全 文 ：头花蓼对幽门螺杆菌生长及代谢相关基因的影响*
＊
任艳君，莫 非＊＊，张 姝，何 芸，吴 琼，谢小琴，赵书琴
(贵州医科大学 临床检验教研室，贵州 贵阳 550004)
［摘 要］目的:观察苗药头花蓼对幽门螺杆菌(H． pylori)生长代谢及其相关基因的表达的影响。方法:将
H. pylori菌接种于不同浓度的头花蓼培养基(头花蓼终浓度分别为 64、32、16、8、4、2、1 及 0. 5 g /L)，测定无
H. pylori菌生长时头花蓼的最小抑菌浓度(MIC);将 H． pylori 菌接种于无头花蓼培养基(对照组)和头花蓼 MIC
培养基(头花蓼组)培养 36 h，每隔 4 h采用用酶标仪检测 590 nm处的吸光度值，绘制 H． pylori生长曲线;用实时
荧光定量 PCR(Real-Time PCR)检测 2 组 H． pylori菌液生长代谢相关基因 FrdA、FrdB、HyuA 及 Pfr 的表达水平。
结果:头花蓼对 H． pylori最低抑菌浓度 MIC 为 4 g /L，头花蓼组 H． pylori 生长曲线位于对照组之下，Real － time
PCR结果显示头花蓼作用后，头花蓼组生长代谢相关基因 FrdA、FrdB、HyuA及 Pfr基因 mRNA均呈减弱趋势，差
异具有统计学意义(P ＜ 0. 05)。结论:头花蓼在体外对 H． pylori 具有明显抑制作用，可通过影响细菌生长代谢
相关基因的表达来抑制 H． pylori的生长。
［关键词］螺杆菌，幽门;生长;头花蓼;代谢;基因
［中图分类号］R961． 1 ［文献标识码］A ［文章编号］1000-2707(2016)02-0175-04
Effect of Polygomun capitutam on Helicobacter Pylori
Growth Metabolism Associated Gene
REN Yanjun，MO Fei，ZHANG Shu，HE Yun，WU qiong，XIE Xiaoqin，ZHAO Shuqin
(Department of Laboratory Science，Guizhou Medical University，Guiyang 550004，Guizhou，China)
［Abstract］Objective:To observe the effect of Polygonum capitatum on growth metabolism associated
genes expression of H． pylori． Methods:H． pylori fungus was inoculated in varied Polygonum capita-
tum concentration medium (final concentration as 64，32，16，8，4，2，1 and 0． 5 g /L);testing min-
imal inhibitory concentration (MIC)of Polygonum capitatum when no H． pylori grows;H． pylori fungus
was inoculated in no-Polygonum capitatum (control group)and Polygonum capitatum MIC (Polygo-
num capitatum group)to cultivate for 36 h，and test Absorbance value of 590 nm in every 4 h by ELI-
ASA;then draw the H． pylori growth curve;real-time fluorescence quantitative PCR was adopted to test
expression level of growth metabolism associated genes FrdA，FrdB，HyuA and Pfr both groups H． py-
lori fungus solution． Results:the min MIC concentration of Polygomun capitutam on H． pylori was 4 g /
L，growth curve of Polygomun capitutam H． pylori was below control group;Real-time PCR results
showed that after Polygomun capitutam taking effect，growth metabolism associated genes of Polygomun
capitutam group，mRNA of FrdA，FrdB，HyuA and Pfr gene were decreasing，differences had statistical
