全 文 ：　　文章编号：０４２７－７１０４（２０１４）０４－０５４３－０７
收稿日期：２０１４－０３－２７
资助项目：国家自然科学基金（４１０６１００７，３１１６００４６）资助项目
作者简介：许　汀（１９８８—），女，硕士研究生；张文驹，男，副教授，博士生导师，通讯联系人，Ｅ－ｍａｉｌ：ｗｊｚｈａｎｇ＠ｆｕｄａｎ．
ｅｄｕ．ｃｎ．
基于５’锚定ＰＣＲ法和磁珠富集法的西藏沙棘
多态性ＳＳＲ引物开发
许　汀１，许　璐２，王　昊１，拉　琼３，孙　坤２，张文驹１
（１．复旦大学 生命科学学院 生物多样性科学研究所 生物多样性与生态工程教育部重点实验室，上海２００４３３；
２．西北师范大学 生命科学学院，兰州７３００７０；３．西藏大学 生命科学系 生物多样性研究所，拉萨８５００００）
摘　要：简单序列重复（ＳＳＲ）是共显性遗传标记，可有效地反映个体遗传信息和亲缘关系，在杂交检测、物种鉴
定及种群遗传学研究等方面应用广泛．作为重要的经济植物，西藏沙棘是青藏高原植物生态适应与进化研究的
极佳材料，但目前还缺乏对其种质资源和遗传结构的了解．利用５’锚定ＰＣＲ方法和磁珠富集法开发西藏沙棘的
ＳＳＲ引物．共得到１３个种内多态性的ＳＳＲ位点，分别有２～４个等位基因，观测杂合度（ＨＯ）从０．００到０．７４不
等，预期杂合度（ＨＥ）从０．０４到０．５４不等．两种方法所得到的引物可用于西藏沙棘的种质资源鉴定、遗传结构
研究等多个方面．
关键词：西藏沙棘；简单重复序列；磁珠富集法；５’锚定ＰＣＲ
中图分类号：Ｑ　９４８　　　　　　　　文献标志码：Ａ
西藏沙棘（Ｈｉｐｐｏｐｈａｅ　ｔｉｂｅｔａｎａ　Ｓｃｈｌｅｃｈｔ）是青藏高原特有的一种胡颓子科（Ｅｌａｅａｇｎａｃｅａｅ）植物，分布
于海拔２　８００～５　２００ｍ之间的河谷、草滩［１］．西藏沙棘具有良好的经济、生态价值，其果实有着悠久的药用
历史［２］，而且是类胡萝卜素、维生素Ｅ、维生素Ｃ、有机酸和多酚等活性成分的极佳来源［３］；西藏沙棘多生
长于高寒多风、高海拔的严酷生境条件下，在高原地区，可以替代由于草场退化而形成规模的灌丛经济林、饲料
林．西藏沙棘也是研究极端生境下植物进化的理想的实验材料，对其遗传多样性的研究能反映出青藏高原历史
上的地质、气候变化对植物遗传分化及多样性的影响［４］．然而，西藏沙棘的种质资源本底并未查清，对其种群遗
传结构、基因流和交配系统等方面的了解也十分有限，而对这些方面的研究都有赖于有效的分子标记．
简单序列重复（Ｓｉｍｐｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｒｅｐｅａｔ，ＳＳＲ），又称微卫星标记（Ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｉｔｅ　Ｍａｒｋｅｒｓ），以其共显
性、变异快、易于检测等特征，在植物种质资源开发、遗传结构分析、遗传图谱构建等方面被广泛应用［５－７］．
在沙棘属中，目前仅有针对鼠李沙棘（Ｈ．ｒｈａｍｎｏｉｄｅｓ　Ｌ．）的ＳＳＲ引物筛选和开发，这些引物在西藏沙棘
中并未检测到多态性［８－１１］，而西藏沙棘和其他几个物种的ＳＳＲ标记的开发均未见相关的报道．ＳＳＲ分子
标记的获得主要受限于ＳＳＲ位点及其旁侧特异引物区的分离．ＳＳＲ位点的分离主要有两种途径：一是从
现有的核苷酸序列数据库中检索含ＳＳＲ的位点［１２－１３］，但这种途径仅限于已有序列数据发布的物种；二是
用经典的分子生物学方法构建含有ＳＳＲ位点的文库，筛选出含有微卫星序列的阳性克隆［１４］．第二种途径
中，目前常用的ＳＳＲ位点分离方法有：５’锚定ＰＣＲ法，将ＳＳＲ作为引物的一部分，利用一半是简并碱基、
一半是特异性ＳＳＲ序列的引物扩增相应的ＳＳＲ位点及其一侧或两侧的保守序列［１５］；磁珠富集法，将含有
特定ＳＳＲ序列的寡核苷酸作为探针，利用有生物素标记的ＳＳＲ探针与基因组文库杂交，用包裹有链霉亲
和素的磁珠捕捉ＳＳＲ片段［１６］．为高效获得适合西藏沙棘这一物种的ＳＳＲ引物，本研究同时采用这两种方
法进行ＳＳＲ位点文库的构建，设计引物并对位点的种内多态性进行检验，以获得能直接应用于西藏沙棘
的种质资源鉴定和遗传结构研究的ＳＳＲ引物．
第５３卷　第４期
２０１４年８月
复 旦 学 报 （自然科学版）
Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｆｕｄａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ）
Ｖｏｌ．５３Ｎｏ．４
Ａｕｇ．２０１４
１　材料与方法
１．１　材料
我们选择了位于西藏尼木（９０°１２．４１１′Ｅ　２９°１６．１９０′Ｎ），墨竹工卡（９２°１４．８８４′Ｅ　２９°４１．５７９′Ｎ），嘉黎
（９２°３０．３９７′Ｅ　３０°０５．０２３′Ｎ），双湖（８８°４７．４０８′Ｅ　３３°０７．３３３′Ｎ）和定日（８６°５０′２３″Ｅ　２８°１０′０３″Ｎ）等地的５
个西藏沙棘居群，共２５个个体，用于该种ＳＳＲ引物开发及多态性检验．采用改良的ＣＴＡＢ法［１７］提取基因
组总ＤＮＡ．所有２５个样品的ＤＮＡ各取５μＬ混合，用于ＳＳＲ文库的构建．
１．２　ＳＳＲ文库的构建
１．２．１　５’锚定ＰＣＲ法
根据Ｆｉｓｈｅｒ等［１５］开发的５’锚定ＰＣＲ方法，分别使用引物（ＰＣＴ１）ＫＫＹＨＹＨＹ（ＧＡ）１５，（ＰＣＴ２）
ＫＫＶＲＶＲＶ（ＣＴ）１５和（ＰＣＴ４）ＫＫＶＲＶＲＶ（ＣＴ）６ 对西藏沙棘基因组ＤＮＡ进行扩增．反应体系：总体积
２５μＬ，包含基因组ＤＮＡ　３０ｎｇ，引物０．５μｍｏｌ，Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ　１０ｍｍｏｌ／Ｌ，ＫＣｌ　５０ｍｍｏｌ／Ｌ，ｄＮＴＰ每种各
２００μｍｏｌ／Ｌ，ＭｇＣｌ２１．５ｍｍｏｌ／Ｌ，以及Ｔａｑ酶３．０Ｕ（上海博彩生物科技有限公司）．ＰＣＲ反应在２　７２０
Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ扩增仪（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上进行，程序为：９４℃预变性３ｍｉｎ，接下来是３５个循环的
９３℃变性３０ｓ，５９℃退火３０ｓ，７２℃延伸３０ｓ，最后是７２℃延伸２ｍｉｎ．此外，由于有的ＳＳＲ序列内部还
有嵌套的ＳＳＲ位点，还使用了引物 （ＧＡ）８ＹＴ，（ＣＴＣ）６，（ＧＡ）８Ｃ和（ＡＧ）８Ｔ进行扩增．反应体系：总体积
２５μＬ，包含基因组ＤＮＡ　５０ｎｇ，引物０．４μｍｏｌ，Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ　１０ｍｍｏｌ／Ｌ，ＫＣｌ　５０ｍｍｏｌ／Ｌ，ｄＮＴＰ每种各
２００μｍｏｌ／Ｌ，ＭｇＣｌ２２．５ｍｍｏｌ／Ｌ，以及Ｔａｑ聚合酶１．０Ｕ．反应程序为：９４℃预变性４ｍｉｎ，接下来是３５
个循环的９４℃变性４５ｓ，退火温度４５ｓ（前三个引物５１．３℃，最后一个５２．８℃），７２℃延伸９０ｓ，最后是
７２℃延伸８ｍｉｎ．
１．２．２　磁珠富集法
混合的基因组ＤＮＡ用限制性内切酶ＲｓａⅠ和ＸｍｎⅠ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）在３７℃酶切２ｈ，酶切
后６５℃１５～３０ｍｉｎ失活，１．５％的琼脂糖凝胶电泳检测．采用Ｓｕｐｅｒ　ＳＮＸ２４接头（Ｓｕｐｅｒ　ＳＮＸ２４Ｆ：５’－
ＧＴＴＡＡＧＧＣＣＴＡＧＣＴＡＧＣＴＡＧＣＡＧＡＡＴＣ－３’；Ｓｕｐｅｒ　ＳＮＸ２４Ｒ：５’－ｐＧＡＴＴＣＴＧＣＴＡＧＣＴＡＧＧＣＣＴ－
ＴＡＡＣＡＡＡＡ－３’）建立３０μＬ的连接体系，用Ｔ４ｌｉｇａｓｅ（ＴａＫａＲａ）将ＤＮＡ酶切产物与接头连接
［１８］．用连
有接头的ＤＮＡ片段作为模板，Ｓｕｐｅｒ　ＳＮＸ２４Ｆ作为引物进行扩增，将连接产物进行预扩增，反应程序为：
７２℃２ｍｉｎ，９５℃２ｍｉｎ，接下来是２５个循环的９５℃变性２０ｓ，６０℃退火２０ｓ，７２℃延伸６０ｓ，最后是
１５℃延伸１０ｍｉｎ．将产物在１．０％的琼脂糖凝胶上电泳，割胶回收３００ｂｐ以上的片段．
将回收后的扩增产物与５’端有链霉亲和素标记的探针（Ｂｉｏｔｉｎ－（ＡＧＧ）６、Ｂｉｏｔｉｎ－（ＡＡＧ）８、Ｂｉｏｔｉｎ－
（ＡＴＣ）６、Ｂｉｏｔｉｎ－（ＣＣＧ）６ 和 Ｂｉｏｔｉｎ－（ＣＴ）１３）杂交．杂交体系为：杂交缓冲液（６×ＳＳＣ＋０．１％×ＳＤＳ）
３４μＬ，探针２μＬ，扩增产物１５μＬ．杂交程序为：９５℃变性５ｍｉｎ；７０℃５ｓ，以０．２℃为梯度降温，每个梯
度保持５ｓ；５０℃１０ｍｉｎ，以０．５℃为梯度降温，每个梯度保持５ｓ，一直降到４０℃；１５℃保持１０ｍｉｎ，４℃
保存备用．
杂交结束后用磁珠（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ　Ｄｙｎａｌ　ＡＳ）富集捕获探针－目的片段复合体．取５０μＬ磁珠，用２５０μＬ　１
×ＴＥ和５０μＬ杂交缓冲液分别洗涤２次后，加入１５０μＬ杂交缓冲液混匀，获得平衡好的体系．将杂交产
物加入体系，室温下以１５０ｒ／ｍｉｎ的速度振摇１ｈ，通过磁珠吸附含ＳＳＲ序列的片段．以所获单链ＤＮＡ为
模板，Ｓｕｐｅｒ　ＳＮＸ２４Ｆ作为引物进行ＰＣＲ扩增．
１．２．３　ＳＳＲ序列克隆与测序
将１．２．１和１．２．２中所得的ＰＣＲ产物经１．２％琼脂糖凝胶电泳检测，将得到的清晰条带割胶回收．回
收的ＤＮＡ片段连接到ｐＭＤ１８－Ｔ载体（ＴａＫａＲａ），并转化到Ｅ．ｃｏｌｉ　ＤＨ５ａ感受态细胞（天根生化科技有
限公司），在含１０μｇ／ｍＬ氨苄青霉素（Ａｍｐｌｉｃｉｌｉｎ）的选择性ＬＢ培养基上培养，构建成西藏沙棘的ＳＳＲ文
库．挑出部分培养基上长出的生长良好的单菌落，接种于含５μｇ／ｍＬ氨苄青霉素的ＬＢ液体培养基中培
养．取１μＬ菌液用通用引物 Ｍ１３（Ｍ１３Ｆ４７：５’－ＣＧＣＣＡＧＧＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣ－３’；Ｍ１３Ｆ４８：５’－
ＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡ－３’）进行ＰＣＲ扩增以检测阳性克隆．程序为：９４℃５ｍｉｎ，然后
４４５ 复 旦 学 报（自然科学版）　 　 第５３卷
是３５个循环的９４℃变性３０ｓ，５５℃退火３０ｓ，７２℃延伸１ｍｉｎ，最后７２℃延伸５ｍｉｎ．将产物在１％的
琼脂糖凝胶上电泳检测，选择插入片段长度为３００～９００ｂｐ的克隆送上海桑尼生物科技有限公司测序．
１．３　ＳＳＲ位点的搜索与引物设计
将得到的序列中ｐＭＤ１８－Ｔ载体和接头的部分剔除，然后分别进行ＢＬＡＳＴ，检验序列之间的同源性，
区分含有ＳＳＲ位点的不同序列，同时确认之前的研究中未测序得到过．用软件Ｐｒｉｍｅｒ　Ｐｒｅｍｉｅｒ　５．０ ［１９］针
对其中的ＳＳＲ位点设计相应的ＰＣＲ引物．
１．４　ＳＳＲ引物的检测
合成所设计的ＰＣＲ引物，首先对每个引物设置一定的退火温度的梯度，通过梯度ＰＣＲ扩增确定能得
到最清晰条带的退火温度．反应体系：总体积２０μＬ，包含基因组 ＤＮＡ　５０ｎｇ，正向和反向引物各
０．５μｍｏｌ，Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ　１０ｍｍｏｌ／Ｌ，ＫＣｌ　５０ｍｍｏｌ／Ｌ，ｄＮＴＰ每种各２００μｍｏｌ／Ｌ，ＭｇＣｌ２１．５ｍｍｏｌ／Ｌ，以及
Ｔａｑ酶１．５Ｕ．反应程序为：９４℃预变性５ｍｉｎ，接下来是３５个循环的９４℃变性３０ｓ，退火温度３０ｓ，
７２℃延伸３０ｓ，最后是７２℃延伸５ｍｉｎ．ＰＣＲ产物经含７．５ｍｏｌ／Ｌ尿素的６％聚丙烯酰胺凝胶电泳，分子
量标记为ＰＵＣ１９／ＭｓｐⅠ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ），用银染法［２０］检验条带．对于含有重复片段的引物，将
