全 文 ：猴头菌 DNA提取条件及 SRAP-PCR体系的
优化
刘　麒1 , 2 , 潘祖桐1 , 李雨婷1 , 李　萌1 , 宋　慧1 , 杨小兵1
1.吉林农业大学生命科学学院 ,长春 130118;2.食药用菌教育部工程研究中心 ,长春 130118
摘　要:以猴头菌(Hericium erinaceus)菌丝体为试验材料 , 建立最优的 DNA 提取条件和 SRAP-PCR扩增体系。
结果表明:改进的 SDS-CTAB 法能较好地满足猴头菌属 DNA的提取 ,优化后 SRAP-PCR反应体系经过验证 ,
该体系可用于猴头菌的遗传多样性分析和品种鉴定。
关键词:猴头菌;SDS-CTAB;SRAP-PCR
中图分类号:Q523;Q949.329.7　　　文献标识码:A　　　文章编号:1000-5684(2012)01-0066-05
DOI:CNKI:22-1100/ S.20111009.1022.001
网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/ detail/ 22.1100.S.20111009.1022.001.html
引文格式:刘麒 , 潘祖桐 ,李雨婷 , 等.猴头菌 DNA提取条件及 SRAP-PCR体系的优化[ J] .吉林农业大学学
报 , 2012 , 34(1):66-70.
DNA Extraction and Optimization of SRAP Reaction System in Heriaci-
um1
LIU Qi1, 2 , PANG Zu-tong1 , LI Yu-ting1 , LI Meng1 , SONG Hui1 , YANG Xiao-bing1
1.College of Life Science , Jilin Agricultural University , Changchun 130118 , China;2.Engineering Re-
search Center for Edible and Medicinal Fungi , Ministry of Education , Changchun 130118 , China
Abstract:In this experiment , with Hericium erinaceus mycelium as material , the best DNA extraction
method and SRAP -PCR amplification system were optimized.The results showed that the improved
SDS-CTAB method contributed to a better extraction of Hericium Erinaceus DNA and the optimized
SRAP-PCR reaction verified proved that the system can be used in genetic diversity analysis and species
identification of Hericium Erinaceus.
Key words:Hericium erinaceus;SDS-CTAB;SRAP
　　目前对猴头菌属分类鉴定的分子生物学标记
方法仅有 RAPD 、RAMP 、ITS 序列分析等几种 ,且
各有优缺点 ,结果不是十分吻合 ,因此进一步探索
有效的分子标记方法是必要的也是亟待解决的问
题。序列相关扩增多态性(Sequence-Related Am-
plified Polymorphism , SRAP)是 2001 年 Li和 Quiros
博士开发并提出的[ 1] ,又称为基列扩增多态性
(Sequence-Based Amplified Polymorphism , SBAP)[ 2] 。
该方法利用独特的引物设计对基因组开放阅读框
区域(Qpen Reading Frames , ORFs)进行扩增 ,针对
基因外显子中富含GC 而启动子和内含子中富含
AT的特点来设计引物 ,无需任何序列信息即可直
接进行 PCR扩增 ,因不同个体 、物种的内含子 、启
动子及间隔区长度不等而产生多态性 。SRAP 技

通讯作者
基金项目:吉林省科技发展项目(20060924),吉林省教育厅“十一五”科学技术研究项目(2004-2007)
作者简介:刘麒 ,女 ,硕士 ,研究方向:菌物生物化学。
收稿日期:2010-11-04　　网络出版时间:2011-10-09 10:22
吉林农业大学学报　2012 ,34(1):66 ～ 70 http:// xuebao.jlau.edu.cn
Journal of Jilin Agricultural University E-mail:jlndxb@vip.sina.com