significance (P ＜ 0． 05)． Conclusion:Polygonum capitatum has obvious inhibitory effect on H． pylori
in vitro，Polygonum capitatum can inhibit the growth of H． pylori by affecting the growth of growth me-
tabolism related genes．
［Key words］Helicobacter pylori;growth;Polygonum capitatum;metabolism;gene
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第 41 卷 第 2 期
2016 年 2 月
贵 阳 医 学 院 学 报
JOURNAL OF GUIYANG MEDICAL COLLEGE
Vol． 41 No． 2
2016． 2
* *［基金项目］贵州省科学技术基金［黔科合 J字(2014)2027 号］;贵州省科技合作计划［黔科合 LH 字(2015)7417 号］;贵州省卫生计生委科学技术基金
(gzwjkj2015 － 1 － 1003);贵阳市科技局计划项目［筑科合同(20141001)］
＊＊通信作者 E-mail:354406804@ qq． com
网络出版时间:2016 － 02 － 23 网络出版地址:http:/ /www． cnki． net /kcms /detail /52． 5012． R． 20160223． 2009． 032． html
幽门螺杆菌(Helicobacter pylori． H． pylori)是革
兰阴性的微需氧细菌，能定植在人胃黏膜表面，可
诱发多种胃部疾病［1］。95 % ～ 100 %的十二指肠
溃疡患者及 80 %的慢性胃炎患者与 H． pylori感染
有密切的关系，其感染程度与症状严重程度成正相
关［2］。在抗 H． pylori 治疗中，由于抗生素的滥用，
耐药问题日益突出［3］，寻找新的治疗药物尤为重
要。苗药头花蓼为贵州特有，研究表明头花蓼对多
种细菌具有良好的抗菌效果［4］。本课题以头花蓼
为研究对象，观察其对 H． pylori生长代谢相关基因
延胡索酸还原酶铁硫亚基(FrdB)、延胡索酸还原
酶黄素蛋白亚基(FrdA)、非血红素铁蛋白(Pfr)及
乙酰脲利用蛋白 A(HyuA)表达水平的影响，观察
苗药头花蓼是否可影响 H． pylori的生长周期，探讨
头花蓼对 H． pylori的抑菌机制。
1 材料与方法
1． 1 主要材料
H． pylori(ATCC700392)国际标准测序株购自
美国菌种保藏中心，哥伦比亚琼脂粉(CM0331B)
和脑心浸液粉(CM0225)购自 OXOID，无菌脱纤维
羊血购于广州蕊特生物科技有限公司。苗药头花
蓼浸膏(13143)由原国家药检局新药审评中心研
究员王子厚教授提供。
1． 2 培养基的制备
1． 2． 1 配制哥伦比亚血琼脂 称取称取哥伦比亚
血琼脂粉 3. 8 g，加入蒸馏水 89 mL，121 ℃高压灭
菌 15 min，待琼脂冷却至 50 ～ 55 ℃时加入无菌脱
纤维羊血 10 mL、混合抗生素溶液(万古霉素
30 mg、多黏菌素 B 20 mg、两性霉素 20 mg 及 TMP
25 mg，混合溶解于无菌双蒸水 100 mL。)1 mL，充
分混匀，倾倒于直径为 90 mm 的无菌平皿中，使琼
脂厚度为 3 ～ 4 mm，随机取一板置于 37 ℃恒温箱
内培养 24 h做无菌试验，其余放入 4 ℃冰箱备用。
1． 2． 2 配制液体培养基 称取脑心浸液粉3. 8 g，
用无菌双蒸水 90 mL 将其溶解，121 ℃高压灭菌
15 min，冷却后加入胎牛血清 10 mL，分装于无菌
离心管中，置于 4 ℃备用。
1． 2． 3 配制含药培养基 称取头花蓼 64 g 于无
菌蒸馏水 100 mL 中，配成浓度为 640 g /L 的头花
蓼溶液。于哥伦比亚血琼脂中加入递减体积的头
花蓼溶液，轻摇混匀，制备成不同浓度的含药培养
基，使其终浓度分别为 64、32、16、8、4、2、1 及
0. 5 g /L。
1． 3 测定头花蓼最小抑菌浓度
采用三气培养箱，微需氧环境(37 ℃、5%
CO2、10% O2、85% N2)培养 H． pylori 48 ～ 72 h，阳
性且无其它菌污染者进行传代增菌，并通过观察其
菌落形态，尿素酶、触酶、氧化酶试验以及革兰染色
进行菌株鉴定［5］;参照 NCCLS标准，采用二倍琼脂
稀释法［6］，刮取培养 48 ～ 72 h 的 H． pylori 接种于
液体培养基中，将其稀释至 1 × 1011 cfu /L，用无菌