显色的条带割下，分别用１００μＬ　ＭｉｌｉＱ水，１００℃沸水浴５ｍｉｎ将ＤＮＡ溶解出来．将分离出来的ＤＮＡ再
用相应的引物扩增一次，然后克隆并测序．比对测序结果与原始的设计引物的序列，检查是否为同源的等
位基因．
对于能够扩增出明确条带的引物，观测其在西藏沙棘个体中的多态性．对于存在种内多态性的位点，
用软件ＰＯＰＧＥＮＥ　３２［２１］计算相关的群体遗传学数据．
２　结　果
通过５’锚定ＰＣＲ法富集的片段经测序得到３４条特异的序列，都含有两端的ＳＳＲ位点，其中１４条含
有内部ＳＳＲ位点．根据序列设计引物，得到６对在西藏沙棘种内稳定扩增并具有多态性的ＳＳＲ引物．通过
磁珠富集法获得的片段经测序共得到８７条特异的序列，其中２３个含有ＳＳＲ位点．根据序列设计引物，得
到７对在西藏沙棘中稳定扩增并具有多态性的ＳＳＲ引物．所有序列经ＢＬＡＳＴ证实之前未被测序过．全部
１３对引物序列、ＧｅｎＢａｎｋ序列号、退火温度等属性见表１．这些位点的观测杂合度（ＨＯ）从０．００到０．７４不
等，预期杂合度（ＨＥ）从０．０４到０．５４不等．其中５个位点显著地偏离了 Ｈａｒｄｙ－Ｗｅｉｎｂｅｒｇ平衡（Ｐ＜０．
０１）．
表１　西藏沙棘多态性微卫星位点特征
Ｔａｂ．１　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ　ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｉｔｅ　ｌｏｃｉ　ｆｏｒ　Ｈｉｐｐｏｐｈａｅ　ｔｉｂｅｔａｎａ
方法 位点
ＧｅｎＢａｎｋ
序列号
重复序列 引物序列 （５′－３′） ＴＡ（℃）
片段大小
（ｂｐ）
ＮＡ ＨＯ／ＨＥ
５’锚定
ＰＣＲ法
ＨＴＰ－０２ ＥＵ４２９３０８ （ＧＡ）１９ Ｆ：ＴＣＴＴＧＡＡＴＧＧＧＧＴＡＧＣＡＡＴＡＧ
ＴＴＴＴＣ
Ｒ：ＧＧＧＧＧＧＧＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣ
５１　 １６５～１７５　 ３　 ０．００００／０．５４１　１＊
ＨＴＰ－０６ ＥＵ４２９３１０ （Ａ）６（ＣＡＡＡＣＡ）３ Ｆ：ＣＡＡＴＴＧＴＴＣＡＡＴＡＣＴＡＡＡＴＧ
Ｒ：ＡＴＣＣＴＡＡＴＣＡＡＡＡＧＡＡＡＴＣ
４２　 １１３～１２５　 ３　 ０．７３９　１／０．５１６　９
ＨＴＰ－０７ ＥＵ４２９３１１ （ＣＴ）１５ Ｆ：ＧＧＧＧＧＧＧＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣ
Ｒ：ＴＣＴＴＧＣＴＧＴＧＧＧＴＡＡＴＧＧＧＴ
５５　 ９０～１０５ ２
０．００００／０．５１０　１＊
ＨＴＰ－１８ ＥＵ４２９３１４ （ＧＡ）６…（ＧＡ）８ Ｆ：ＡＣＧＧＧＡＧＡＡＡＡＡＧＡＡＴＧＡＡ
ＴＡＡ
Ｒ：ＴＣＴＴＣＴＧＴＣＴＣＴＴＧＣＴＴＡＣＴ
４７　 １１０～１２０　 ２　 ０．２１７　４／０．１９８　１
ＨＴＰ－２６ ＥＵ４２９３１６ （ＧＡＡ）３…（ＴＧＴＡ）３ Ｆ：ＡＧＡＧＡＧＡＧＡＣＴＧＡＴＴＧＡ
Ｒ：ＡＡＡＡＴＡＡＴＡＧＣＧＴＧＧＧＡＧＡＡ
４８　 １９０～２２７
２
０．００００／０．４８７　０＊
ＨＴＰ－３３ ＥＵ４２９３１８ （ＧＡＡＴＧＴ）３ Ｆ：ＣＣＡＴＣＣＡＣＡＴＴＣＣＴＣＴＴＣＡＡ
Ｒ：ＧＴＣＡＴＴＡＣＣＣＡＣＣＴＴＣＡＣＡＴ
４５　 １２０～１３８　 ４　 ０．４７８　３／０．３９７　１
　　
５４５
　第４期
许　汀等：基于５’锚定ＰＣＲ法和磁珠富集法的西藏沙棘多态性ＳＳＲ引物开发
（续表）
方法 位点
ＧｅｎＢａｎｋ
序列号
重复序列 引物序列 （５′－３′） ＴＡ（℃）
片段大小
（ｂｐ）
ＮＡ ＨＯ／ＨＥ
磁珠富
集法
ＨＴＰ－３４ ＫＪ６０６９１７ （ＧＡＴ）４（ＧＡＡ）６ Ｆ：ＴＣＣＡＡＴＡＣＴＣＴＴＡＧＴＴＣＴＴ
Ｒ：ＡＴＴＴＡＡＣＴＴＧＴＧＣＴＴＣＴＣ
４５
１１９～１２２
２　 ０．１６６　７／０．２８３　７
ＨＴＰ－３５ ＫＪ６０６９１８ （ＡＧ）１０ Ｆ：ＣＡＡＧＧＡＣＡＡＣＡＡＡＧＡＣＡ
Ｒ：ＴＧＧＡＴＴＡＡＴＧＧＡＧＡＡＡＧ
４２　 １３４～１３６　 ２　 ０．５００　０／０．４２２　０
ＨＴＰ－３６ ＫＪ６０６９１９ （ＧＡ）６ Ｆ：ＡＴＣＡＣＣＡＧＣＧＡＣＡＡＡＧＧ
Ｒ：ＣＡＧＡＡＴＣＣＧＣＡＣＡＡＣＡ
５０　 ２０４～２１６　 ４　 ０．４１６　７／０．３５１　１
ＨＴＰ－３７ ＫＪ６０６９２０ （ＣＴＴ）４（ＣＣＡ）４ Ｆ：ＴＣＧＴＴＴＣＣＡＣＴＴＡＣＣＣＴ
Ｒ：ＣＡＡＡＴＴＡＧＣＡＡＡＴＡＡＣＴＧＡＣ
４５　 ２３１～２３４　 ２　 ０．１７３　９／０．４８７　０＊
ＨＴＰ－３８ ＫＪ６０６９２１ （ＧＡ）１８ Ｆ：ＧＣＣＡＡＡＴＡＡＡＣＧＡＴＧＴ
Ｒ：ＡＴＡＧＴＡＣＣＡＡＣＣＣＴＡＡＴ
４５　 １３０～１４２　 ４　 ０．２９１　７／０．３２４　５
ＨＴＰ－３９ ＫＪ６０６９２２ （ＴＣ）１４ Ｆ：ＡＣＡＧＴＡＡＴＣＴＣＧＣＴＣＣＴ
Ｒ：ＴＴＣＡＡＴＣＣＡＣＡＴＴＣＧＴＴ
４５　 ９４～９８
３
０．１７３　９／０．５３７　２＊
ＨＴＰ－４０
ＫＪ６０６９２３
（ＣＴ）６ Ｆ：ＣＴＣＴＴＣＣＡＴＧＴＧＧＴＡＧＴＡ
Ｒ：ＴＣＣＡＴＣＡＣＣＣＴＴＴＴＣＴＡ
４８　 １３５～１３７　 ２　 ０．０４３　５／０．０４３　５
　　注：＊ 显著偏离 Ｈａｒｄｙ－Ｗｅｉｎｂｅｒｇ平衡（Ｐ＜０．０１）；ＴＡ，退火温度；ＮＡ，等位基因数；ＨＯ，观测杂合度；ＨＥ，期望杂合度．
通过５’锚定ＰＣＲ法获得的ＳＳＲ序列ＨＴＰ－０７（ＧｅｎＢａｎｋ序列号ＥＵ４２９３１１）中含有１５个连续的ＣＴ；
通过磁珠富集法获得的ＳＳＲ序列 ＨＴＰ－３４（ＧｅｎＢａｎｋ序列号 ＫＪ６０６９１７）中含有（ＧＡＴ）４（ＧＡＡ）６ 特征核
苷酸对（图１）．通过５’锚定ＰＣＲ法开发的引物ＨＴＰ－３３和通过磁珠富集法开发的引物 ＨＴＰ－３７在西藏沙
棘个体中的扩增结果见图２，从中可以看出这些位点在西藏沙棘中能够稳定扩增，并具有较高的多态性．
