全 文 ：第 49 卷 第 1 期 河 南 农 业 大 学 学 报 Vol． 49 No． 1
2015 年 2 月 Journal of Henan Agricultural University Feb． 2015
收稿日期:2014 － 06 － 10
基金项目:林业公益性行业科研项目(201404312) ;浙江省重大科技项目(2012C12908 － 14) ;浙江省重大科技项目(2012C12909 － 21)
作者简介:李芳芳(1987 －) ，女，河南尉氏县人，硕士研究生，从事观赏园艺植物研究。
通信作者:李永华(1976 －) ，男，河南周口人，副教授，博士。
文章编号:1000 － 2340(2015)01 － 0046 － 06
枫香树 DNA提取及 SＲAP-PCＲ反应
体系的建立与优化
李芳芳1，2，杨少宗2，柳新红2，李海波2，王丽玲2，李永华1
(1．河南农业大学，河南 郑州 450002;2．浙江省林业科学研究院，浙江 杭州 310023)
摘要:通过不同处理的枫香树叶片及基因组 DNA 提取方法的对比，并采用 L16(4
5)正交试验设计，对影响
SＲAP-PCＲ反应体系的 Mg2 +，dNTPs，引物浓度及 Taq DNA 聚合酶和模板 DNA 用量等 5 个因素进行优化，确
立枫香树 SＲAP-PCＲ最佳反应体系。结果表明，改良 CTAB法提取枫香树基因组 DNA的产率和纯度均可满足
下游试验需要。SＲAP-PCＲ最优反应体系为:总体积 20 μL，含 1 × PCＲ Buffer，1． 5 mmol·L －1 Mg2 +，0． 16
mmol·L －1 dNTPs，0． 5 μmol·L －1引物，0． 9 U Taq DNA聚合酶和 40 ng模板 DNA。各因素对反应结果的影响
大小顺序为 Taq DNA聚合酶量 ＞ dNTPs 浓度 ＞ Mg2 +浓度 ＞模板 DNA 用量 ＞引物浓度。运用优化的 SＲAP-
PCＲ反应体系对 10 个不同居群的枫香树基因组 DNA扩增检测，结果均能获得稳定性高、多态性丰富和重复
性好的条带图谱。
关键词:枫香树;DNA提取;SＲAP-PCＲ;正交试验设计;反应体系优化
中图分类号:S 722． 3 文献标志码:A
Genomic DNA extraction and establishment of the optimal SＲAP-PCＲ
reaction system for Liquidambar formosana Hance．
LI Fangfang1，2，YANG Shaozong2，LIU Xinhong2，LI haibo2，WANG liling2，LI Yonghua1
(1． Henan Agricultural University，Zhengzhou 450002，China;
2． Zhejiang Forestry Academy，Hangzhou 310023，China)
Abstract:In order to investigate the L． formosana genomic DNA extraction methods and the optimal
SＲAP-PCＲ reaction system，two kinds of genomic DNA extraction methods for different materials were
contrasted． By the orthogonal experiment design Ll6(4
5) ，five factors including Mg2 + concentration，
dNTPs concentration，primer concentration，Taq DNA polymerase and template DNA amount in SＲAP-
PCＲ reaction system were optimized，and the optimal SＲAP-PCＲ reaction system suitable for genomic
DNA extracted from L． formosana was also established． The results showed that the modified CTAB