术具有简便 、稳定 、高共显性 、高重复性 、引物通用
性强 、便于测序等特点 ,该标记方法已在松口蘑 、
香菇 、灵芝 、真姬菇等药食用真菌中较好地应用 ,
与 RAPD 相比更适用于真姬菇的种内鉴定[ 3-5] 。
本研究旨在建立适用于猴头菌属的 DNA提取方
法和 SRAP-PCR反应体系 ,为猴头菌属的遗传多
样性分析和种内种间的分类鉴定提供依据。
1　材料与方法
1.1　材料和试剂
试验所用猴头菌菌丝体为试管斜面 PDA培
养基培养 ,菌种编号 H1 ～ H8 ,均由吉林农业大学
生化实验室提供 ,4 ℃保存备用 。
选用引物对 me4/em1 、me1/em1 均为 Li 和
Quiros[ 2]设计 ,由上海生工生物技术有限公司合
成。
1.2　方法
1.2.1　基因组 DNA提取条件的优化 、检测及含
量测定　根据猴头菌特点 ,对 SDS-CTAB法[ 6-7]
的步骤和提取液配方进行改良 ,设计8个方案(表
1),采用 1%琼脂糖电泳检测DNA完整性 ,紫外分
光光度计测定含量 ,TE 溶液溶解并置于-20 ℃
冰箱保存备用。
1.2.2　SRAP -PCR体系优化　基本扩增体系:
10 倍 PCR Buffer 2.5 μL , dNTPs (2.5 mmol/L)
2 μL ,Mg2+(25 mmol/L)1.5 μL ,引物(10 μmol/L)
1 μL , Taq酶(5 U)0.3 μL ,模板 DNA (25 ng/μL)
1 μL ,最后用 ddH2O将总体积补至 25μL。
表 1　基因组 DNA提取方案
Table 1.The extraction method of genomic DNA
方案
Method
ρ(CTAB)/
(g·L -1)
ρ(PVP-
40)/
(g·L-1)
Υ(β-巯基乙醇)/ %β-Merca-
ptoethanol
ρ(SDS)/
(g·L-1)
Ⅰ 20 10 2 0
Ⅱ 20 10 2 20
Ⅲ 30 30 2 0
Ⅳ 30 30 2 20
Ⅴ 30 50 2 0
Ⅵ 30 50 2 20
Ⅶ 30 100 2 0
Ⅷ 30 100 2 20
扩增程序:94 ℃预变性 4min;94 ℃变性45 s ,
35 ℃退火45 s ,72 ℃延伸1 min ,5个循环;94 ℃变
性45 s ,50 ℃复性 45 s , 72 ℃延伸 1 min ,35个循
环;72 ℃延伸8 min;4 ℃保存 。
扩增产物用含有 EB(0.5 μg/mL)的 1.5%琼
脂糖凝胶电泳检测 ,凝胶成像系统观察 、照相和分
析。
(1)单因素试验 。提取H7的DNA作为模板 ,
采用 me4/em1为优化引物对 ,对影响 PCR体系的
单因素进行优化(表 2),设 2次重复 。
表 2　SRAP-PCR 体系单因素试验
Table 2.Single factor test of SRAP-PCR system
水平
Level
m(模板DNA)/ ng c(Mg
2+)/
(mmol·L-1)
c(dNTPs)/
(mmol·L -1)
c(引物)/
(μmol·L-1) Taq酶/U
1 7.5 1.4 0.10 0.28 1.5
2 12.5 1.6 0.15 0.36 2.5
3 17.5 1.8 0.20 0.44 3.5
4 22.5 2.0 0.25 0.52 4.5
5 27.5 2.2 0.30 0.60 5.5
6 32.5 2.4 0.35 0.68 6.5
7 2.6
8 2.8
　　(2)正交试验和优化体系稳定性试验 。在单
因素试验基础上 ,采用 L16(45)正交试验设计(表
3),引物对为 me4/em1 , 2次重复 , 1.5%琼脂糖凝
胶电泳检测。采用引物对 me1/em1鉴定优化体
系的稳定性 ,对 8个供试菌株 DNA进行扩增 ,6%
变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测 。
67刘麒等:猴头菌 DNA提取条件及 SRAP-PCR体系的优化
吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University
表 3　SRAP-PCR反应的因素与水平
Table 3.Factors and levels of SRAP-PCR system
水平
Level
m (模板 DNA)/ ng c(Mg2+)/(mmol·L-1)
c(dNTPs)/
(mmol·L-1)
c(引物)/
(μmol·L-1) Taq酶/U
1 17.50 2.4 0.150 0.36 3.75
2 18.50 2.5 0.175 0.40 4.00
3 20.00 2.6 0.200 0.44 4.25
4 21.25 2.7 0.225 0.48 4.50
2　结果与分析
2.1　基因组 DNA提取条件的优化 、检测及含量
测定