图１　５’锚定ＰＣＲ法（ａ）和磁珠富集法（ｂ）分离的ＳＳＲ位点部分测序峰图（重复序列用黑框标示出）（彩图见封３）
Ｆｉｇ．１　Ｐａｒｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍｓ　ｏｆ　ＳＳＲ　ｌｏｃｉ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｕｓｉｎｇ　５’ａｎｃｈｏｒｅｄ　ＰＣＲ　ｍｅｔｈｏｄｓ
（ａ）ａｎｄ　ｍａｇｎｅｔｉｃ　ｂｅａｄｓ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（ｂ）（ｒｅｐｅａｔ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ａｒｅ　ｍａｒｋｅｄ　ｕｓｉｎｇ　ｂｌａｃｋ　ｂｏｘｅｓ）
３　讨　论
３．１　５’锚定ＰＣＲ法和磁珠富集法的比较
本实验用５’锚定ＰＣＲ和磁珠富集两种方法构建西藏沙棘ＳＳＲ文库，共开发了１３对在西藏沙棘中具
有多态性的ＳＳＲ引物．就方法的实用性而言，５’锚定ＰＣＲ方法在建立文库步骤比磁珠富集法简便．但由
６４５ 复 旦 学 报（自然科学版）　 　 第５３卷
图２　部分ＳＳＲ引物扩增西藏沙棘个体的聚丙烯酰胺凝胶电泳图
Ｆｉｇ．２　ＳＤＳ－ＰＡＧＥ　ｏｆ　ｅｘａｍｉｎｅｄ　Ｈｉｐｐｏｐｈａｅ　ｔｉｂｅｔａｎａｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｂｙ　ｔｈｅ　ＳＳＲ　ｐｒｉｍｅｒｓ
（ａ）用５’锚定ＰＣＲ法开发的引物．Ｍ：分子量标记；１～２３：西藏沙棘个体；（ｂ）用磁珠富集法开发的引物．Ｍ：分子量标
记；１～２３：西藏沙棘个体
于这类方法得到的ＳＳＲ位于序列两端，不利于设计引物，有时一端引物只能直接设计在重复序列上（如
ＨＴＰ－０２，ＨＴＰ－０７等），容易发生错配；只有小部分序列同时还含有内部ＳＳＲ位点，能够在其内部ＳＳＲ两
侧的特异序列设计特异性高的引物．因此，要得到一定数量的高特异性引物，必须扩大筛选的规模以发现
更多含有内部ＳＳＲ的位点，无疑增加了工作量．相比之下，磁珠富集法虽然过程相对复杂，但容易获得内
部ＳＳＲ位点及其旁侧的特异性序列，便于设计引物．
就所得ＳＳＲ位点的类型来看，由于磁珠富集法中特异性探针对重复序列的捕获，所得的类型较为单
一，所有７个位点均为二碱基和三碱基的重复．其中５个只含一种二或三碱基的重复基元，被认为是理想
的位点［２２］．相比之下，５’锚定ＰＣＲ方法获得的位点类型更为丰富，重复基元从２到６个碱基不等，有３个
是混合型的重复（含有两种或以上不同的基元）．尽管这种方法得到的“理想”位点比例较低，但能获不同的
ＳＳＲ类型，提供更多的选择．５’锚定ＰＣＲ法和磁珠富集法获得的位点类型的差异同样出现在对背瘤丽蚌
（Ｌａｍｐｒｏｔｕｌａ　ｌｅａｉ）的ＳＳＲ引物开发中［２３］，表明这种差异并不是特例．值得注意的是，对每种方法构建的
文库分别进行测序时，都得到一些完全相同的序列，而两种方法获得的序列却没有交集．因此在开发ＳＳＲ
引物中，不妨尝试使用不同的方法以获得更多、更全的位点．
３．２　导致偏离Ｈａｒｄｙ－Ｗｅｉｎｂｅｒｇ平衡的可能因素
本研究所得到的１３个多态性位点中，有５个显著地偏离了 Ｈａｒｄｙ－Ｗｅｉｎｂｅｒｇ平衡．由于对很可能扩
增出条带为非等位基因的位点进行过测序，因此保留下的都是确证为真实的ＳＳＲ位点，并不存在非等位
基因造成的杂合的假象．事实上，所取样的个体来自多个不同的居群，西藏沙棘在地理上是明显间断分布
的，导致居群之间的基因交流被阻断，因此它们不能构成一个自由交配的群体；此外，由于受到高原上频繁
的环境变化的影响，西藏沙棘历史上很可能经历过多次种群收缩和扩张［２４］，这些样品并不是来自一个无
限大和稳定的群体．这些情况并不满足 Ｈａｒｄｙ－Ｗｅｉｎｂｅｒｇ平衡的假设前提，因此应该是检测到偏离Ｈａｒｄｙ－
Ｗｅｉｎｂｅｒｇ平衡的主要原因．
本研究首次报道了西藏沙棘的ＳＳＲ引物开发，共得到了１３个具有种内多态性的位点．这些引物可用
于西藏沙棘的种质资源鉴定、杂交检测和遗传结构研究等多个方面．鉴于ＳＳＲ引物在属内具有一定的通
用性［９，１０］，在研究沙棘属其他物种的遗传多样性时，这些多态性引物可以作为分子标记筛选的优先选择．
参考文献：
［１］　陈学林，马瑞君，孙　坤，等．中国沙棘属种质资源及其生境类型的研究［Ｊ］．西北植物学报，２００３，２３（３）：
７４５
　第４期
许　汀等：基于５’锚定ＰＣＲ法和磁珠富集法的西藏沙棘多态性ＳＳＲ引物开发
４５１－４５５．
［２］　Ｙａｎｇ　Ｂ，Ｋａｌｉｏ　Ｈ　Ｐ．Ｆａｔｔｙ　ａｃｉｄ　ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ｌｉｐｉｄｓ　ｉｎ　ｓｅａ　ｂｕｃｋｔｈｏｒｎ（ＨｉｐｐｏｐｈａＲｈａｍｎｏｉｄｅｓ　Ｌ．）
ｂｅｒｒｉｅｓ　ｏｆ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｏｒｉｇｉｎｓ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　ａｎｄ　Ｆｏｏｄ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００１，４９（４）：１９３９－１９４７．
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ｗｉｔｈｉｎ　ｔｈｅ　ｃａｒｄｉａｃ　ｍｕｓｃｌｅ　ａｃｔｉｎ　ｇｅｎｅ［Ｊ］．Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１９８９，４４（３）：３９７－４０１．
