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银叶树种子蛋白的提取及其功能性研究
熊 拯，钟秋平，李丽清
( 钦州学院 海洋学院，广西钦州 535099)
摘 要:以银叶树种子为原料，考察提取工艺对其蛋白提取率的影响。通过单因素实验对影响银叶树种子蛋白提取率
的 pH、提取时间、液料比和提取温度等四个因素进行研究，并采用 Box－Behnken实验设计和响应曲面分析法确定银叶
树种子蛋白提取的最佳工艺条件。结果表明: 最佳提取工艺条件为提取温度 55℃、pH10、提取时间 2h、液料比 11∶1，在
此条件下蛋白提取率为 50.85% ;银叶树种子蛋白的吸水性、起泡性和泡沫稳定性优于大豆分离蛋白;而大豆分离蛋白
的吸油性、乳化能力和泡沫稳定性优于银叶树种子蛋白。
关键词:响应曲面，银叶树种子，蛋白质，提取
Study on the extraction and function of Heritiera littoralis seed protein
XIONG Zheng，ZHONG Qiu－ping，LI Li－qing
( School of Ocean，Qinzhou University，Qinzhou 535099，China)
Abstract: The effect of process on extraction rate of Heritiera littoralis seed protein was discussed in this study.The
factors of pH，temperature，time，and liquid /solid ratio were studied by single factor experiments，and Box －
Behnken design and response surface methodology were applied to confirm the optimum experiment condition.
The highest protein extraction rate was 50.85% under the condition: temperature( 55℃) ，pH10，extraction time 2h，
liquid /solid ratio 11∶1.The water retention capability，foaming properties and foaming stability of Heritiera littoralis
seed protein were better than SPI; the oil－ absorbing，emulsifying capacity，and emulsifying stability of SPI were
better than Heritiera littoralis seed protein’s.
Key words: response surface methodology( ＲSM) ; Heritiera littoralis seed ; protein; extraction
中图分类号:TS202. 1 文献标识码:B 文 章 编 号:1002－0306(2015)01－0239－05
doi:10． 13386 / j． issn1002 － 0306． 2015． 01． 041
收稿日期:2014－02－10
作者简介:熊拯( 1981－ ) ，男，硕士，副教授，研究方向:粮食、油脂及植
物蛋白工程。
基金项目:广西高校科学技术研究项目( 2013YB260) 。
银叶树(Heritiera littoralis)是银叶树属红树植
物，也称大白叶仔，为梧桐科银叶树属真红树植物，
广泛分布于热带海岸，在我国海南、广东、广西和台
湾等地均有分布［1］。果实内仅含一粒种子，为其主要
药用部位，种子无胚乳，主要由两片肥厚的子叶构
成［2］，银叶树种子主治腹泻、痢疾［3］，其种仁被作为一
种滋补品，有一定的食用价值［4］。
目前，国内外学者关于银叶树的研究主要集中
于通过溶剂萃取、大孔吸附树脂柱层析、硅胶柱层
析、Sephadex LH.20 柱层析、HPLC 等方法从该植物
的根、茎、叶中分离鉴定化合物［5－7］，但是从食品研究
开发的角度对银叶树进行的研究非常少。本研究拟
采用碱溶酸沉法［8－10］对银叶树种子中的蛋白质进行
提取，通过单因素实验考察 pH、提取温度、提取时间
和液料比四个因素对提取率的影响，并采用响应曲
面法对银叶树种子蛋白质的提取条件进行优化，以
期为银叶树种子系列食品的开发提供一定的理论
依据。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
银叶树种子，采自防城港银叶树生态保护区;石
油醚，分析纯，成都科龙化工试剂厂;硫酸钾、硫酸铜
和硼酸，分析纯，广东光华化学厂有限公司;硫酸、盐