棉签蘸取菌液均匀接种于不同终浓度的含药培养
基上，于 37 ℃三气培养箱中微需氧环境中培养
72 h后观察结果，以无 H． pylori 菌生长的最小的头
花蓼药物浓度为最小抑菌浓度(MIC)。
1． 4 绘制 H． pylori生长曲线
取生长于哥伦比亚血琼脂上的 H． pylori 菌接
种于液体培养基，用液体培养基稀释至含菌量为
1011 ～ 1012cfu / L的菌悬液。参照文献［7］方法，取
10 个无菌 24 孔板，每个板设置头花蓼组及对照
组，头花蓼组依次加入液体培养基、5% H． pylori 菌
悬液、相应体积的头花蓼溶液至其终浓度为 MIC，
对照组加入等体积的 5% H． pylori 菌悬液，用液体
培养基定容至 300 μL，每个组设置 3 个重复孔。
瞬时离心混匀后置于 37 ℃微需氧培养箱培养
36 h。以液体培养基调零，每隔 4 h 取出一个 24 孔
板用酶标仪测其各个孔在 590 nm 处的吸光度值。
根据 3 次重复实验数据求得 OD590平均值，绘制
H. pylori的生长曲线。
1． 5 检测生长代谢相关基因 mRNA
采用 Trizol 法分别提取头花蓼组及对照组
H. pylori的 mRNA，用酶标仪对提取的 mRNA 进行
测定，计算 OD260 /OD280比值和 mRNA 浓度。将
mRNA反转录为 cDNA，将 gryB 设为内参基因，Fr-
dA、FrdB、HyuA、Pfr 为目的基因。探针和序列由
NCBI检索，根据 GenBank 上已发表的序列，采用
primer 5 设计引物(表 1)。反应条件为 95 ℃ 30 s，
95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，重复 40 个循环，每组做 3 个
生物重复。采用 2 － ΔΔCT 法，对目标基因的表达
差异进行分析。
1． 6 统计学方法
应用 SPSS 17． 5 软件对相关数据进行统计学
分析，组间比较用 q 检验，P ＜ 0. 05 为差异有统计
学意义。
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贵 阳 医 学 院 学 报 41 卷
表 1 PCR的引物信息
Tab． 1 Primer information of PCR
基因名称 基因号 引物(5 － 3) 片段长度(bp)
FrdA AAC46064 GGTCAGAGACCAGCAGTCCCTAAGT CCAGTCTCTGGTCGTCAGGGATTCA 165
FrdB AAC46065 GATCAATAGATGCGCAGATCATTTACATT CTAGTTATCTACGCGTCTAGTAAATGTAA 184
Pfr AFV41874． 1 TAGGTCAGAGACCAGCAGTCCCTAAGTAGCC ATCCATTCTCTGGTCGTCAGGGATTCATCGG 195
HyuA AFV41913． 1 GATCAATAGATCCCCGGATCATTTACATT CTAGTTATCTAGGGGCCTAGTAAATGTAA 153
gryB AB084049． 1 CCCTAACGAAGCCAAAATCA GCACTATCGCCCTCCACTAA 192
2 结果
2． 1 H． pylori生长曲线
头花蓼组 H． pylori生长曲线有明显变化，细菌
在对数期不能进入正常的生长高峰。头花蓼组的
生长曲线位于对照组之下，表明头花蓼对 H． pylori
的生长有抑制作用，且主要抑制其对数生长期的细
菌分裂。见图 1。
图 1 头花蓼对 H． pylori生长的影响
Fig． 1 Effect of Polygonum capitatum
on the growth curve of H． pylori
2． 2 mRNA的提取
提取的 H． pylori RNA 电泳图谱显示 16sRNA，
23sRNA条带较清晰，亮度为 1∶ 2，且 OD260 /OD280的
比率均在 1. 8 ～ 2. 0，表明提取的 mRNA 完整且无
DNA与蛋白污染。
2． 3 H． pylori生长代谢相关基因检测
荧光定量 PCR 仪检测头花蓼组及对照组中
H． pylori 生长代谢相关基因 FrdA、FrdB、HyuA、Pfr
及内参基因 gryB的荧光信号 Ct值，通过融解曲线
分析，结果显示 FrdA、FrdB、HyuA 及 Pfr 的溶点温
度分别为 81. 5 ℃、82. 5 ℃、80. 0 ℃及 80. 5 ℃，融
解曲线均为单峰，表明 PCR扩增为特异性扩增，头
花蓼组 H． pylori 生长代谢相关基因 FrdA、FrdB、
HyuA、Pfr 的 mRNA 表达均低于对照组，差异具有
统计学意义(P ＜ 0. 05)。见图 2。
图 2 头花蓼组和对照组 H． pylori生长代谢相关