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ｓｅａｂｕｃｋｔｈｏｒｎ（Ｈｉｐｐｏｐｈａｅ　ｒｈａｍｎｏｉｄｅｓ　Ｌ．）ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ［Ｊ］．Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ
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ｓｉｎｅｎｓｉｓ（Ｅｌａｅａｇｎａｃｅａｅ）［Ｊ］．Ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００８，９（４）：９６９－９７１．
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ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ＥＳＴ－ＳＳＲＳ　ａｎｄ　ｇｅｎｏｍｉｃ　ＳＳＲＳ［Ｊ］．Ｅｕｐｈｙｔｉｃａ，２００１，１１９（１／２）：３９－４３．
［１３］　Ｇｕｐｔａ　Ｐ　Ｋ，Ｒｕｓｔｇｉ　Ｓ，Ｓｈａｒｍａ　Ｓ，ｅｔ　ａｌ．Ｔｒａｎｓｆｅｒａｂｌｅ　ＥＳＴ－ＳＳＲ　ｍａｒｋｅｒｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｓｔｕｄｙ　ｏｆ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ
ａｎｄ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｉｎ　ｂｒｅａｄ　ｗｈｅａｔ［Ｊ］．Ｍｏｌ　Ｇｅｎｅｔ　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２００３，２７０（４）：３１５－３２３．
［１４］　Ｋａｒａｇｙｏｚｏｖ　Ｌ，Ｋａｌｃｈｅｖａ　Ｉ　Ｄ，Ｃｈａｐｍａｎ　Ｖ　Ｍ．Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｒａｎｄｏｍ　ｓｍａｌ－ｉｎｓｅｒｔ　ｇｅｎｏｍｉｃ　ｌｉｂｒａｒｉｅｓ
ｈｉｇｈｌｙ　ｅｎｒｉｃｈｅｄ　ｆｏｒ　ｓｉｍｐｌｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｒｅｐｅａｔｓ［Ｊ］．Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ，１９９３，２１（１６）：３９１１－３９１２．
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ｊｕｍｐｉｎｇ　ｃｌｏｎｅｓ，ａｎｄ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ　ｆｏｒ　ｒｅｇｉｏｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｍａｒｋｅｒｓ［Ｊ］．Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ，
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Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｂｕｌｌｅｔｉｎ，１９８７，１９：１１－１５．
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［１９］　Ｓｉｎｇｈ　Ｖ　Ｋ，Ｍａｎｇａｌａｍ　Ａ　Ｋ，Ｄｗｉｖｅｄｉ　Ｓ，ｅｔ　ａｌ．Ｐｒｉｍｅｒ　ｐｒｅｍｉｅｒ：ｐｒｏｇｒａｍ　ｆｏｒ　ｄｅｓｉｇｎ　ｏｆ　ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ　ｐｒｉｍｅｒｓ
ｆｒｏｍ　ａ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ［Ｊ］．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９９８，２４（２）：３１８－３１９．
［２０］　Ｃｒｅｓｔｅ　Ｓ，Ｎｅｔｏ　Ａ　Ｔ，Ｆｉｇｕｅｉｒａ　Ａ．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｉｎｇｌｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｒｅｐｅａｔ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ　ｉｎ　ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ
ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｇｅｌｓ　ｂｙ　ｓｉｌｖｅｒ　ｓｔａｉｎｉｎｇ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　Ｒｅｐｏｒｔｅｒ，２００１，１９（４）：
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ｇｅｎｅｔｉｃ　ａｎａｌｙｓｉｓ，ｖｅｒｓｉｏｎ　１．３２［Ｚ］．Ｅｄｍｏｎｔｏｎ，Ａｌｂｅｒｔａ，Ｃａｎａｄａ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
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ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ［Ｊ］．Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１９８９，４４（３）：３８８－３９６．