酸和甲基红，分析纯，成都科龙化工试剂厂;溴甲酚
绿、醋酸和醋酸钠，分析纯，天津市光复精细化工研
究所。
80－1 型电动离心机 上海梅香仪器有限公司;
FA2004 型电子分析天平 上海耀杰有限公司;PHS
－3CF型精密酸度计，上海大普仪器有限公司;101－3
型电热鼓风恒温干燥箱 上海东星建材实验设备有
限公司;自动凯氏定氮仪 国药集团化学试剂有限
公司;FW－100 型高速万能粉碎机 上海胜启仪器仪
表有限公司;HH－4 型数显恒温水浴锅 金坛市科析
仪器有限公司;SHB－IIIA 型循环水式多用真空泵
上海豫康科教仪器设备有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 银叶树种子脱脂 银叶树果实去壳后，在温
度 50℃下的烘箱里烘干至恒重，粉碎，过 40 目筛，按
照 10∶1(V /W，以下同)的液料比用石油醚脱脂，置于
冰箱中冷藏备用。
1.2.2 银叶树种子蛋白等电点的测定 称取 10g 样
240
品，液料比为 10∶1，pH 调至 10。在温度 30℃下磁力
搅拌浸提 1.0h，离心(4000r /min，20min)取上清液，
分取上清液 8 份各 20mL，用醋酸和醋酸钠缓冲溶液
分别调 pH为 1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5 和
6.0，离心(4000r /min，20min)，出现沉淀量最大时的
缓冲溶液 pH 为银叶树种子蛋白质的等电点。实验
中出现沉淀量最大时的缓冲溶液 pH为 3.5。
1.2.3 银叶树种子蛋白的提取工艺流程 银叶树果实
→去壳→干燥→粉碎( 过 40 目筛) →脱脂→搅拌浸提→离心
分离( 4000r /min，10min) →取上清液→调蛋白等电点→离心
分离( 4000r /min，20min) →沉淀→干燥→粗蛋白［11］
其中，蛋白质提取率计算如下:
蛋白质提取率(%)=(产品质量 ×产品中蛋白
质的百分含量 /样品质量 ×样品中蛋白质的百分含
量)× 100
其中，样品为粉碎后的银叶树种子;产品为所提
取的蛋白质;蛋白提取液和产品中的蛋白质含量用
微量凯氏定氮法测定。
1.2.4 单因素实验
1.2.4.1 提取温度的影响 固定 pH 为 10.0，提取时
间为 1.0h，液料比为 10 ∶1，提取温度设定 25、35、45、
55、65℃五个水平梯度，考察提取温度对银叶树种子
蛋白提取率的影响。每个实验点做三次重复。
1.2.4.2 pH 的影响 固定提取温度为 55℃，提取时
间为 1.0h，液料比为 10∶1，pH 设定 8.0、9.0、10.0、11.0
和 12.0 五个水平梯度，考察 pH对银叶树种子蛋白提
取率的影响。每个实验点做三次重复。
1.2.4.3 提取时间的影响 固定提取温度为 55℃，
pH为 10.0，液料比为 50 ∶1，提取时间设定 1.0、1.5、
2.0、2.5、3.0h五个水平梯度，考察提取时间对银叶树
种子蛋白提取率的影响。每个实验点做三次重复。
1.2.4.4 液料比的影响 固定提取温度为 55℃，pH
为 10.0，提取时间为 2.0h，液料比设定 5 ∶ 1、10 ∶ 1、
15∶1、20∶1、25∶1 五个水平梯度，考察液料比对银叶树
种子蛋白提取率的影响。每个实验点做三次重复。
1.2.5 响应曲面实验设计 应用 Design Expert 软
件，根据 Box－Behnken 中心组合设计原理，在单因素
实验结果的基础上，综合考虑实际生产的需要，以银
叶树种子为原材料，碱溶 pH 为 X1，提取时间为 X2，
提取温度为 X3，液料比为 X4，蛋白提取率 Y 为响应
值，进行响应曲面实验设计，因素水平见表 1。在实
验设计中，每个实验点重复 3 次，结果取平均值。数
据分析主要采用散点图、相关分析和回归分析等方
法进行。
表 1 实验设计因素与水平
Table 1 Factors and levels of the experiments
编码
因素
X1 碱溶
pH
X2 提取时间
(h)
X3 提取温度
(℃)
X4 液料比
(v /w)
－ 1 9.0 1.5 45 5∶1
0 10.0 2.0 55 10∶1
1 11.0 2.5 65 15∶1
1.2.6 银叶树种子蛋白功能特性评价方法 本文分
别参照相应的参考文献对银叶树种子蛋白的吸水
性、吸油性、乳化性、乳化稳定性、起泡性及泡沫稳定
性功能性进行评价分析［11－12］。
2 结果与分析
2.1 单因素对银叶树种子蛋白提取率的影响
2.1.1 提取温度的影响 由图 1 可知，银叶树种子蛋
白的提取率随着温度的升高而增加，温度 55℃时达
到最高值;而提取温度超过 55℃，提取率呈现逐渐降
低的趋势。因为蛋白质溶解时必须破坏蛋白质之间
的相互作用，而加热使蛋白质分子间和分子内的二
硫键断裂，亚基伸展，疏水基暴露，使蛋白质的氮溶
解指数升高［13］;但在温度高于 55℃时，随着温度的升
