 特 产 Ｎｏ．６（Ｔｏｔａｌ Ｎｏ．１３９）
２０１５年１２月 Ｆｏｒｅｓｔ Ｂｙ－Ｐｒｏｄｕｃｔ ａｎｄ Ｓｐｅｃｉａｌｉｔｙ ｉｎ Ｃｈｉｎａ Ｄｅｃ．２０１５
１．１．１ 中华野海棠种植资源。供试８种中华野海
棠种质资源（表１）采集于浙江及福建各地。采集鲜
嫩叶片后，－７０℃超低温冰箱保存。
１．１．２ ＳＲＡＰ引物及筛选。共选择了６个正向引
物，８个反向引物用于实验筛选，具体如表２，引物由
北京全式金生物技术有限公司按照相关序列合成。
表２ 引物序列
正向引物
编号 序列 编号 序列
Ｍｅ１ ＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＣＣＧＧＡＴＡ Ｍｅ２ ＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＣＣＧＧＡＧＣ
Ｍｅ３ ＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＣＣＧＧＡＡＴ Ｍｅ４ ＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＣＣＧＧＡＣＣ
Ｍｅ５ ＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＣＣＧＧＡＡＧ Ｍｅ６ ＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＣＣＧＧＴＡＡ
反向引物
编号 序列 编号 序列
Ｅｍ９ ＧＡＣＴＧＣＧＡＣＧＡＡＴＴＡＣＧ Ｅｍ１０ ＧＡＣＴＧＣＧＡＣＧＡＡＴＴＴＡＧ
Ｅｍ１１ ＧＡＣＴＧＣＧＡＣＧＡＡＴＴＴＣＧ Ｅｍ１２ ＧＡＣＴＧＣＧＡＣＧＡＡＴＴＧＴＣ
Ｅｍ１３ ＧＡＣＴＧＣＧＡＣＧＡＡＴＴＧＧＴ Ｅｍ１４ ＧＡＣＴＧＣＧＡＣＧＡＡＴＴＣＡＧ
Ｅｍ１５ ＧＡＣＴＧＣＧＡＣＧＡＡＴＴＣＴＧ Ｅｍ１６ ＧＡＣＴＧＣＧＡＣＧＡＡＴＴＣＧＧ
１．２ 方法
１．２．１ 基因组 ＤＮＡ 的提取。用全氏金公司
ＰｌａｎＺｏｌ植物基因组提取试剂盒抽提中华野海棠叶
片组织的基因组ＤＮＡ。利用琼脂糖凝胶电泳检测
所提取基因组ＤＮＡ的完整性，并用Ｌａｍｂｄａ ６５０紫
外分光光度计（ＰＥ，美国）测定浓度及质量。
１．２．２ ＳＲＡＰ－ＰＣＲ反应体系及程序。参考前期对
蓝莓ＳＲＡＰ－ＰＣＲ反应体系及参数的研究［６］，初步确
定反应体系及反应程序。初步确定反应体系为：
ｄＮＴＰｓ １００μｍｏｌ／Ｌ、Ｔａｑ 酶 ０．８Ｕ、ＭｇＣｌ２ ２．５
ｍｍｏｌ／Ｌ、ＤＮＡ ４０ｎｇ、正、反向引物各０．２μｍｏｌ／
Ｌ、１×Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（总体积２０μＬ）。ＰＣＲ反应
程序为：９５℃预变性５ｍｉｎ；９５℃变性４５ｓ，３５℃
退火６０ｓ，７２℃延伸６０ｓ，５个循环；９５℃变性４５ｓ，
５０℃退火６０ｓ，７２℃延伸９０ｓ，３０个循环；７２℃延
伸１０ｍｉｎ；４℃保存。
１．２．３ ＳＡＲＰ引物筛选。以松阳种源中华野海棠
基因组ＤＮＡ为模板，随机组合正、反向引物，进行
引物筛选。
１．２．４ 电泳及染色。将筛选得到的引物分别以所
有供试中华野海棠基因组 ＤＮＡ为模板进行ＰＣＲ
反应，并进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，用Ｄｏｌ－
ｐｈｉｎ－ＤＯＣ Ｐｌｕｓ凝胶成像系统（Ｗｅａｌｔｅｃ，美国）分
析、记录数据。ＤＮＡ标准分子量为 ＭａｒｋｅｒＩＩＩ（北京
全式金生物技术有限公司）。
１．２．５ 数据处理和统计方法。用 Ｄｏｌｐｈｉｎ－ＤＯＣ
Ｐｌｕｓ凝胶成像系统自带软件结合人工方法读带，并
记录扩增结果，其中有带记为１，无带记为０，并导入
Ｅｘｃｅｌ表格。用 ＮＴＳＹＳ－ｐｃ２．１０ｅ分析软件分析所
得Ｅｘｃｅｌ表格，计算遗传相似性系数，同时用 ＵＰＧ－
ＭＡ对不同种源进行聚类分析，绘制聚类图。
２ 结果与分析
２．１ 引物筛选及多态性分析
以松阳种源中华野海棠基因组ＤＮＡ为模板，
验证ＰＣＲ反应体系及反应程序，同时筛选合适的
ＳＲＡＰ引物组合。共随机组合了２０对引物组合，电