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８４５ 复 旦 学 报（自然科学版）　 　 第５３卷
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Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ　Ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｉｔｅ　Ｍａｒｋｅｒｓ　ｆｒｏｍ
Ｈｉｐｐｏｐｈａｅ　ｔｉｂｅｔａｎａ　Ｕｓｉｎｇ　５’－Ａｎｃｈｏｒｅｄ　ＰＣＲ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄ
Ｍａｇｎｅｔｉｃ　Ｂｅａｄｓ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ
ＸＵ　Ｔｉｎｇ１，ＸＵ　Ｌｕ２，ＷＡＮＧ　Ｈａｏ１，ＬＨＡＧ　Ｃｈｏｎｇ３，ＳＵＮ　Ｋｕｎ２，ＺＨＡＮＧ　Ｗｅｎ－ｊｕ１
（１．Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｍｉｎｉｓｔｒｙ　ｏｆ　Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ　Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ
Ｅｃｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｓｃｈｏｏｌ　ｏｆ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆｕｄａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ　２００４３３，Ｃｈｉｎａ；
２．Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ　Ｎｏｒｍａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｌａｎｚｈｏｕ７３００７０，Ｃｈｉｎａ；
３．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｔｉｂｅｔ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｌｈａｓａ８５００００，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａｓ　ａ　ｋｉｎｄ　ｏｆ　ｃｏ－ｄｏｍｉｎａｎｔ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｍａｒｋｅｒｓ，ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｉｔｅｓ　ｃａｎ　ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ　ｒｅｆｌｅｃｔ　ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ　ｇｅｎｅｔｉｃ
ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ．Ｉｔ　ｈａｓ　ｂｅｅｎ　ｗｉｄｅｌｙ　ｕｓｅｄ　ｉｎ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｙｂｒｉｄｓ，ｓｐｅｃｉｅｓ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ
ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ　ｇｅｎｅｔｉｃｓ．Ｈｉｐｐｏｐｈａｅ　ｔｉｂｅｔａｎａｉｓ　ａｎ　ｉｄｅａｌ　ｍａｔｅｒｉａｌ　ｆｏｒ　ｓｔｕｄｙｉｎｇ　ａｄａｐｔｉｖｅ　ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ　ｏｆ　ｉｍｐｏｒｔａｎｔ　ｅｃｏｌｏｇｉｃａｌ
ｓｐｅｃｉｅｓ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　Ｑｉｎｇｈａｉ－Ｔｉｂｅｔａｎ　Ｐｌａｔｅａｕ．Ｈｏｗｅｖｅｒ，ｌｉｔｔｌｅ　ｉｓ　ｋｎｏｗｎ　ａｂｏｕｔ　ｉｔｓ　ｇｅｒｍｐｌａｓｍ　ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ　ａｎｄ　ｇｅｎｅｔｉｃ
ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．Ｈｅｒｅ，ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｉｔｅ　ｐｒｉｍｅｒｓ　ｆｏｒ　Ｈｉｐｐｏｐｈａｅ　ｔｉｂｅｔａｎａ　ｕｓｉｎｇ　５’ａｎｃｈｏｒｅｄ　ＰＣＲ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄ　ｍａｇｎｅｔｉｃ
ｂｅａｄｓ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　ｗｅｒｅ　ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ．Ｔｏｔａｌ　１３ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ　ｌｏｃｉ　ｗｅｒｅ　ｏｂｔａｉｎｅｄ，ｅａｃｈ　ｈａｖｉｎｇ　ｔｗｏ　ｔｏ　ｆｉｖｅ　ａｌｅｌｅｓ．