method was better than the isolation kit one，and the optimized SＲAP-PCＲ reaction system was as fol-
lows:total volume 20 μL，containing 1 × PCＲ Buffer，1． 5 mmol·L －1 Mg2 +，0． 16 mmol·L －1
dNTPs，0． 9 U Taq DNA polymerase，0． 5 μmol·L －1 primer，40 ng template DNA． The effects of the
five factors on SＲAP-PCＲ amplification are different，in which，Taq DNA polymerase was the greatest，
but that of template DNA amount was the least． The optimal SＲAP-PCＲ reaction system is tested by
means of ten random selected genomic DNA of L． formosana．，and the amplification pattern with rich
polymorphism and clear band was obtained．
DOI:10.16445/j.cnki.1000-2340.2015.01.009
第 1 期 李芳芳，等:枫香树 DNA提取及 SＲAP-PCＲ反应体系的建立与优化 47
Key words:Liquidambar formosana Hance;genomic DNA extraction;SＲAP-PCＲ;orthogonal experi-
ment design;optimization and test of reaction system
枫香树(Liquidambar formosana Hance．)系金
缕梅科(Hamamelidaceae)枫香树属落叶乔木，分布
于秦岭淮河以南地区，跨北热带和南、中、北亚热带
等 4 个气候带，是中国重要的乡土阔叶速生树种，
集观赏、药用和材用等多种价值于一身。多年来，
对枫香树的研究主要集中在无性繁殖技术［1 － 3］、人
工林和混交林技术［4 － 6］、叶片的叶色分析［7］、种子
生物学特性［8，9］、枫香树林的生理生化研究及园林
应用［10］等方面，而对其分子水平的遗传多样性研
究较少，目前，仅见枫香树群体细胞学水平的同工
酶［11］和特定群体的 ISSＲ 分析［12，13］等。相关序列
扩增多态性(Sequence Ｒelated Amplified Polymor-
phism，SＲAP)标记是 2001 年发展的一种新型分子
标记技术［14］，具有简便、快捷、共显性高、重复性
好、易于分离条带及测序等优点，已成功用于多种
植物，如棉花［15，16］、桃和油桃［17］、西葫芦［18］、草坪
草［19 － 21］、菊花［22］、一串红［23］、黄瓜［24］及槭属［25］和
安息香属［26，27］等，均显示其可作为遗传多样性评
价、品种鉴定、遗传图谱构建和研究系统发生的有
效工具［28］。该标记在金缕梅科的研究则未见报
道。SＲAP标记作为一种有效的分子标记技术，其
重要前提条件是研究物种的基因组 DNA高质量提
取方法及其反应体系的优化和确立。本研究在传
统小量法提取植物基因组 DNA的 CTAB 方法基础
上加以改良和优化，建立适合枫香树基因组 DNA
的提取方法:运用正交试验设计，对影响枫香树
SＲAP-PCＲ体系的 Taq DNA 聚合酶，Mg2 +，dNTPs，
引物和模板 DNA 用量等 5 种因素进行优化试验，
获得适合枫香树 SＲAP-PCＲ反应的最优体系，并对
此优化体系进行检测验证，以期为枫香树不同居群
的遗传多样性分析、种质鉴定、遗传连锁图谱构建
和分子育种等领域研究提供参考。
1 材料与方法
1． 1 材料
1． 1． 1 试验材料 分别于 2013 年 9 月和 2014 年
3 月采集不同居群枫香树生长健壮、无病虫害的幼
叶和老叶，置于保鲜袋中，于超低温冰箱中保存
备用。
1． 1． 2 试剂设备 为 Taq DNA 聚合酶，Mg2 +，