由表 4和图 1可见 ,随着 CTAB和 PVP-40量
的增加 ,提取得到的 DNA质量也随之提高 。采用
方案 Ⅵ 提取的DNA质量最好 ,SDS的增加提高了
DNA含量 ,OD260/OD280值为 1.8 ～ 2.0 ,沉淀呈透明
状 ,易溶于 TE中 ,所以确定方案 Ⅵ为猴头菌 DNA
的最佳提取方案。
表 4　紫外检测结果
Table 4.The results of UV test
方案
Method
OD260 OD280 OD260/OD280 ρ(模板DNA)/(ng·μL-1)
Ⅰ 0.012 0.007 1.70 120
Ⅱ 0.019 0.011 1.73 190
Ⅲ 0.022 0.013 1.70 220
Ⅳ 0.022 0.011 2.00 220
Ⅴ 0.048 0.026 1.85 480
Ⅵ 0.065 0.036 1.80 650
Ⅶ 0.031 0.017 1.82 310
Ⅷ 0.032 0.015 2.10 320
M.DL2000;1 ～ 8.依次为方案Ⅴ 、Ⅵ 、Ⅰ 、Ⅱ 、Ⅲ 、Ⅳ、 Ⅶ 、Ⅷ
Methods of extraction is Ⅴ 、Ⅵ 、Ⅰ 、Ⅱ 、Ⅲ 、Ⅳ、Ⅶ 、Ⅷ in turn
图 1　8种提取方案提取的猴头菌基因组 DNA
Fig.1.Hericium erinaceus DNA extracted from eight
different methods of extraction
2.2　PCR体系优化
2.2.1　单因素试验　(1)模板DNA(25 ng/μL)浓
度对 SRAP 扩增的影响结果。由图 2可见 ,随着
DNA模板量的增加 ,扩增条带逐渐增加 ,当 DNA
模板质量为17.5 ng 时 ,SRAP 扩增条带最丰富 、清
晰且稳定 ,模板量继续增加 ,扩增条带减少 ,说明
猴头菌 SRAP -PCR扩增的最适 DNA 模板量为
17.5 ng 。
M.DL2000;1～ 6.DNA模板量依次为 7.5 , 12.5 , 17.5 , 22.5 ,
27.5, 32.5 ng DNA concentration is 7.5 ,12.5, 17.5 , 22.5 , 27.5 ,
32.5 ng in turn
图 2　模板 DNA浓度对 SRAP-PCR扩增的影响
Fig.2.The amplification result of SRAP-PCR reac-
tion systemwith different amount of DNA
(2)Mg2+浓度对 SRAP 扩增结果的影响。由
68　　吉林农业大学学报　2012年 2月
Journal of Jilin Agricultural University 2012 , February
图3可见 ,Mg2+浓度为 1.4 ～ 2.8 mmol/L 均能扩
增出条带 ,而浓度为 2.4 mmol/L 时扩增条带丰
富 、清晰且稳定 , 所以选择 2.4 mmol/L 为最适
Mg2+浓度。
(3)dNTPs浓度对 SRAP扩增结果的影响 。由
图4可见 ,0.1 ～ 0.2 mmol/L的 dNTPs均能扩增出
较清晰且稳定的条带 ,但以0.2 mmol/L时最佳 ,随
着浓度的提高扩增条带越来越弱。
M.DL2000;1～ 8.Mg2+浓度依次为 1.4 , 1.6 , 1.8 , 2.0 , 2.2 ,
2.4, 2.6 , 2.8 mmol/ L Mg2+ concentration is 1.4 , 1.6 , 1.8 , 2.0 ,
2.2, 2.4 , 2.6 , 2.8 mmol/ L in turn
图 3　Mg2+浓度对 SRAP-PCR扩增的影响
Fig.3.The amplification result of SRAP-PCR reac-
tion system with different concentration of
Mg2+
M.DL2000;1～ 6.dNTPs 浓度依次为 0.10 , 0.15 , 0.20 , 0.25 ,
0.30 , 0.35 mmol/L dNTPs concentration is 0.10 , 0.15, 0.20 ,
0.25 , 0.30 , 0.35 mmol/ L in turn
图 4　dNTPs 浓度对 SRAP-PCR 扩增的影响
Fig.4.The amplification result of SRAP-PCR reac-
tion system with different concentration of
dNTPs
(4)引物浓度对 SRAP 扩增结果的影响。由
图5可见 ,6个引物浓度均能扩增出条带 ,且随着
引物浓度的增加 ,扩增条带由弱到强 ,数目由少到
多。当引物浓度为 0.44 μmol/L 时 ,条带清晰稳
定 ,故将引物浓度确定为 0.44μmol/L。