基因 FrdB、FrdA、HyuA及 Pfr表达
Fig． 2 The expression of FrdB，FrdA，HyuA and Pfr
gene in the control group and experiment group
3 讨论
目前 H． pylori对抗生素的耐药性日趋严重，探
索新的理想的抗 H． pylori 药物具有重要的现实意
义。头花蓼是一种传统苗药，含有没食子酸、原儿
茶酸乙酯、没食子酸乙酯等 11 个化合物［8］，本课题
组前期研究发现，头花蓼具有抗炎抗菌的效果，但
其相关机制尚不清楚。本试验证明，头花蓼对
H． pylori标准株的 MIC 为 4 mg /L，通过与其它抗
H． pylori 中药进行比较，H． pylori 对头花蓼的敏感
性明显高于其它中药(黄芩苷 25 ～ 200 mg /mL;黄
连素 12. 5 mg /mL)［9］，表明头花蓼在抗 H． pylori方
面具有应用研究价值。生长曲线可反映微生物的
群体生长规律［10］，通过生长曲线的变化可揭示药
物的抑菌效果，本研究发现，加入头花蓼后 H． pylo-
ri生长曲线发生了变化，说明头花蓼中可能某些成
份不利于 H． pylori生长。
延胡索酸还原酶(FRD)是可将延胡索酸盐转
为琥珀盐酸的一种酶，是重要的微生物代谢为无氧
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2 期 任艳君等 头花蓼对幽门螺杆菌生长及代谢相关基因的影响
呼吸的一部分，为 H． pylori 的无氧呼吸提供能量
ATP，革兰阴性菌及多数兼性厌氧革兰阳性菌，都
具有这种特性。这种酶含有四个亚基:FrdA、FrdB
、FrdC、FrdD，其中亲水性的 FrdA 和 FrdB 亚基形
成酶催化域，参与能量代谢。本实验中，药物作用
后的 FrdA、FrdB基因表达均下调，该结果与国外学
者 Haraguchi等［11］研究一致，再次验证头花蓼通过
影响 H． pylori的呼吸链而阻止细菌的能量代谢，抑
制细菌的生长。此外，非血红素铁蛋白(Pfr)［12］、
乙酰脲利用蛋白 A(HyuA)在细菌的能量代谢中也
有重要作用。Pfr 是一类不含血红素但含铁的蛋
白，保证 H． pylori 在缺乏铁离子的恶劣环境中，维
持 H． pylori 的氧化还原代谢和能量代谢。本研究
结果显示，头花蓼作用 H． pylori后，Pfr 基因表达量
下调，提示头花蓼可通过影响 H． pylori 对铁的利
用，干扰 H． pylori 的氧化还原代谢和能量代谢功
能，从而抑制了 H． pylori 的生长;HyuA 可水解焦谷
氨酸，而亮氨酰胺肽酶(LAP)则由于变构作用，具
有广泛的底物特异性，可水解多种氨基酸。这两种
蛋白酶可确保足够的氨基酸从多肽中释放。有文
献显示，抑氨肽酶素 b 可通过抑制 LAP 的活性抑
制 H． pylori的生长［13］。本研究显示，H． pylori 经头
花蓼作用后，HyuA基因表达量下调，提示了头花蓼
通过影响 H． pylori氨基酸的代谢，影响了其生长代
谢过程。
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(2015－08－22 收稿，2015－12－31 修回)
中文编辑:戚 璐;英文编辑:赵
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殺
殺殺
殺
毅
关于医学符号的使用
统计学符号不论用哪种字母，也不论大写或小写一律都用斜体。要注意区分拉丁字母和希腊字母。例如均
数的符号是字母 x2，卡方的符号是希腊字母 χ2，自由度的符号是希腊文“υ”，不是拉丁文“V”。样本的相关系数
是英文“r”，不能误为希腊文“γ”。
化学元素及核素在医学写作时一般多采用符号，都是拉丁字母正体大写。离子态是在右上角用数字加
“－”或“+”表示。例如 Na +，Ca2 +，P3 －等等，不采用 Ca + +，P － － －，Al +3，O －2表示;核素的核子素(质量数)应写
在元素符号的左上角，例如:131 I，32P;表示激发状态的 m 写在右上角，例如:99 Tcm，133 Inm。在科技论文和专著中
不应写核素的中文名称，即不能写成131碘、铟133m、P32、Tc99m。
近几年分子生物学发展很快，并已渗透到许多学科，大多数分子生物学名词术语的符号已有统一的确定形
式，要对符号的来源及其内涵有深刻的了解，才能在使用时不致发生错误，例如:RNA有 rRNA(ribosomal RNA)、
tRNS(transfer RNA)、mRNA(messenger RNA)3 类。r、t、m是表示类型的符号应小写，RNA应大写。
《贵阳医学院学报》编辑部
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