dNTPs和 10 × Buffer等，均购自 TaKaＲa 公司，其他
试剂均为分析纯;引物合成由上海生物工程有限公
司完成;主要仪器有 Nano Drop 2000C 微量核酸蛋
白测定仪、ABI Veriti 96 孔多重控温梯度 PCＲ 仪、
BIO － ＲAD水平电泳系统及 Syngene G:BOX 凝胶
成像系统等。
1． 2 方法
1． 2． 1 枫香树基因组 DNA 的提取与检测 采用
十六烷基三甲基溴化胺(CTAB)和试剂盒等方
法［29 － 31］，并改进试剂质量浓度和处理方法，用
ddH2O溶解稀释至 20 ng·μL
－1，25 ℃保存备用。
纯化后分别用 1． 5%的琼脂糖凝胶电泳和微量核
酸蛋白测定仪对 DNA 进行定性和定量检测(表
1)。
表 1 不同提取方法的枫香树基因组 DNA纯度和含量的测定结果
Table 1 Determination of purity and content of genomic DNA of Liquidambar formosana by different methods
提取方法
Extraction method
测量值
Test value
嫩叶 Tender leaves
A B
老叶 Old leaves
A B
改良 CTAB法
Modified CTAB method
DNA含量 /(ng·μL －1) 852． 2 482． 7 209． 0 228． 4
OD260 /OD 280 1． 84 1． 87 1． 92 1． 82
OD260 /OD 230 2． 04 2． 10 1． 76 1． 68
试剂盒法
Isolation kit method
DNA含量 /(ng·μL －1) 817． 2 440． 5 185． 2 179． 0
OD260 /OD 280 2． 04 2． 08 1． 64 1． 45
OD260 /OD 230 2． 13 2． 31 1． 43 1． 27
注:A．新鲜叶片;B．硅胶干燥处理叶片。
Note:A． Fresh leaves;B． Dried leaves saved in silica．
1． 2． 2 SＲAP-PCＲ 反应体系的正交试验优化与
检测根据盖钧镒等［32］的方法对 Taq DNA 聚合酶，
Mg2 +浓度，dNTPs浓度，SＲAP 引物质量浓度，模板
DNA用量等 5 因素在 4 个水平上设计 L16(4
5)正
交试验方案(表 2)。
48 河 南 农 业 大 学 学 报 第 49 卷
表 2 枫香树 SＲAP-PCＲ反应因素水平 L16(4
5)正交设计
Table 2 Orthogonal design for SＲAP-PCＲ optimization on Liquidambar formosana
编号
Serial namber
Taq DNA聚合酶 /U
Taq DNA Polymerase
Mg2 +
/(mmol·L －1)
dNTP
/(mmol·L －1)
引物 /(μmol·L －1)
Primer
DNA模板 /ng
DNA template
1 0． 5 1 0． 1 0． 3 40
2 0． 5 1． 5 0． 12 0． 4 60
3 0． 5 2 0． 14 0． 5 80
4 0． 5 2． 5 0． 16 0． 6 100
5 0． 7 1 0． 12 0． 5 100
6 0． 7 1． 5 0． 1 0． 6 80
7 0． 7 2 0． 16 0． 3 60
8 0． 7 2． 5 0． 14 0． 4 40
9 0． 9 1 0． 14 0． 6 60
10 0． 9 1． 5 0． 16 0． 5 40
11 0． 9 2 0． 1 0． 4 100
12 0． 9 2． 5 0． 12 0． 3 80
13 1． 1 1 0． 16 0． 4 80
14 1． 1 1． 5 0． 14 0． 3 100
15 1． 1 2 0． 12 0． 6 40
16 1． 1 2． 5 0． 1 0． 5 60
K1 5． 00 7． 75 4． 75 5． 75 7． 75
K2 8． 00 8． 75 7． 75 7． 50 6． 00
K3 9． 75 6． 00 8． 50 7． 50 8． 00