高，蛋白质开始变性，蛋白质的氮溶解指数降低。因
此，温度选择在 55℃较为适宜。
图 1 提取温度对银叶树种子蛋白提取率的影响
Fig.1 Effect of temperature on the extraction
of Heritiera littoralis seed protein
2.1.2 pH的影响 由图 2 可知，在 pH10 时，蛋白质
的提取率最好，降低或增加 pH 均有使蛋白质提取率
降低的趋势。可能是由于碱液对蛋白质体系的平衡
和多肽链中某些侧链基团的解离程度发生变化的结
果。因此，选择 pH较为 10 适宜。
图 2 pH对银叶树种子蛋白提取率的影响
Fig.2 Effect of pH on the extraction
of Heritiera littoralis seed protein
2.1.3 提取时间的影响 由图 3 可知，蛋白质的提取
率随着提取时间的延长呈现先增大后减小的趋势。
这是由于随着提取时间的延长，溶液中的蛋白质出
现凝聚沉淀，离心时蛋白质和残渣一同被排除，从而
降低了蛋白质的提取率［14－15］。因此，提取时间选择
2h较为适宜。
2.1.4 液料比的影响 由图 4 可知:当液料比为10∶1
时，蛋白质的提取率最高。在液料比由 5 ∶1 上升到
241
图 3 提取时间对银叶树种子蛋白提取率的影响
Fig.3 Effect of time on the extraction
of Heritiera littoralis seed protein
10∶1，随着液料比的增加，蛋白质的提取率也升高。
液料比达到 10∶1 后继续增加，蛋白质的提取率反而
降低了。因此，液料比选择 10∶1 较为适宜。
图 4 液料比对银叶树种子蛋白提取率的影响
Fig.4 Effect of liquid /solid ratio on the extraction
of Heritiera littoralis seed protein
2.2 提取条件的优化
2.2.1 结果回归分析 由单因素实验可知，不同因
素对蛋白提取率的影响程度不同，故以 pH、提取时
间、液料比和提取温度四个因素为可控工艺参数，以
提取率为实验指标，采用 Box－Behnken 设计方法来
优化银叶树种子蛋白提取工艺条件，实验设计方案
及结果见表 2。
利用 Design Expert 软件，通过表 3 中实验数据
进行多元回归拟合，获得银叶树种子蛋白质提取率
对编码自变量 pH、提取时间、液料比和提取温度的
二次多项回归方程:
Y = 52.83 + 0.61X1 + 0.21X2 + 0.49X3 －0.37X4 +
0.68X1X2 + 0.47X1X3 + 0.35X1X4 －0.1X2X3 －0.24X2X4 －
0.077X3X4－3.31X1
2－1.29X2
2－1.24X3
2－1.62X4
2
回归方程中各变量对蛋白质提取率影响的显著
性由 F检验来判定;概率 p 越小则相应变量的显著
性越高［16］。对上述回归模型进行方差分析(表 3)，
结果表明，回归方程极显著，相关系数的平方即 Ｒ2 =
97.20%，说明响应值(提取率)的变化有 97.20%来源
于所选变量，即浸提温度，浸提时间和料液比。因
此，回归方程拟合度良好，可利用该方程代替真实实
验点进行分析。由 P 值可知，方程的 X1、X3、X1X2、
X1
2、X2
2、X3
2 和 X4
2 对 Y值影响极显著，X4、X1X3 对 Y
值影响显著，表明该方程并非简单的线性关系，交互
作用对响应值影响很大，方程二次项对响应值影响
也很大。失拟项 p = 0.1890，无显著性影响，表明数据
没有异常点，不需要分析更高次数的项，模型适当。
表 2 Box－Behnken实验设计及结果
Table 2 Box－Behnken experimental design and results
实验号 X1 X2 X3 X4
Y蛋白质
提取率(%)
1 0 1 0 － 1 48.21
2 0 1 0 1 48.00
3 0 － 1 0 － 1 47.50
4 1 0 0 － 1 50.02
5 1 － 1 0 0 50.00
6 0 0 1 － 1 51.01
7 0 0 0 0 49.50
8 － 1 0 － 1 0 50.02
9 0 1 1 0 48.00
10 － 1 1 0 0 48.40
11 1 0 － 1 0 47.00
12 1 1 0 0 48.80
13 － 1 0 0 1 49.70
14 0 0 0 0 50.20
15 0 0 0 0 50.90
16 1 0 0 1 51.00
17 0 1 1 0 47.15
18 － 1 － 1 0 0 47.60
19 0 0 － 1 1 47.30
20 － 1 0 0 － 1 49.65
21 － 1 0 1 0 49.80
22 1 0 1 0 50.60
23 0 0 － 1 1 49.02
24 0 0 0 0 48.95
25 0 0 1 1 53.00