Ｏｂｓｅｒｖｅｄ　ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｓｉｔｙ（ＨＯ）ａｔ　ｔｈｅｓｅ　ｌｏｃｉ　ｒａｎｇｅｄ　ｆｒｏｍ　０．００ｔｏ　０．７４，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｅｘｐｅｃｔｅｄ　ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｓｉｔｙ（ＨＥ）ｆｒｏｍ
０．０４ｔｏ　０．５４．Ｔｈｅｓｅ　ｐｒｉｍｅｒｓ　ｃａｎ　ｂｅ　ｄｉｒｅｃｔｌｙ　ａｐｐｌｉｅｄ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｇｅｒｍｐｌａｓｍ　ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｇｅｎｅｔｉｃ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ
ｓｔｕｄｙ　ｏｆ　ｔｈｉｓ　ｓｐｅｃｉｅｓ　ａｎｄ　ｏｔｈｅｒ　ａｓｐｅｃｔｓ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｈｉｐｐｏｐｈａｅ　ｔｉｂｅｔａｎａ；ＳＳＲ；ｍａｇｎｅｔｉｃ　ｂｅａｄｓ　ｍｅｔｈｏｄ；５’
櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅
ａｎｃｈｏｒｅｄ　ＰＣＲ
（上接第５４２页）
Ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｏｎ　Ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ　Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ｏｆ　ＡＲＰ５ｉｎ
Ｓｔｏｍａｔａｌ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ
ＣＡＯ　Ｌｉｎ１，２，ＺＨＡＮＧ　Ｃｈｉ　１，２，ＡＮ　Ｚｅｎｇ－ｘｕａｎ１，２，ＺＨＵ　Ｙａｎ１，２
（１．Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｐｌａｎｔ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｃｈｏｏｌ　ｏｆ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｆｕｄａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ　２００４３３，Ｃｈｉｎａ；
２．Ｓｔａｔｅ　Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｆｕｄａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ　２００４３３，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｓｔｏｍａｔａ　ｉｓ　ｃｏｍｐｏｓｅｄ　ｏｆ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ　ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　ｃｅｌｓ　ｍｅｄｉａｔｉｎｇ　ｔｈｅ　ｇａｓ　ｅｘｃｈａｎｇｅ　ｂｅｔｗｅｅｎ
ｐｌａｎｔｓ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ，ａｎｄ　ｐｌａｙｓ　ｉｍｐｏｒｔａｎｔ　ｒｏｌｅｓ　ｉｎ　ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ　ａｄａｐｔｉｏｎ　ｄｕｒｉｎｇ　ｐｌａｎｔ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｉｔ　ｉｓ　ｗｅｌ
ｋｎｏｗｎ　ｔｈａｔ　ｓｔｏｍａｔａ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｉｓ　ｓｕｂｊｅｃｔｅｄ　ｔｏ　ｃｏｍｐｌｅｘ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ　ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ．Ｈｏｗｅｖｅｒ，ｔｈｅ　ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ
ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ｉｎ　ｓｔｏｍａｔａ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｉｓ　ｓｔｉｌ　ｎｏｔ　ｃｌｅａｒ．ＡＲＰ５ｉｓ　ａ　ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ　Ａｃｔｉｎ－ｒｅｌａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｉｎ
ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ，ａｎｄ　ｉｓ　ｉｎｖｏｌｖｅｄ　ｉｎ　ｃｈｒｏｍａｔｉｎ　ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ　ｉｎ　ｙｅａｓｔ　ａｎｄ　ｈｕｍａｎ　ｃｅｌｓ．Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｍｕｔａｎｔｓ　ｄｅｐｌｅｔｉｎｇ　ｏｆ