K4 4． 25 8． 50 9． 25 6． 25 6． 25
Ｒ 5． 50 2． 75 4． 50 1． 75 2． 00
其中，Taq DNA 聚合酶用量分别为 0． 5、0． 7、
0． 9、1． 1 U;dNTPs 浓度分别为 0． 1、0． 12、0． 14、
0． 16 mmol·L －1;Mg2 +浓度分别为 1、1． 5、2、2． 5
mmol·L －1;SＲAP 引物浓度分别为0． 3、0． 4、0． 5、
0． 6 μmol·L －1;模板 DNA 含量分别为 40、60、80、
100 ng，反应总体积为 20 μL。筛选 SＲAP 引物
Me3 － Em11 组合进行试验验证，3 次重复。SＲAP-
PCＲ扩增程序为:95 ℃预变性 5 min，94 ℃变性 30
sec，35 ℃退火 1 min，72 ℃延伸 2 min，5 次循环;
94 ℃变性 30 s，50 ℃ 变性 30 s，72 ℃ 延伸 1 min，
30 次循环;72 ℃延伸 10 min，4 ℃保存。扩增产物
于 1． 5%的琼脂糖凝胶(含 0． 05%溴化乙锭)电泳
检测，凝胶成像分析结果并拍照。
1． 2． 3 SＲAP-PCＲ反应体系的稳定性检测 随机
选择不同居群枫香树 10 个单株的基因组 DNA 为
模板，筛选 SＲAP 引物组合(Me3 － Em11，Me8 －
Em8) ，按照上述最优 SＲAP-PCＲ 反应体系扩增检
测，对优化确立的枫香树 SＲAP-PCＲ反应体系的稳
定性进行检验。
1． 2． 4 数据统计处理 采用正交直观分析法和新
复极差法对所得数据进行处理分析［32，33］。
2 结果与分析
2． 1 2 种方法提取枫香树基因组 DNA 的纯度和
产率
不同提取方法、叶片发育时期和处理保存方式
所提取的 DNA质量和产率不同(表 2)。由表 2 可
知，对不同处理的嫩叶，试剂盒法所得 DNA 的
OD260 /OD280 为 2． 04 和 2． 08，改良 CTAB法为 1． 84
和 1． 87，2 者 OD260 /OD230 都接近于 2，电泳条带明
亮清晰，无明显弥散拖尾现象(图 1)。
1，4，5，6:硅胶干燥处理和新鲜老叶(试剂盒法和改良
CTAB法) ;2，3，7，8:硅胶干燥处理和新鲜嫩叶(试剂盒法
和改良 CTAB法)。
1，4，5，6:Dried old leaves saved in silica and fresh old leaves
(Isolation kit method and modified CTAB method) ;2，3，7，8:
Dried tender leaves saved in silica and fresh tender leaves (I-
solation kit method and modified CTAB method)．
图 1 不同提取方法的枫香树基因组 DNA电泳检测图
Fig． 1 Electrophoresis map of Liquidambar formosana
genomic DNA extracted by different methods
2 种方法提取的枫香树嫩叶 DNA 在含量和纯
度上相差不大，均能满足后续 PCＲ 扩增要求。而
对于老叶，改良 CTAB 法所得 DNA 的 OD260 /OD280
为1． 92和 1． 82，试剂盒法为 1． 64 和 1． 45，结合
OD260 /OD230 值分析表明，改良 CTAB 法提取老叶
第 1 期 李芳芳，等:枫香树 DNA提取及 SＲAP-PCＲ反应体系的建立与优化 49
基因组 DNA的产率和纯度均较试剂盒法高。后者
不仅含量较低，且含有其他杂质，DNA 降解较严
重，将对下游 PCＲ反应和其他 DNA 分子操作产生
不利影响。
2． 2 SＲAP-PCＲ扩增体系的确立
2． 2． 1 正交试验结果分析 参照刘萌芽等［33］的
方法，对枫香树基因组 DNA 的 SＲAP-PCＲ 反应体
系中 Mg2 +浓度，dNTPs 浓度，引物浓度，Taq DNA
聚合酶和模板 DNA用量等设计 5 个因素 4 个水平
组合的正交试验结果进行统计分析(表 2)。Ｒ 值
结果表明，对枫香树基因组 DNA 的 SＲAP-PCＲ 反