26 0 1 － 1 0 52.60
27 0 － 1 0 1 52.90
2.2.2 响应面分析及蛋白质提取条件的优化 通过
响应曲面图可以直观地反映实验条件对蛋白质提取
效果的影响。由图 5 可知，提取率随着温度的升高
而增加，而提取温度超过 50℃，提取率呈现逐渐降低
的趋势;提取率随着 pH 的升高而增加，而 pH 超过
10 时，呈现逐渐降低的趋势;提取率提取率随着提取
时间的增长而显著增加，而提取时间超过 2h，提取率
反而有下降的趋势;蛋白质的提取率随着液料比的
增加而增加，而液料比超过 10∶1，蛋白质的提取率反
而降低了。这与单因素实验的结果趋势相同。
为了进一步求得各因素的最佳条件组合，对回
归方程进行数学处理，偏导求零后的极值方程组求
解，得到银叶树种子蛋白提取的优化条件为:碱溶
pH10.11，时间 2.055 h，液料比 11.05∶1，温度 56.1℃，
此时所得蛋白提取率为 52.95%。采取上述最优条件
进行实验，同时考虑到实际操作的情况，将银叶树种
子蛋白质提取条件修正为提取温度 55℃、pH10、提取
时间 2h、液料比 11∶1，粗蛋白质量分数为 88.53%;实
测提取率为 50.85%，说明采用响应面分析法优化得
242
表 3 回归模型方程的方差分析
Table 3 Analysing variance of regression model
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 Pr ＞ F 显著性
模型 73.24 14 5.23 29.72 ＜ 0.0001 ＊＊
X1 4.44 1 4.44 25.23 0.0003 ＊＊
X2 0.58 1 0.58 3.30 0.0043 ＊＊
X3 2.91 1 2.91 16.54 0.0016 ＊＊
X4 1.58 1 1.58 8.96 0.0112 *
X1X2 1.86 1 1.86 10.58 0.0069 ＊＊
X1X3 0.90 1 0.90 5.13 0.0429 *
X1X4 0.50 1 0.50 2.82 0.1187
X2X3 0.04 1 0.04 0.23 0.6421
X2X4 0.19 1 0.19 1.07 0.3203
X3X4 0.02 1 0.02 0.14 0.7182
X1
2 58.67 1 58.67 333.29 ＜ 0.0001 ＊＊
X2
2 8.80 1 8.80 49.96 ＜ 0.0001 ＊＊
X3
2 8.27 1 8.27 47.00 ＜ 0.0001 ＊＊
X4
2 13.83 1 13.83 78.58 ＜ 0.0001 ＊＊
剩余项 2.11 12 0.18
失拟项 2.03 10 0.20 4.67
纯误差 0.09 2 0.04 0.189
总和 75.35 26
注:Pr值是方差齐性检查的结果;＊＊表示极显著水平(p ＜ 0.01);* 表示显著水平(p ＜ 0.05)。
图 5 各因素交互作用对银叶树种子蛋白提取率影响的响应曲面图
Fig.5 Ｒesponse surface plots showing the interactive effects of various extraction conditions
on the extraction yield of Heritiera littoralis seed protein
243
到的实验参数是可靠的。
2.2.3 银叶树种子蛋白与大豆分离蛋白的功能性质
比较 实验将银叶树种子蛋白与大豆分离蛋白的几
种功能性质进行了比较研究［11］，实验结果见表 4。结
果表明，银叶树种子蛋白的吸水性、起泡性和泡沫稳
定性优于大豆分离蛋白;而大豆分离蛋白的吸油性、
乳化能力和泡沫稳定性优于银叶树种子蛋白。
表 4 银叶树种子蛋白和大豆分离蛋白的功能性比较
Table 4 Comparing on functionality of
Camellia oleifera seed protein and SPI
功能性 银叶树种子蛋白 大豆分离蛋白
吸水性(mL水 /g蛋白) 3.6 3.2
吸油性(mL油 /g蛋白) 1.8 2.2
乳化能力(%) 68.5 70.5
乳化稳定性(%) 85.2 88.4
起泡性(%) 110.1 60.9
泡沫稳定性(%) 78.4 85.0
3 结论
通过单因素实验和 Box－Behnken 实验设计以及
响应面分析对银叶树种子蛋白提取工艺进行了优
化，各因素对提取率的影响大小为:碱溶 pH ＞提取
温度 ＞液料比 ＞提取时间。结合实际操作，确定提
取银叶树种子蛋白质的最优条件是:提取温度 55℃、
pH10、提取时间 2h、液料比 11∶1，提取率为 50.85%。
银叶树种子蛋白的吸水性、起泡性和泡沫稳定性优
于大豆分离蛋白;而大豆分离蛋白的吸油性、乳化能
力和泡沫稳定性优于银叶树种子蛋白。
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