M.DL2000;1～ 6 引物浓度依次为 0.28 , 0.36 , 0.44 , 0.52 ,
0.60 , 0.68 mol/ L Concentration of 0.28, 0.36 , 0.44 , 0.52 , 0.60 ,
0.68 mol/ L in turn
图 5　引物浓度对 SRAP-PCR扩增的影响
Fig.5.The amplification result of SRAP-PCR reac-
tion system with different concentration of
primers
(5)Taq酶浓度对SRAP 扩增结果的影响 。由
图 6可见 ,当 Taq 酶浓度为 3.5 U时 ,条带清晰稳
定且丰富 ,随着浓度的增加 ,条带模糊。从经济和
稳定性考虑 ,确定 Taq 酶的浓度为 3.5 U。
M.DL2000;1～ 6.Taq酶依次为 1.5 , 2.5 ,3.5 , 4.5 , 5.5 , 6.5 U
Taq polymerase concentration is 1.5 , 2.5 , 3.5, 4.5, 5.5 , 6.5 U in
turn
图 6　Taq 酶浓度对 SRAP-PCR 扩增的影响
Fig.6.The amplification result of SRAP-PCR reac-
tion system with different amount of Taq DNA
polymerase
2.2.2 　正交试验和优化体系稳定性试验结
果　正交试验结果见图 7。猴头菌属 SRAP-PCR
最佳反应体系(25 μL)为模板 DNA 质量为 0 ng、
Mg+浓度 2.4 mmol/L 、dNTPs浓度 0.2 mmol/L、引
物浓度 0.48μmol/L 、Taq酶 4 U。依此条件 ,采用
引物me1/em1组合对供试的8个菌株扩增进行优
化体系稳定性验证。由图 8可见 ,扩增后条带清
69刘麒等:猴头菌 DNA提取条件及 SRAP-PCR体系的优化
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晰丰富且稳定性好 ,表明该反应体系适用于猴头
菌属的SRAP 分析 。
M.DL2000;1 ～ 16.L16(45)正交试验处理组合扩增结果
L16(45)Amplifiat ion results of system according to orthogond design
图 7　反应体系正交试验设计的 SRAP-PCR 扩增
结果
Fig.7.SRAP-PCR amplification of system according
to orthogonal design
M.DL2000;1～ 8.H1～ H8
图 8　SRAP 引物 me1/ em1对 H1～ H8的检测结果
Fig.8.Electrophoresis of amplification products of
H1—H8 by primer me1/ em1 of SRAP-PCR
system
3　讨　论
在分子生物学研究中 ,DNA的质量是影响试
验结果的关键因素之一。猴头菌菌丝体中蛋白
质 、多糖 、多酚类物质含量很高 ,且在 DNA提取过
程中很难去除 ,容易出现 DNA沉淀难溶和易发生
褐变等现象 ,进而影响 DNA的质量。CTAB可溶
解细胞膜 ,可从低离子强度的溶液中沉淀核酸和
酸性多聚糖 ,在这种情况下 ,蛋白质和中性多聚糖
仍留在溶液中 ,在高离子强度溶液中 ,CTAB与蛋
白质和大多数酸性多聚糖以外的多聚糖形成复合
物 ,使核酸便于分离。叶磊[ 8] 、谭美莲[ 9] 及韦金
菊[ 10]等人报道在含酚类物质较多的植物 DNA提
取过程中 ,在提取液中加入 β-巯基乙醇和聚乙烯
吡咯烷酮(PVP)对抑制酚类物质的氧化起到非常
重要的作用 。本试验证明 ,PVP-40含量的增加可
减少 DNA提取过程中褐变的现象 ,含量为 50 g/L
时明显降低了 DNA 褐化程度 ,获得的 DNA 易溶
解且质量最高。DNA 模板浓度 、Mg2+浓度 、引物
浓度 、dNTPs浓度和 Taq 酶浓度都不同程度地影
响 PCR的扩增效率及扩增产物特异性 。综合文
献[ 3-5]可知 ,对于不同的试验材料 ,SRAP-PCR的
最佳反应体系存在一定的差别 。在真菌分类鉴定
系统中也有不少关于 SRAP 体系优化的研究报
道 ,与本试验针对猴头菌属确定的 PCR 体系相
比 ,在引物 、Taq 酶和模板 DNA量 3 个因素差别
很大 ,Mg2+和 dNTPs 差别相对较小 ,说明对于不
同的试验材料 ,优化 SRAP-PCR反应体系是非常
重要且完全必要的。
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(责任编辑:王希)
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