应体系影响程度由大到小依次为:Taq DNA 聚合
酶，dNTPs浓度，Mg2 +浓度，模板 DNA 用量和引物
浓度;从 K值来看，Taq DNA聚合酶用量为 0． 9 U，
Mg2 +浓度为1． 5 mmol·L －1，dNTPs 浓度为 0． 16
mmol·L －1，引物浓度在 0． 4 ～ 0． 5 μmol·L －1范围
都较好，模板 DNA 用量在 80 ng 最好。根据 3 次
正交试验重复结果，初步确立枫香树基因组 DNA
的 SＲAP-PCＲ 扩增的适宜反应体系应为:0． 9 U
Taq DNA聚合酶、1． 5 mmol·L －1 Mg2 +、0． 14 mmol
·L －1 dNTPs、80 ng模板 DNA及 0． 4 ～ 0． 5 μmol·
L －1引物浓度。
按照表 2 正交试验设计的 16 个反应体系，随
机选用 Me3-Em11 引物进行 SＲAP-PCＲ 反应(图
2) ，结果表明，采用不同浓度的 Mg2 +，dNTPs，引物
及不同用量的 Taq DNA 聚合酶和模板 DNA 的 16
个反应体系，其扩增结果存在明显差异。第 1、14、
15 和 16 号反应体系的扩增效果较差，条带弱且多
态性也较低;第 2、3、4、6、7、8、9、13 号反应体系多
态性好，但条带均较弱;第 5、10、11、12 号 4 个反应
体系的扩增结果不仅条带清晰且多态性丰富。根
据遗传多样性分析要求初步选定 10 号反应体系:
0． 9 U Taq DNA聚合酶、1． 5 mmol·L －1 Mg2 +、0． 16
mmol·L －1 dNTPs、0． 5 μmol·L －1引物及 40 ng模
板 DNA。
1-16:不同的 SＲAP-PCＲ 反应体系;M:DL2000 DNA mark-
er．下同。
1-16:SＲAP-PCＲ amplification patterns in different reaction
systems) ;
M:DL2000 DNA marker． The same as below．
图 2 不同反应体系中枫香树 SＲAP-PCＲ
扩增图谱(引物组合Me3-Em11)
Fig． 2 SＲAP-PCＲ amplification patterns in different
reaction systems (primer combination Me3-Em11)
2． 2． 2 SＲAP-PCＲ 扩增体系的确立及引物筛选
由表 2，图 2 知，考虑扩增效果及试验成本，将正交
试验的模板用量由 80 ng 调为 40 ng，而将 10 号反
应体系的引物浓度由 0． 5 μmol· L －1调为 0． 4
μmol· L －1。最终确定枫香树基因组 DNA 的
SＲAP-PCＲ最优反应体系为总体积 20 μL 中含有
1 × PCＲ Buffer，1． 5 mmol·L －1 Mg2 +，0． 16 mmol·
L －1 dNTP，0． 5 μmol·L －1引物，0． 9 UTaq DNA 聚
合酶和 40 ng 模板 DNA。在该体系下随机选用枫
香树单株基因组 DNA 进行 SＲAP 引物筛选，按照
多态性丰富、条带清晰和重复性好的原则，在 96 对
SＲAP引物组合中筛选出 18 对条带清晰、稳定且
多态性丰富的引物，作为枫香树基因组的扩增引物
组合(图 3，表 3)。
图 3 筛选出的 18 对 SＲAP引物
Fig． 3 18 pairs of screened SＲAP primers
表 3 SＲAP引物及序列
Table 3 Primer sequence(5 －3)applied for SＲAP-PCＲ
正向引物
Forward primer
序列(5 － 3)
Sequence(5 － 3)
反向引物
Ｒeverse primer
序列(5 － 3)
Sequence(5 － 3)
Me2 TGAGTCCAAACCGGAGC Em1 GACTGCGTACGAATTAAT
Me3 TGAGTCCAAACCGGAAG Em3 GACTGCGTACGAATTGAC
Me4 TGAGTCCAAACCGGACC Em7 GACTGCGTACGAATTCAA
Me5 TGAGTCCAAACCGGACG Em8 GACTGCGTACGAATTCTG