泳结果如图１所示，从中筛选出４对能够扩增出清
晰的条带，并且多态性好、稳定性高的引物组合，分
别为：ＭＥ４－ＥＭ１７、ＭＥ４－ＥＭ１８、ＭＥ５－ＥＭ１３、ＭＥ６－
ＥＭ１０。筛选结果同样证明该ＰＣＲ体系是适用的。
４对组合ＰＣＲ后经３．５％丙烯酰胺凝胶电泳，共扩
增出９９条条带，其中多态性条带为６０条，多态性比
率为６０．６１％（表３）。
表３ ９个引物组合的扩增结果
引物组合 扩增带数／条 多态性条带／条 多态性比率／％
ＭＥ４－ＥＭ７ ２３ １５ ６５．２２
ＭＥ４－ＥＭ１８ ２６ １７ ６５．３８
ＭＥ５－ＥＭ１３ ２５ １３ ５２．００
ＭＥ６－ＥＭ１０ ２５ １５ ６０．００
平均 Ａｖｅｒａｇｅ ２４．７５ １５ ６０．６１
图１ 引物筛选电泳图
２
２０１５年 中 国 林 副 特 产 第６期
２．２ 种质资源相似性系数分析
根据４对组合 ＰＣＲ电泳结果（图２为 ＭＥ６－
ＥＭ１０引物组合电泳结果），利用 ＮＴＳＹＳ－ｐｃ２．１０ｅ
分析软件计算样品间的Ｊａｃｃａｒｄ遗传相似性系数，
结果见表４。８个中华野海棠种质资源的遗传相似
性系数分布于０．４２３０～０．９６１５之间，平均相似性系
数为０．７１。其中，最高相似性系数出现在遂昌和景
宁种源之间，为０．９６１５；最低相似性系数出现在福
建和云和种源之间，为０．４２３０。
表４ ８个中华野海棠种质资源的Ｊａｃｃａｒｄ相似性系数矩阵
品种名称 遂昌种源 庆元种源 平阳种源 武夷山种源 泰顺种源 景宁种源 松阳种源 云和种源
遂昌种源 １．００００
庆元种源 ０．９２３０ １．００００
平阳种源 ０．６５３８ ０．７３０８ １．００００
武夷山种源 ０．８０７７ ０．７３０８ ０．４６１５ １．００００
泰顺种源 ０．８８４６ ０．８０７７ ０．５３８５ ０．６９２３ １．００００
景宁种源 ０．９６１５ ０．８８４６ ０．６１５４ ０．７６９２ ０．９２３１ １．００００
松阳种源 ０．６９２３ ０．６１５４ ０．８８４６ ０．５０００ ０．６５３８ ０．６５３８ １．００００
云和种源 ０．６１５４ ０．５３８５ ０．８０７７ ０．４２３０ ０．６５３８ ０．５７６９ ０．９２３０ １．００００
图２ ＭＥ６－ＥＭ１０ ３．５％丙烯酰胺凝胶电泳图
２．３ 种质资源的聚类分析
图３ ８个中华野海棠种质的ＵＰＧＭＡ聚类图
基于Ｊａｃｃａｒｄ遗传相似系数的ＵＰＧＭＡ聚类图
（图３）显示，８个中华野海棠种质资源被划分为两大
类群：其中遂昌、景宁、庆元、泰顺、福建种源聚成一个
类群（Ｉ）；平阳、松阳、云和种源聚成另一个类群（ＩＩ）。
类群Ｉ又可以细分成２个小的类群，其中，福建种源
自成一类类群，其它４个种源为一个类群。类群ＩＩ
同样也可细分成２个小的类群，分别为松阳、云和种
源为一个类群；平阳种源为另一个类群。
３ 讨论
通过对试验结果的分析，８种供试种质资源遗
传相关性并不是很高，说明中华野海棠具有较丰富
的遗传多样性。虽然除了福建武夷山种源的中华野
海棠外，其它７个种质资源均采集自浙江省丽水市
及温州市，但是这７个种质资源之间并没有因为分
布较近而表现出高的亲缘关系，这可能跟种质资源
的人工移栽、自然迁移［７］等因素有关。
参 考 文 献
［１］洪震，李根有，马丹丹，等．野生花卉中华野海棠的抗逆性
研究［Ｊ］．北方园艺，２０１２（５）：６２－６６．
［２］屠娟丽，周紫球，吴小华．３野生灌木中华野海棠的发芽
试验［Ｊ］．浙江林业科技，２００３（２）：２４－２６．
［３］张作焕，李林，陶正明．中华野海棠野生苗移栽技术初探
［Ｊ］．浙江林业科技，２００３（１）：５４－５５．
［４］沈双玲．中华野海棠化学成分及药效学分析［Ｄ］．福州：
福建农林大学，２０１３．
［５］马丹丹，金清．３种野海棠属野生花卉的光合特性研究
［Ｊ］．河南林业科技，２０１１（３）：１－３．
［６］傅冰，洪震，刘跃钧，等．蓝莓ＳＲＡＰ－ＰＣＲ反应体系的建
立和优化及其遗传多样性分析［Ｊ］．北方园艺，２０１３（１７）：
９５－９９．
［７］钟永德，李迈和．Ｎｏｒｂｅｒｔ Ｋｒａｅｕｃｈｉ，地球暖化促进植物迁
移与入侵［Ｊ］．地理研究，２００４（３）：３４７－３５３．
３
２０１５年 洪震等：中华野海棠遗传多样性分析 第６期