ＡＲＰ５　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｄｉｓｐｌａｙ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　ｓｔｏｍａｔａ　ｉｎ　ｌｅａｖｅｓ．ＲＴ－ＰＣＲ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｒｅｖｅａｌｅｄ　ｔｈａｔ　ｂＨＬＨ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ　ｇｅｎｅｓ
ＳＰＣＨａｎｄ　ＭＵＴＥ，ｗｈｉｃｈ　ｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙ　ｒｅｇｕｌａｔｅ　ｔｈｅ　ｓｔｏｍａｔａ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ａｒｅ　ｕｐ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ　ｉｎ　ａｒｐ５　ｍｕｔａｎｔｓ．Ｔｈｅ
ＡＲＰ５ｐｒｏｔｅｉｎ　ｃａｎ　ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｙ　ｂｉｎｄｓ　ｈｉｓｔｏｎｅ　ｖａｒｉａｎｔ　Ｈ２Ａ．ｚ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ．Ｍｏｒｅｏｖｅｒ，ｔｈｅ　ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｈ２Ａ．ｚ，ｂｕｔ　ｎｏｔ
ｈｉｓｔｏｎｅ　Ｈ３，ｗｉｔｈｉｎ　ｔｈｅ　ＳＰＣＨａｎｄ　ＭＵＴＥｃｈｒｏｍａｔｉｎ　ｒｅｇｉｏｎｓ　ｉｓ　ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｏｎ　ＡＲＰ５ａｃｔｉｖｉｔｙ，ｓｕｇｇｅｓｔｉｎｇ　ｔｈａｔ　ＡＲＰ５
ｌｉｋｅｌｙ　ｒｅｇｕｌａｔｅｓ　ＳＰＣＨａｎｄ　ＭＵＴＥｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｂｙ　ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ　ｌｏｃａｌ　Ｈ２Ａ．ｚ　ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｓｔｏｍａｔａ；ＡＲＰ５；Ｈ２Ａ．ｚ；ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ　ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ；ｂＨＬＨ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ
９４５
　第４期
许　汀等：基于５’锚定ＰＣＲ法和磁珠富集法的西藏沙棘多态性ＳＳＲ引物开发
魏巍等“一个水稻花发育特异性启动子的克隆与活性分析”一文图3.
图3 GUS报告基因在转基因水稻各组织的表达
Fig. 3 Expression of the GUS reporter gene invarious ti sues of transgenic rice plants
A•生长1周的根；B.水培2个月的根；C.幼嫩的茎；D.成熟的茎；E.生长1周的叶片；F.生长2个月的叶片；G.颖
花，长度分别为0�2、2�3、3�4、4�5、5�7_； H.花发育晚期颖花的纵截面；1.雌蕊和雄蕊；j.成熟花药.
许汀等“基于5’锚定PCR法和磁珠富集法的西藏沙棘多态性SSR引物开发”一文图1.
001 CAG CIGC TGC TG C G G T C GA C G A T T G G G G G G G| C T C T C 「C 丁 C T C T C|
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045 iTCTCTCTCTCTCTCTCTl CCTCGNTG AGCGTTCTC T C T C A A T C A C
A隱A碰MMAI#層AK t Ml \,|38SS y A ^t\J M
(a) HTP-07
0131 GT A G A 丁 A 丁A 0 丁 G A 丁 丁 G TIG A T G A T G A T G A T G A A G A A G A A G A A G A \ G 八丨
y\ a. 1A , M hi K
0177 |~A]A C C A GA G A A G C A C A A G T T A A A T C A A G G G C T T G T A G G T T A G A A T C
M ml yv
(b) HTP-34
图1 5’锚定PCR法(a)和磁珠富集法(b)分离的SSR位点部分测序峰图(重复序列用黑框标示出）
Fig. 1 Part of the sequencing chromatograms f SSR loci isolated using 5， anchored PCR methods
(a) and magnetic beads hybridization (b) (repeat sequences ar marked using black boxes)
李泳池等“抑制bril表型的ABJ突变体的筛选”一文图2.
abi2-8/bril-301 abi4-13lbril-301 bril-301
(a)abi2-8fbrU-30�和 abi4-I3/briJ-30�的表M
Col-0 bril-301 hab2-llbril-301 ab3-2Hbri 1-301
(b)hab2-�fbri!-30!和 abi3-2mri!-30J 的表型
图2四个双突变体的苗期表型
Fig. 2 The phenotypes of ourdouble mutants