Me6 TGAGTCCAAACCGGTAA Em9 GACTGCGTACGAATTCGA
Me7 TGAGTCCAAACCGGTCC Em11 GACTGCGTACGAATTCCA
Me8 TGAGTCCAAACCGGTGC Em12 GACTGCGTACGAATTATT
50 河 南 农 业 大 学 学 报 第 49 卷
2． 3 SＲAP-PCＲ反应体系稳定性分析
运用上述最优反应体系，随机选择 SＲAP引物
组合 Me3 － Em11 和 Me8 － Em8，在不同居群枫香
树随机选择 10 个单株基因组 DNA 进行 SＲAP-
PCＲ扩增(图 4)。结果显示，随机选择的引物对随
机选择的基因组 DNA均可扩增出多态性丰富且条
带清晰的 DNA片段。说明该 SＲAP-PCＲ反应体系
稳定可靠，适用于枫香树基因组 DNA 的 SＲAP-
PCＲ扩增反应。
图 4 枫香树基因组 DNA 的 SＲAP-PCＲ扩增图谱
Fig． 4 SＲAP-PCＲ amplificaion pattern of genomic DNA from L． formosana
3 结论和讨论
改良的 CTAB法可获得含量、纯度和完整性较
高的枫香树基因组 DNA，且实用性和性价比较高。
枫香树叶片中含有大量的萜类、黄酮类、苯丙素类、
多糖类、酚酸类化合物及其苷类等次生代谢产物，
并且 这 些 物 质 的 含 量 随 叶 片 成 熟 逐 渐 增
多［7，34 － 37］。而这些物质易与 DNA 结合形成极难
溶解的黏稠状物质，并抑制 PCＲ 反应过程中 Taq
DNA酶的活性，使扩增条带模糊甚至消失，严重影
响 PCＲ的反应效果。KIM 等［38］研究表明，使用抗
氧化剂 PVP 可以提高 DNA 的提取产率，陈大明
等［30］利用细胞区室化多酚类物质来排除干扰也获
得了较好的基因组 DNA。改良 CTAB 法可以采用
针对性的手段和步骤去除枫香树基因组 DNA 杂
质，更适合枫香树叶片基因组 DNA的提取，尤其是
对于硅胶快速干燥处理的枫香树老叶来说，无论
DNA的产率还是电泳结果都明显优于试剂盒法，
这对于特定时间内大规模调查和采样来研究 DNA
分子水平上的枫香树群体遗传多样性来说，具有节
省时间和经费的优势。枫香树基因组 DNA 的
SＲAP-PCＲ 最优反应体系扩增结果显示其具有多
态性丰富、条带清晰、重复性和稳定性好等特点。
该标记克服了 ＲAPD (Ｒandom Amplified Polymor-
phic DNA)重复性差、SSＲ (Simple Sequence Ｒe-
peat)位点较少和 AFLP (Amplified Fragment
Length Polymorphism)成本高等缺点。SＲAP-PCＲ
反应体系易受反应条件和扩增程序变化及物种的
影响。对影响枫香树 SＲAP-PCＲ 反应的 5 因素 4
水平的正交试验结果表明，Taq DNA聚合酶的用量
直接影响 SＲAP-PCＲ扩增结果的重复性和稳定性:
用量过低将降低反应的灵敏度，减少扩增量;用量
过多则会降低反应的特异性，易出现非特异性扩
增，且试验成本增高。dNTPs质量浓度是影响 PCＲ
反应的另一关键因素，该结果与樊洪泓等［39］对石
斛属 SＲAP-PCＲ扩增体系的影响因素实验结果相
一致，但与楚爱香［40］和任绪瑞等［41］研究结果不
同，这可能是不同物种对 SＲAP-PCＲ反应体系中的
影响因素敏感性差异所致。此外，多数研究结果表
明引物浓度对扩增结果的影响很小［42］，也与本研
究结果一致。由此可知，不同物种的基因组结构和
组成有其自身的特点，从而对 PCＲ 扩增体系的敏
感性有所差异，既有相似的影响因素，也有各自特
殊的反应条件。因此，应对不同的物种设计不同的
PCＲ反应条件。
以不同居群枫香树的 10 个随机选择个体基因
组 DNA为材料，采用正交试验设计建立适宜于枫
香树 SＲAP-PCＲ扩增的最优反应体系，并分别利用
2 对 SＲAP引物组合进行稳定性检测。结果表明，
本试验建立的枫香树 SＲAP-PCＲ反应体系稳定，可
靠，可进一步应用于枫香树群体遗传多样性分析、
种质鉴定、遗传连锁图谱构建和分子育种等方面
研究。
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(责任编辑:梁保松)